本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，具體涉及單獨(dú)或組合用于治療和/或預(yù)防炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面如自身免疫性疾病(風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風(fēng)、移植免疫排斥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。更具體涉及新的一系列下式所示的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物及其制備方法和藥物學(xué)上可接受的鹽或藥物學(xué)上可接受的溶劑化物。
背景技術(shù)：
：炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)各種炎性刺激引起組織損害而產(chǎn)生的一種基本病理過(guò)程，也是機(jī)體對(duì)損傷或感染產(chǎn)生的一種重要的防御反應(yīng)，可幫助機(jī)體清除有害物質(zhì)，將損傷局限化，啟動(dòng)愈合過(guò)程對(duì)組織進(jìn)行修復(fù)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。但過(guò)度和持久的炎癥反應(yīng)，使抗炎和促炎反應(yīng)失衡，反而加重組織細(xì)胞損傷，最終可引起器官功能障礙。炎癥反應(yīng)是一種常見(jiàn)和多發(fā)的病理過(guò)程，多種疾病均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，如感染性疾病、自身免疫性疾病、痛風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等，尤其感染性疾病導(dǎo)致的膿毒血癥和自身免疫性疾病中的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等均為炎癥反應(yīng)的過(guò)度活化或持久存在。因此，抗炎藥物也是臨床治療中僅次于抗感染藥物的第二大類(lèi)藥物。尤其在抗類(lèi)風(fēng)濕藥物市場(chǎng)，evaluatepharma公司報(bào)道抗風(fēng)濕藥物按銷(xiāo)售額已排在第二大治療領(lǐng)域，全球收入在2013年即達(dá)到411億美元，且在未來(lái)5年仍將保持強(qiáng)勁增長(zhǎng)。據(jù)估計(jì)，1986年全球非甾體抗炎藥處方量已達(dá)1億張，非處方用藥更為普遍，且有逐年增加趨勢(shì)，僅塞來(lái)昔布2013年銷(xiāo)售就達(dá)27億美元。而甾體類(lèi)抗炎藥糖皮質(zhì)激素類(lèi)在我國(guó)醫(yī)院門(mén)診處方使用率雖各家報(bào)道不一，但均在12％以上；有研究也報(bào)道某醫(yī)院2014年4月住院患者糖皮質(zhì)激素應(yīng)用病歷占該月總出院病歷數(shù)的21.8％。但這兩類(lèi)藥物都有其相應(yīng)的各種不良反應(yīng)。甾體類(lèi)抗炎藥對(duì)機(jī)體作用復(fù)雜，在產(chǎn)生強(qiáng)大抗炎作用的同時(shí)會(huì)造成機(jī)體防御功能的下降，誘發(fā)或加重感染，長(zhǎng)期使用可引起人體物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂、誘發(fā)加重消化性潰瘍、引起骨質(zhì)疏松等，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。非甾體類(lèi)抗炎藥亦有胃腸道損傷出血、肝腎功能損傷、心血管不良事件發(fā)生率增加等不良反應(yīng)。因此，尋找抗炎作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小的抗炎新藥成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年推出的治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的生物制劑如humira(阿達(dá)木單抗)、enbrel(依那西普)等已成為全球最暢銷(xiāo)藥物，在取得顯著臨床療效的同時(shí)，也獲得較大的利潤(rùn)，如humira2015年銷(xiāo)售額達(dá)140億美元，但該類(lèi)藥物價(jià)格昂貴(humira在美國(guó)賣(mài)1840美元/支(40mg)，國(guó)內(nèi)最高零售價(jià)為7900元/支，每2周注射1支)對(duì)醫(yī)保和患者均是較重的負(fù)擔(dān)。而近年輝瑞推出的首個(gè)治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的口服JAK抑制劑xeljanz(托法替尼)，在2015年的9個(gè)月中銷(xiāo)售即達(dá)3.51億美元，但該藥在價(jià)格上也依然昂貴，在美國(guó)的價(jià)格為3374美元/月(5mg/片，每日2次)。我們研究發(fā)現(xiàn)金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物可以用于炎癥反應(yīng)，作用機(jī)制可能涉及多個(gè)靶點(diǎn)，我們研究顯示金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物可顯著抑制培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和產(chǎn)生炎癥因子；同時(shí)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷有明顯保護(hù)作用使炎癥反應(yīng)減輕，損傷減輕；也使佛氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)損傷減輕、大鼠棉球肉芽腫重量減輕、小鼠二甲苯致炎耳廓腫脹度減輕。