本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種新的核酸適配體篩選方法，特別是一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法。

背景技術(shù)：

在2004年，全球估計(jì)有3590至4430萬(wàn)人與人類免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640萬(wàn)人屬于新發(fā)感染病例，另外，有280至350萬(wàn)人死于艾滋病。這些數(shù)字并在不斷增長(zhǎng)中，其中，東亞、東歐、中亞等地區(qū)漲幅最快。HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。DNA適配體相比于抗體/抗原檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)DNA適配體更穩(wěn)定，不易降解，可長(zhǎng)期保存；(2)與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)，甚至強(qiáng)于天然配基；(3)篩選周期較短，一般僅需1-2個(gè)月；(4)無(wú)免疫原性；(5)變性，復(fù)性速度較快，可反復(fù)使用，以及在室溫下運(yùn)輸，保存；(6)相對(duì)于抗體，寡核苷酸適配體不具有效應(yīng)器功能；(7)靈敏度高，可進(jìn)行化學(xué)修飾，成本低等優(yōu)點(diǎn)。而目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)HIV方法用的是ELISA、免疫共沉淀法等方法，靈敏度低，成本高。因此提高靈敏度、降低檢測(cè)成本具有重要的意義。

核酸適配體在早期檢測(cè)中能檢測(cè)到pmol數(shù)量級(jí)的物質(zhì)，所以對(duì)早期檢測(cè)具有重要意義。核酸適配體無(wú)免疫原性，易于修飾，變性、復(fù)性速度較快，可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，為早期檢測(cè)提供一種高靈敏度、低成本的檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)已有文獻(xiàn)表明已有篩選HIV P24抗原核酸適配體的研究，但結(jié)果均是未篩選出目標(biāo)適配體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種高效、快速篩選獲得HIV P24抗原核酸適配體的方法，以及提供一種早期檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法，其特征在于：以羧基化瓊脂磁珠為介質(zhì)，進(jìn)行6輪篩選，選出HIV P24抗原的高特異性核酸適配體。

所述6輪篩選是用兩輪正篩和四輪反篩篩選得到HIV P24抗原的高特異性核酸適配體。

所述高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法包括以下步驟：

(1)ssDNA文庫(kù)的處理；

(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ul HIV P24抗原，37℃，孵育2h，棄去EP管中的抗原，加入500uL封閉液，37℃，1h，結(jié)合初級(jí)ssDNA文庫(kù)，37℃，孵育1h；

(3)棄去未結(jié)合ssDNA文庫(kù)，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，加入200ul去離子水，95℃，10min，收集上清，作為下一輪篩選的次級(jí)庫(kù)；

(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀釋100倍的HIV P24抗原，結(jié)合次級(jí)庫(kù)，重復(fù)步驟(2)的步驟；

(5)正篩管：取磁珠0.15mL，加入已稀釋100倍的150uL HIV P24抗原，37℃，孵育1h，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，然后加入500uL封閉液，37℃，1h；

(6)qPCR擴(kuò)增獲得dsDNA：dsDNA反應(yīng)體系見表1，在上述PCR反應(yīng)體系中加入80ul模板，充分混勻，每管30ul，分成8管，qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，S型曲線達(dá)到最高點(diǎn)停止擴(kuò)增；

表1 dsDNA qPCR反應(yīng)體系

(7)取0.1mL鏈霉親和素磁珠于1.5mLEP管中，加入擴(kuò)增后的dsDNA，37℃，孵育30min，棄取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重復(fù)3次，用水洗1次，加入200uL結(jié)合緩沖液，95℃，5min，收集上清液，然后將上清液加入到反篩管中，37℃，孵育45min，將未結(jié)合的ssDNA文庫(kù)再與正篩管于37℃，旋轉(zhuǎn)孵育1h，除去未結(jié)合的ssDNA文庫(kù)；

(8)正篩管和反篩管都用篩選緩沖液洗3次，每次3min，各加入200ul去離子水，95℃，5min，收集上清，作為下一輪篩選的次級(jí)庫(kù)；

(9)富集效果監(jiān)測(cè)：按照表2所示反應(yīng)體系添加試劑，充分混勻后，分為4管，每管20ul；取分好的3管體系，各加入10ul正篩管上清、反篩管上清、去離子水，qPCR進(jìn)行檢測(cè)；

