本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，涉及一種利用單片段置換系聚合改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法，具體涉及一種利用野生稻單片段置換系聚合同步改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法。

背景技術(shù)：

高溫?zé)岷κ怯绊懭蛩井a(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一，也是中國稻作的主要自然災(zāi)害，主要發(fā)生在長江流域以南(熊振民，蔡洪法主編.中國水稻.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1992)。水稻高溫障礙具有發(fā)生突然、成災(zāi)面積大、常造成嚴重減產(chǎn)等特點(王志剛,王磊,林海,龐乾林,鄂志國,張玉屏,朱德峰.水稻高溫?zé)岷澳蜔嵝匝芯窟M展[j].中國稻米,2013,19(1):27–31)。全球熱帶地區(qū)水稻受到高溫潛在威脅的面積約有4.0×106hm²,我國長江流域也是水稻花期高溫危害的重災(zāi)區(qū),湖南、湖北、江西、江蘇、四川等地均有水稻高溫災(zāi)害的報道,受災(zāi)嚴重時不少品種大面積結(jié)實率降低到50％以下,損失慘重(汪壽康,汪更文,汪又佳.2003年水稻高溫?zé)岷η闆r的調(diào)查[j].安徽農(nóng)學(xué)通報,2004,10(1):27–35)。在水稻灌漿成熟期,因高溫縮短了灌漿成熟過程,秕粒增多,千粒重下降,形成高溫逼熟。因此,水稻耐高溫指標應(yīng)包括兩個方面:一方面以花粉在培養(yǎng)基上的萌發(fā)率、柱頭上的萌發(fā)率、結(jié)實率的下降為指標篩選孕穗期耐熱品種。國外從20世紀70年代開始就以高溫脅迫后結(jié)實率與常溫下結(jié)實率的比值為指標進行耐熱品種的篩選以及耐熱性的數(shù)量遺傳分析。另一方面以千粒重的下降為指標,篩選灌漿期耐熱材料。水稻不同生長期對高溫耐性不一樣,有的耐熱性狀qtl/基因在抽穗揚花期對高溫有較強的耐性,這一時期對結(jié)實率影響不大；有的耐熱性狀qtl/基因在灌漿期較耐高溫,這一時期對千粒重影響不大。因此,將這兩類耐熱性狀qtl/基因聚合到一個材料中是耐熱性水稻新種質(zhì)創(chuàng)造的目標之一。

應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法和分子標記輔助育種技術(shù)培育水稻耐熱品種是目前最有效和可行的控制高溫脅迫危害的方法。秈稻是栽培稻的一個亞種，主產(chǎn)區(qū)為長江中下游平原、四川盆地，江南各省，所以是遺傳研究和育種的主要對象，但是這些地區(qū)的雙季稻區(qū)的早稻抽穗揚花期經(jīng)常遇到連續(xù)高溫?zé)岷?，影響雜交早稻高產(chǎn)組合的產(chǎn)量和品質(zhì)。元江野生稻是長期生長在云南元江干熱河谷地區(qū)的普通野生稻，具備了適應(yīng)高溫干旱等惡劣自然環(huán)境的特性。因此元江野生稻是重要的耐熱及耐旱資源的重要來源。育種家們一直想通過種間雜交的方式把元江野生稻中耐熱的基因?qū)氲皆耘嗟局腥?，但是由于連鎖累贅和雜交后代不容易穩(wěn)定等原因限制了耐熱品種的培育。分子標記技術(shù)在提高水稻耐熱性育種中的應(yīng)用大大減少了育種過程中選擇的盲目性，快速實現(xiàn)外源優(yōu)良種質(zhì)向栽培品種滲透，拓寬了品種的遺傳基礎(chǔ)。國內(nèi)外研究人員對耐熱性進行了大量的qtl定位研究，有的已經(jīng)用于標記輔助選擇育種實踐。