而且，毒性試驗(yàn)顯示在有效劑量40倍劑量時(shí)未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)死亡和器官損傷。以上結(jié)果說(shuō)明我們發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物有顯著的抗炎作用，且毒性低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是下式所示的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物及其制備與抗炎作用、免疫抑制作用及在炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面的治療應(yīng)用如自身免疫性疾病(風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風(fēng)、移植免疫排斥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。在上式結(jié)構(gòu)中，其中A可取代在金剛烷環(huán)的2、3、4位上，A可以為H，X(F、Cl、Br、I)，OH，OR，NH2，NHR，NR2，CHO，COR，COOH，COOR，CONH2，CONHR，CONR2，COOCOR等常用有機(jī)基團(tuán)；B可以是H，R，Ar等常用有機(jī)基團(tuán)；C可以是R，Ar等常用有機(jī)基團(tuán)。進(jìn)一步，A具體可以是OH，NH2，COR，COOH，CONH2等，B具體可以是(CH2)nCONH2，(CH2)nCONHR，(CH2)nCONR2等(n為1，2，3，4等)，C具體可以是Me，Et，n-Pr，i-Pr，n-Bu，i-Bu，s-Bu，t-Bu，Ph，Bn等。更進(jìn)一步，A更具體是OH，NH2，COOH等，B更具體是CH2CONH2，CH2CONHR，CH2CONR2等，C更具體是Me，Et，Ph等。一個(gè)具體的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物實(shí)例CQMUH-011可描述為，但并不是局限于該實(shí)例，其中A取代在金剛烷環(huán)的3位上，A是OH，B是C是關(guān)于金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物的制備方法，應(yīng)該是本專業(yè)技術(shù)人員所具有的專業(yè)知識(shí)能夠完成的。這里提出一個(gè)制備方法實(shí)例，但并不是局限于該實(shí)例。以鹽酸金剛烷胺為起始原料，用混酸及氫氧化鉀為試劑，對(duì)金剛烷胺環(huán)的3位進(jìn)行羥基化，得到金剛烷氨醇；金剛烷氨醇再與鹵代B反應(yīng)，制備得到氨基B取代的金剛烷氨醇，然后繼續(xù)與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)，制備得到目標(biāo)金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物。以及本專業(yè)技術(shù)人員所具有的專業(yè)知識(shí)能夠完成的其它相應(yīng)的可替代的制備方法。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)上述的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物可以用于炎癥反應(yīng)，作用機(jī)制可能涉及多個(gè)靶點(diǎn)，本發(fā)明研究顯示金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物可顯著抑制培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和產(chǎn)生炎癥因子；同時(shí)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷有明顯保護(hù)作用使炎癥反應(yīng)減輕，損傷減輕；也使佛氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)損傷減輕、大鼠棉球肉芽腫重量減輕、小鼠二甲苯致炎耳廓腫脹度減輕。而且，毒性試驗(yàn)顯示在有效劑量40倍劑量時(shí)未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)死亡和器官損傷。以上結(jié)果說(shuō)明我們發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物有顯著的抗炎作用，且毒性低。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物具有抗炎作用、免疫抑制作用及在炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面的治療用途如自身免疫性疾病(風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風(fēng)、移植免疫排斥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的，在于提供一種藥物及其組合物其特征在于，含有有效量的上述金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑等制成的各種劑型及其組合物。