單片段置換系(singlesegmentsubstitutionlines,sssl)是利用雜交，回交和分子標記輔助選擇(marker-assistedselection,mas)構(gòu)建的覆蓋作物整個基因組的一系列近等基因系。它的基因組內(nèi)只有來自供體親本的一個純合的染色體片段，而基因組的其余部分與輪回親本相同。它是進行基因組研究，特別是qtl定位和分子設(shè)計育種的理想材料。peleman等(pelemanj.d.andvandervoortj.r.，breedingbydesign[j].trendsplantsci，2003，8(7):330-334)提出了分子設(shè)計育種的新概念，包括定位相關(guān)性狀的qtl、評價這些位點的等位性變異和開展設(shè)計育種，有望突破水稻精確高效育種等方面的障礙。目前廣東省植物分子育種重點實驗室培育了1600多份水稻單片段置換系(xiz.y.,hef.h.,zengr.z.etal.developmentofawidepopulationofchromosomesinglesegmentsubstitutionlines(sssls)inthegeneticbackgroundofanelitecultivarinrice(oryzasatival)[j].genome,2006,49:476-484)，用這些材料鑒定了許多重要農(nóng)藝性狀的qtls及其等位基因(楊自鳳，朱海濤，劉自強，等.基于單片段置換系的水稻抽穗期qtl上位性研究[j].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014，35(6):24-28.)，并廣泛開展了分子設(shè)計育種(梁海福.基于單片段置換系的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻設(shè)計育種[d].廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用元江野生稻單片段置換系聚合同步改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種利用元江普通野生稻單片段置換系聚合改良水稻抽穗揚花期及灌漿期耐熱性的分子育種方法，包含如下步驟：

(1)以保藏號為cgmccno.12532的中秈兩系骨干恢復(fù)系9311為母本，保藏號為cgmccno.12534和cgmccno.12535的元江普通野生稻(荷花塘3號)單片段置換系yj07‐04‐06和yj01‐05‐03雜交得到的f1為親本，聚合雜交1代，回交3代，再自交3代獲得穩(wěn)定純合株系bc3f4，每代都是單穗收獲；

(2)分子標記輔助第一次選擇：種植bc1f1，應(yīng)用ctab法提取dna，采用所述的元江野生稻單片段置換系yj07‐04‐06對應(yīng)的分子標記引物對rm3394和rm6223(表1)進行pcr擴增，單片段置換系yj01‐05‐03對應(yīng)的分子標記引物對rm6515和rm8069(表1)進行pcr擴增，選擇同時含有上述4個來源于元江普通野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp，184bp，224bp和392bp的單株與輪回親本9311回交，種子按單株收獲；其中分子標記引物對rm3394正/反向序列為seqidno.1/seqidno.2，rm6223正/反向序列為seqidno.3/seqidno.4；rm6515正/反向序列為seqidno.5/seqidno.6；rm8069正/反向序列為seqidno.7/seqidno.8。

(3)分子標記輔助第二次選擇：種植bc2f1，每株提取dna后，再利用所述的分子標記引物對確定bc2f1單株的基因型，同時具有4個來源于上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株繼續(xù)與輪回親本9311回交。

(4)分子標記輔助第三次選擇：種植bc3f1，每株提取dna后，繼續(xù)利用所述的分子標記引物對確定bc3f1單株的基因型，同時具有4個來源于上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株自交，按單株收獲種子。

(5)分子標記輔助第四次選擇：種植bc3f2，每株提取dna后，繼續(xù)利用所述的分子標記引物對確定bc3f2單株的基因型，同時具有4個來源于上述野生稻的分子標記條帶，分子量分別是404bp(rm3394)；184bp(rm6223)；224bp(rm6515)和392bp(rm8069)的單株自交獲得bc3f3，按單株收獲種子。