附圖說(shuō)明圖1是CQMUH-011對(duì)LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響圖(CQMUH-011作用48h的IC50值為：1.305×10-8mol/L-1)圖2是不同濃度CQMUH-011對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7增值的影響圖圖3是不同濃度CQMUH-011對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNF-α和IL-1β的影響圖圖4是CQMUH011對(duì)LPS致肺損傷肺組織病理變化的影響圖(HE染色，×200倍)(A：Normal組，B：LPS組，C：DXM+LPS組，D：CQMUH-011+LPS組)圖5是CQMUH-011對(duì)LPS致肺損傷小鼠肺的濕/干比重的影響圖圖6是CQMUH-011對(duì)LPS致肺損傷小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響圖圖7是CQMUH-011對(duì)LPS致肺損傷小鼠肺組織中MDA含量和MPO活力的影響圖圖8是CQMUH011對(duì)弗氏佐劑致關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響圖(HE染色，×40倍)(A：Normal組；B：AAModel組；C：DXM+Model組；D：CQMUH-011+Model組)圖9是CQMUH-011對(duì)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度的影響圖圖10是CQMUH-011對(duì)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度的影響(14d)圖(A：Normal組；B：AAModel組；C：DXM+Model組；D：CQMUH-011+Model組)圖11是CQMUH-011對(duì)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響圖圖12是CQMUH-011對(duì)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中MDA含量和MPO活力的影響圖圖13是CQMUH-011對(duì)大鼠棉球肉芽腫干重的影響圖圖14是CQMUH-011對(duì)棉球肉芽腫大鼠血清中NO和MDA及MPO的影響圖圖15是CQMUH-011對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響圖具體實(shí)施方式通過(guò)下列的具體實(shí)施例可進(jìn)一步理解本發(fā)明，但它們不構(gòu)成對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容的限制。在本發(fā)明的上述前提下對(duì)本發(fā)明屬于本專業(yè)技術(shù)人員的專業(yè)知識(shí)可獲得的延伸擴(kuò)展內(nèi)容應(yīng)該都在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍中。實(shí)施例1金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物CQMUH-011的合成：38ml的98％濃硫酸與4ml的65％濃硝酸在冰浴下混合冷卻，向該混酸中分次加入3.75克鹽酸金剛烷胺，冰浴下攪拌反應(yīng)3小時(shí)；加入碎冰60克，攪拌0.5小時(shí)；再加入氫氧化鉀固體，調(diào)節(jié)pH至12-13，冰浴下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；抽濾，濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8-9，濃縮至干；加入80ml無(wú)水乙醇回流1小時(shí)，放冷，抽濾，濾液濃縮至干；再加入10ml混合液(丙酮∶乙酸乙酯＝3∶1)回流1小時(shí)，冰浴下放置，得3-氨基金剛烷醇固體3克，熔點(diǎn)大于256℃。將3克3-氨基金剛烷醇、0.25克碘化鉀、10克碳酸鉀加入到30ml四氫呋喃中攪拌升溫至40℃，保持該溫度下緩慢滴加3克N-氯乙酰基-2-氰基四氫吡咯(即氯代B)溶解在30ml四氫呋喃的溶液，約1.5小時(shí)滴完。滴畢，保溫40℃反應(yīng)1小時(shí)后，升溫至回流反應(yīng)2小時(shí)。回流結(jié)束，趁熱過(guò)濾，濾餅用少量四氫呋喃洗滌，合并濾液，濃縮至油狀物。油狀物加入適量丁酮溶解，放置析晶，過(guò)濾，干燥得氨基B取代的金剛烷氨醇固體4克，熔點(diǎn)147-149℃。HPLC歸一化法測(cè)定純度為98.1％，IR、NMR等結(jié)構(gòu)表征符合要求的結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)瓶中加入1克上述氨基B取代的金剛烷氨醇、適量對(duì)甲苯磺酰氯、適量吡啶和20ml四氫呋喃，攪拌并且慢慢升溫至回流，反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)完后，向反應(yīng)液中加入20ml5％的碳酸鈉溶液，再加入40ml乙酸乙酯，倒入分液漏斗中，收集有機(jī)層。水層再用50ml的乙酸乙酯分兩次萃取。合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，干燥完后旋蒸除去有機(jī)溶劑得白色固體粗品。用柱層析純化，再用丙酮重結(jié)晶得到金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物CQMUH-011固體，熔點(diǎn)192-195℃。HPLC歸一化法測(cè)定純度為95.1％，IR、NMR等結(jié)構(gòu)表征符合要求的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物CQMUH-011的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RAW264.7中加入不同濃度的CQMUH-011，觀察LPS刺激后CQMUH-011對(duì)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖和炎癥因子產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示CQMUH-011對(duì)LPS刺激引起的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖、炎癥因子產(chǎn)生有明顯抑制作用(見(jiàn)圖1.圖2.圖3.表1)表1.CQMUH-011對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β產(chǎn)生的影響TNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)空白組93.2±3.6129.5±4.1LPS組(10μg·ml-1)1154.32±40.8＊1271.8±36.1＊藥物組(1×10-6mol/L)450.2±21.8#346.2±21.8#(3×10-7mol/L)451.3±26.1#379.2±22.3#(1×10-7mol/L)478.3±30.8#406.3±33.2#(3×10-8mol/L)491.3±34.3#409.3±31.9#(1×10-8mol/L)512.7±34.1#412.3±31.1#實(shí)施例3金剛烷磺酰胺類(lèi)化合物CQMUH-011的體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)一、CQMUH-011對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的保護(hù)作用目的：評(píng)價(jià)CQMUH-011對(duì)膿毒癥的抑制作用。給藥方案與實(shí)驗(yàn)步驟：取Balb/c雄性小鼠，稱重并編號(hào)。隨機(jī)分為正常組、脂多糖(LPS)組、地塞米松(DXM)+LPS組和CQMUH-011+LPS組，每組10只小鼠。LPS組小鼠腹腔注射LPS(20mg/kg)，正常組小鼠腹腔注射給予等劑量的生理鹽水，各組小鼠均于建模前2小時(shí)分別給予生理鹽水、生理鹽水、地塞米松溶液(1.5mg/kg)、新藥CQMUH-011溶液(457μg/kg)(所有溶液均含有4％1，2-丙二醇)。于建模后6小時(shí)各組選一半的小鼠摘眼球取血，分離血清(3000r，4℃，離心10min)，按試劑盒操作測(cè)TNF-α和IL-6值；剩下的小鼠12小時(shí)后摘眼球取血，并將其部分右肺切取下來(lái)用4％多聚甲醛固定，剩下的右肺進(jìn)行肺濕干重檢測(cè)，部分左肺用冷生理鹽水勻漿用于丙二醛(MDA)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)，剩下的左肺保存于-80℃?zhèn)溆谩?.組織觀察：4％多聚甲醛固定的標(biāo)本用石蠟包埋，切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。2.肺的W/D值測(cè)定：取小鼠剩下的右肺，用吸水紙輕輕吸干表面液體并用萬(wàn)分之一天平稱重，記錄各樣本讀數(shù)。然后用錫箔紙包裹，于60℃干燥箱中干燥72h，取出再次稱重，并記錄。計(jì)算肺組織干濕重的變化比率作為評(píng)價(jià)肺水腫程度的指標(biāo)。3.炎癥因子檢測(cè)：分離的血清用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)進(jìn)行TNF-α及IL-6水平測(cè)定。具體操作方法如下：(1)從冰箱中取出試劑盒，室溫平衡20min后從鋁箔袋中取出所需板條，其余放回自封袋4℃保存。(2)向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣品孔中加入樣品10μL及樣品稀釋液40μL。(3)標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔加入HRP標(biāo)記的抗體100μL，封住反應(yīng)孔，37℃孵育60min。(4)棄去液體，洗板5次。(5)加入底物A和B各50μL，37℃避光孵育15min。(6)加入終止液50μL，15min內(nèi)于450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。由OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到相應(yīng)炎癥因子濃度。4.MDA含量測(cè)定：將10％組織勻漿離心取上清液，然后參照相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行測(cè)定，最后根據(jù)試劑盒計(jì)算方法算出。具體操作如下：(1)肺組織勻漿液蛋白含量測(cè)定，按照說(shuō)明書(shū)操作，步驟如下：將該上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1％組織勻漿，待測(cè)。表2肺組織蛋白測(cè)定操作流程肺組織勻漿上清液蛋白含量的計(jì)算公式：蛋白質(zhì)含量(μg/ml)＝(測(cè)定管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(563μg/ml)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)(2)肺組織勻漿液中MDA含量的檢測(cè)，按照MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，步驟如下：工作液I的配置：試劑一∶試劑二應(yīng)用液∶試劑三應(yīng)用液＝a∶3∶1，按需配制，配好后當(dāng)天使用。工作液I的配置：試劑一∶試劑二應(yīng)用液∶試劑三應(yīng)用液＝a∶3∶1，按需配制，配好后當(dāng)天使用。表3.肺組織MDA測(cè)定操作流程空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管對(duì)照管10nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品(ml)a無(wú)水乙醇(ml)a測(cè)定樣品(ml)aa工作液I(ml)4.0ml4.0ml4.0ml工作液II(ml)4.0ml漩渦混勻器混勻，95℃水浴40分鐘，取出后流水冷卻，3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液，532nm處，測(cè)各管吸光度值。