所述的分子育種方法還包括步驟(6)：將步驟(5)篩選到的含純合基因型的bc3f3株系種在盆缽中，分別在抽穗后第0天移進人工氣候室處理5天結(jié)束后一直自然條件下正常生長，然后在抽穗后第10天繼續(xù)移進人工氣候室處理5天，結(jié)束后一直置于自然條件下正常生長，以結(jié)實率及千粒重下降分別評價抽穗揚花期及灌漿期耐熱性，篩選獲得抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著改良的育成新品系。

有益效果：

本發(fā)明所提供的一種利用元江野生稻單片段置換系改良中秈兩系骨干恢復(fù)系抽穗揚花期耐熱性的分子育種方法，與傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)存在雜交工作量大、選擇可靠性差、育種周期長的缺陷。通過分子標記輔助選擇目標性狀，可在3～4年內(nèi)快速高效培育出抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著增強的中秈兩系骨干恢復(fù)系。本發(fā)明以元江野生稻單片段導(dǎo)入系yj07‐04‐06、yj01‐05‐03和中秈兩系骨干恢復(fù)系9311為材料，通過分子標記輔助選擇獲得了抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著提高的新品系“元野3號”，“元野3號”在抽穗揚花期模擬高溫脅迫下結(jié)實率比對照9311提高18.4％，單株產(chǎn)量為25.02g，比輪回親本增加8.72g。在灌漿期模擬高溫脅迫下千粒重比對照9311提高1.2g，單株產(chǎn)量為36.2g，比輪回親本增加3.1g。

附圖說明

圖1分子標記輔助選擇抽穗揚花期及灌漿期耐熱性顯著優(yōu)于輪回親本的新品系。

圖29311背景中目標區(qū)間不同基因型高溫脅迫下結(jié)實率表現(xiàn)(2014‐2015)。

圖39311背景中目標區(qū)間不同基因型高溫脅迫下千粒重表現(xiàn)(2014‐2015)。

生物材料保藏證明

yj07‐04‐06為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12534；

yj01-05-03為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12535；

9311為秈稻(oryzasativaindica.)，2016年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為cgmccno.12532。

具體實施方式

實施例1選擇親本

江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國家工程實驗室(南昌)超級水稻研究發(fā)展中心以蜀恢527為輪回親本，以元江野生稻(荷花塘3號)為供體親本，在回交5代自交3代結(jié)合覆蓋全基因組的ssr分子標記輔助選擇，培育了一套蜀恢527為背景的元江普通野生稻單片段置換系112個，其基因組的覆蓋率達73.5％。2010年，于水稻抽穗后第1天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設(shè)3個重復(fù),常規(guī)水肥管理。設(shè)定相對濕度為85％,光照12h/d,恒溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理后,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調(diào)查結(jié)實率,各個處理均設(shè)對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),以結(jié)實率下降為指標評價抽穗揚花期耐熱性。篩選出抽穗揚花期耐熱性顯著提高的導(dǎo)入系11個，其中包括導(dǎo)入系yj07‐04‐06，在模擬高溫脅迫情況下，結(jié)實率比對照提高13.4％。2010年，于水稻抽穗后第10天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設(shè)3個重復(fù),常規(guī)水肥管理。設(shè)定相對濕度為85％,光照12h/d,恒溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理后,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調(diào)查千粒重,各個處理均設(shè)對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),以千粒重下降為指標評價灌漿期耐熱性。篩選出灌漿期耐熱性顯著提高的導(dǎo)入系13個，其中包括導(dǎo)入系yj01-05-03，在模擬高溫脅迫情況下，千粒重比對照提高13.4％。

導(dǎo)入系yj07‐04‐06和yj01-05-03為栽培秈稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號分別為cgmccno.12534和cgmccno.12535；9311為栽培秈稻(oryzasativaindica)，2016年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號分別為cgmccno12532。

實施例2

(1)2011年夏季在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南昌試驗站分別種植yj07‐04‐06和9311各一行，9311(cgmccno.12532)為母本，yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和yj01-05-03(cgmccno.12535)雜交得到的f1為父本配制雜交組合產(chǎn)生f1，成熟后全部混收。2011年冬季在海南三亞種植3行f1，回交獲得bc1f1，成熟后全部混收。田間管理按常規(guī)方法進行。