肺組織勻漿上清液MDA含量計(jì)算公式：MDA含量(nmol/mgprot)＝(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/ml)/樣本蛋白含量(mgprot/ml)5.MPO活性檢測(cè)：取未離心的10％肺組織勻漿液，按1∶1的比例加入試劑二，混勻后得到5％的肺組織勻漿。將5％的肺組織勻漿液與三號(hào)試劑按9∶1比例充分混勻，37℃水浴中水浴15min，取出后按說(shuō)明書(shū)操作，步驟如下：表4.肺組織MPO測(cè)定操作流程MPO活力(U/g組織)＝(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/11.3×取樣量(g)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CQMUH-011能明顯減輕LPS所致的小鼠肺損傷，降低肺濕/干比重，使小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6，小鼠肺組織中MDA含量和MPO活力均降低(見(jiàn)圖4，圖5，圖6，圖7)，新藥CQMUH-O11對(duì)LPS所致(膿毒癥)小鼠的急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用。二、CQMUH-011對(duì)弗氏完全佐劑所致大鼠關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用目的：評(píng)價(jià)CQMUH-011對(duì)免疫性炎癥的保護(hù)作用。給藥方案與實(shí)驗(yàn)方法：選用體重180±20g雄性SD大鼠，隨機(jī)分組，分別為正常組、AA模型組、地塞米松+AA組及CQMUH-011(300μg/kg)+AA組，除正常組外，其他各組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1mlFCA致炎。于致炎前2小時(shí)，每組給予相應(yīng)藥物，即正常組和AA模型組給予生理鹽水，地塞米松+AA組給予地塞米松溶液，CQMUH-011+AA組給予CQMUH-011溶液(所有溶液均含有4％1，2-丙二醇)。致炎后18小時(shí)，測(cè)量各組大鼠右后足腫脹度及體重變化；致炎一周后開(kāi)始給藥，連續(xù)7天，觀察各組大鼠右后足腫脹度及體重變化；致炎21天后再次給藥，連續(xù)7天，觀察各組大鼠右后足腫脹度及體重變化。致炎28天后，大鼠行摘眼球手術(shù)取血獲取血清進(jìn)行炎癥因子檢測(cè)并取下其右后足踝關(guān)節(jié)于10％多聚甲醛中固定。1.踝關(guān)節(jié)病理切片觀察：10％多聚甲醛固定的標(biāo)本用8％硝酸脫鈣后，經(jīng)石蠟包埋，切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。2.大鼠右后足腫脹度測(cè)定：于致炎前、致炎后18h、7d、14d、21d及28d用皮尺測(cè)量每只大鼠右后足同一部位的圍度。3.大鼠血清中TNF-α和IL-6測(cè)定：分別用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)，具體操作步驟如下(1)準(zhǔn)備工作：將試劑盒放置室溫，多余酶標(biāo)條放回冰箱。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒以助溶解，其濃度為200pg/mL(貯液)。先將其稀釋為100pg/mL(標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度)后，再準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入500μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次倍比稀釋成100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL、1.56pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)作為空白孔。備用。(2)樣本檢測(cè)：1)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(如上所示)。空白孔加100μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測(cè)樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2小時(shí)。2)棄去液體，甩干，不用洗滌。3)每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時(shí)。4)棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，甩干酶標(biāo)板內(nèi)的液體，墊上吸水紙用力拍打幾下，重復(fù)洗滌3次。最后一次洗滌后要將孔內(nèi)液體完全甩干。5)每孔加檢測(cè)溶液B工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育30分鐘。6)棄去液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。7)每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃避光顯色(反應(yīng)時(shí)間15-25分鐘)。8)每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度。由OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到相應(yīng)炎癥因子濃度。4.大鼠血清中MDA含量測(cè)定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第一部分。