(2)分子標記輔助選擇：2012年夏季在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南昌試驗站種植50行bc2f1，每行8株，每株采集葉片放入2ml的eppendorf管中，裝人小鋼珠，利用高通量組織研磨儀高速震蕩研磨之后加入1.25％的sds提取液600μl，應(yīng)用sds法提取dna，采用yj07‐04‐06(cgmccno.12534)和9311(cgmccno.12532)導(dǎo)入片段上的分子標記(表1)進行pcr擴增，擴增體系10μl，dna模板1μl，94℃預(yù)變性5min，94℃變性0.5min，57℃復(fù)性0.5min，72℃延伸1min，32個循環(huán)后，72℃再延伸10min，擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：凝膠濃度為8％，電泳緩沖液為0.5倍tbe，175v恒壓電泳1.5小時。選擇含有4個分子標記的10個單株繼續(xù)回交獲得bc3f1種子。

(3)2012年冬季在海南三亞將bc3f1種植10行，每行8株，每株采集葉片，提取dna后，利用表1提供的分子標記確定bc3f1單株的基因型，選擇4個標記都含有的單株繼續(xù)自交得到bc3f2(同時具有表1中來源于上述野生稻的4個分子標記條帶)。

表1yj07‐04‐06和yj01-05-03導(dǎo)入片段的ssr分子標記

(4)2013年冬季在海南三亞將bc3f2種植40行，每行8株，每株采集葉片，提取dna后，利用表1提供的分子標記確定bc3f2單株的基因型，選擇4個標記純合的單株自交得到bc3f3(同時具有表1中來源于上述野生稻的4個分子標記條帶)。

(5)人工氣候室模擬高溫脅迫鑒定：2014‐2015年，將純合的bc3f4及bc3f5株系于抽穗后第1天,選取生長一致的植株裝入盆缽,移入人工氣候室。每盆栽3株,每份材料設(shè)3個重復(fù),常規(guī)水肥管理。設(shè)定相對濕度為80％,光照11h/d,恒溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理5d,處理后,將試驗材料移到常溫下進行正常生長。然后于抽穗后10天繼續(xù)移入人工氣候室進行高溫脅迫處理5天。處理后,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。每盆栽3株,每份材料設(shè)3個重復(fù),常規(guī)水肥管理。設(shè)定相對濕度為80％,光照11h/d,恒溫38.0℃(白天)/28℃(夜晚)。處理后,將試驗材料移到常溫下,直至成熟。調(diào)查結(jié)實率及千粒重,及其他重要農(nóng)藝性狀，各個處理均設(shè)對照(對照為田間正常生長條件下各試驗材料),分別以結(jié)實率和千粒重下降為指標評價抽穗揚花期和灌漿期的耐熱性。

通過方差分析，經(jīng)過兩個世代以上鑒定的純系中選擇在人工氣候室中揚花期及灌漿期人工模擬高溫脅迫情況下結(jié)實率及千粒重顯著高于輪回親本的株系，即為育成品系“元野3號”。

由于本發(fā)明選擇的耐熱株系背景親本為9311，其為中秈兩系骨干恢復(fù)系代表性品系，因此通過該分子育種方法選育的“元野3號”品系顯著特點是配合力高，具有抽穗揚花期及灌漿期耐熱顯著提高的特點。

注:rm編號的引物來自利用temnykh等(2000)和mccouch等(2002)公布的ssr引物序列合成的ssr標記(temnykhs,parkwd,ayresn,etal.mappingandgenomeorganizationofmicrosatellitesequencesinrice(oryzasatival.).theoreticalandappliedgenetics,2000,100(5):697-712；mccouchsr,teytelmanl,xuy,etal.developmentandmappingof2240newssrmarkersforrice(oryzasatival.).dnaresearch,2002,9(6):199-207.)。