5.大鼠血清中MPO活力測(cè)定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作如下取大鼠血清按1∶1的比例加入試劑二，充分混勻?；靹蚝笕芤号c三號(hào)試劑按9∶1比例加入并充分混勻，37℃水浴中水浴15min，取出后按說(shuō)明書(shū)操作，步驟如下：表5.大鼠血清中MPO活力測(cè)定操作步驟MPO活力(U/L)＝(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/11.3×取樣量(L)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CQMUH-011對(duì)弗氏佐劑所致大鼠關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理?yè)p傷有保護(hù)作用，降低關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度、血清中炎癥因子(TNF-α和IL-6)和MDA水平及MPO活性(見(jiàn)圖8，圖9，圖10，圖11)，新藥CQMUH-011對(duì)免疫性關(guān)節(jié)炎具有抑制(治療)作用。三、CQMUH-011對(duì)大鼠棉球肉芽腫的抑制作用目的：評(píng)價(jià)CQMUH-011對(duì)亞急性炎癥的抑制作用給藥方案及實(shí)驗(yàn)方法：選用體重150±10g雄性SD大鼠，稱重并編號(hào)，隨機(jī)分組，分別為正常組、模型組、地塞米松組及CQMUH-011(300μg/kg)組。除正常組外，其他各組大鼠在麻醉狀態(tài)下，在其左、右蹊部各剪一小口，以血管鉗擴(kuò)充皮下組織，每側(cè)埋入一滅菌棉球(重量10±1mg)，而后縫合。于術(shù)前2小時(shí)給藥，即正常組和模型組給予生理鹽水，地塞米松組給予地塞米松溶液，CQMUH-011組給予該新藥溶液(所有藥品均含有4％1，2-丙二醇)；之后每天給藥一次，連續(xù)7天，第8天處死動(dòng)物，獲取全血，分離血清(3000r，4℃，離心10min)，并取出棉球，剔盡脂肪組織，待用。1.大鼠棉球肉芽腫重量測(cè)定：將取得的棉球用錫箔紙包裹，于60℃烘箱箱中干燥48h，取出干棉球稱重，減去棉球本身重量，即為肉芽腫重量，并以mg/100g體重表示。2.大鼠血清中NO測(cè)定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作如下(1)取出試劑盒，使GriessReagentI和GriessReagentII恢復(fù)至室溫。(2)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品制備：用生理鹽水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成9個(gè)濃度，分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100μM。(3)按50μl/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品。(4)按50μl/孔，在各孔中加入室溫GriessReagentI。(5)按50μl/孔，在各孔中加入室溫GriessReagentII。(6)540nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。由吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到NO濃度。3.大鼠血清中MDA含量測(cè)定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第一部分。4.大鼠血清中MPO活力測(cè)定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第二部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CQMUH-011可明顯降低大鼠棉球肉芽腫干重，降低肉芽腫大鼠血清中NO和MDA水平及MPO的活性(見(jiàn)圖12，圖13)，新藥CQMUH-011對(duì)亞急性炎癥具有一定的抑制作用。四、CQMUH-011對(duì)小鼠耳二甲苯致炎的保護(hù)作用目的：評(píng)價(jià)CQMUH-011對(duì)急性炎癥的抑制作用給藥方案及實(shí)驗(yàn)方法：取體重25g左右雄性小鼠，隨機(jī)分組，分別為正常組、模型組、地塞米松組及CQMUH-011(457μg/kg)組，每組10只，除正常組外，其他各組均滴二甲苯0.03～0.05ml于鼠右耳，左耳不作處理。于致炎前2小時(shí)每組分別給予相應(yīng)藥物，即正常組和模型組給予生理鹽水，地塞米松組給予地塞米松溶液，CQMUH-011組給予該新藥溶液。致炎2小時(shí)后，將小鼠處死，沿耳廊基線剪下兩耳，用直徑5mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓形耳片，稱重，求左、右耳片重量之差，作為腫脹度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CQMUH-011可明顯降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹，使耳腫脹度降低(見(jiàn)圖14)。新藥CQMUH-011對(duì)急性炎癥具有一定的抑制作用。五、急性毒性實(shí)驗(yàn)給予小鼠治療劑量(小鼠457μg/kg)的10倍(4570μg/kg)、20倍(9142μg/kg)、40倍劑量(18284μg/kg)的CQMUH-011腹腔注射，觀察2周，僅用藥40倍的小鼠在用藥后2小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)嗜睡，后恢復(fù)正常。全部小鼠2周內(nèi)無(wú)死亡，精神活動(dòng)正常，病理解剖各器官無(wú)異常。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3