表2集效果監(jiān)測(cè)qPCR反應(yīng)體系

(10)重復(fù)上述篩選步驟，在第3輪反篩管磁珠中加入已稀釋100倍的150uL HIV gp41抗原，并在每輪篩選中加入tRNA非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑進(jìn)行篩選，增加篩選的特異性，共進(jìn)行6輪篩選，各輪SELEX篩選條件見表3；

表3各輪SELEX篩選條件

本發(fā)明大大的縮短了篩選周期、降低了篩選成本；同時(shí)提供了一種靈敏度高、成本低的早期檢測(cè)技術(shù)，也為篩選分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明篩選流程圖。

圖2為本發(fā)明反篩第三輪qPCR檢測(cè)結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明反篩第四輪qPCR檢測(cè)結(jié)果圖。

圖中：1，3—HIV P24抗原，2，4—HIV P24抗體。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。

實(shí)施例

一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法，以羧基化瓊脂磁珠為介質(zhì)，進(jìn)行6輪篩選，選出HIV P24抗原的高特異性核酸適配體，所述6輪篩選是用兩輪正篩和四輪反篩篩選得到HIV P24抗原的高特異性核酸適配體，具體包括以下步驟：

(1)ssDNA文庫(kù)的處理；

(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ul HIV P24抗原，37℃，孵育2h，棄去EP管中的抗原，加入500uL封閉液，37℃，1h，結(jié)合初級(jí)ssDNA文庫(kù)，37℃，孵育1h；

(3)棄去未結(jié)合ssDNA文庫(kù)，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，加入200ul去離子水，95℃，10min，收集上清，作為下一輪篩選的次級(jí)庫(kù)；

(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀釋100倍的HIV P24抗原，結(jié)合次級(jí)庫(kù)，重復(fù)步驟(2)的步驟；

(5)正篩管：取磁珠0.15mL，加入已稀釋100倍的150uL HIV P24抗原，37℃，孵育1h，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，然后加入500uL封閉液，37℃，1h；

(6)qPCR擴(kuò)增獲得dsDNA：dsDNA反應(yīng)體系見表4，在上述PCR反應(yīng)體系中加入80ul模板，充分混勻，每管30ul，分成8管，qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，S型曲線達(dá)到最高點(diǎn)停止擴(kuò)增；

表4 dsDNA qPCR反應(yīng)體系

(7)取0.1mL鏈霉親和素磁珠于1.5mLEP管中，加入擴(kuò)增后的dsDNA，37℃，孵育30min，棄取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重復(fù)3次，用水洗1次，加入200uL結(jié)合緩沖液，95℃，5min，收集上清液，然后將上清液加入到反篩管中，37℃，孵育45min，將未結(jié)合的ssDNA文庫(kù)再與正篩管于37℃，旋轉(zhuǎn)孵育1h，除去未結(jié)合的ssDNA文庫(kù)；

(8)正篩管和反篩管都用篩選緩沖液洗3次，每次3min，各加入200ul去離子水，95℃，5min，收集上清，作為下一輪篩選的次級(jí)庫(kù)；

(9)富集效果監(jiān)測(cè)：按照表5所示反應(yīng)體系添加試劑，充分混勻后，分為4管，每管 20ul；取分好的3管體系，各加入10ul正篩管上清、反篩管上清、去離子水，qPCR進(jìn)行檢測(cè)；

表5集效果監(jiān)測(cè)qPCR反應(yīng)體系

(10)重復(fù)上述篩選步驟，在第3輪反篩管磁珠中加入已稀釋100倍的150uL HIV gp41抗原，并在每輪篩選中加入tRNA非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑進(jìn)行篩選，增加篩選的特異性，共進(jìn)行6輪篩選，各輪SELEX篩選條件見表6；

表6各輪SELEX篩選條件

此流程利用磁珠法經(jīng)過(guò)6輪篩選成功的獲得了HIV P24核心抗原的適配子，從反篩第三輪開始替換反篩管偶聯(lián)的靶標(biāo)，目的是為了盡可能多的減少非特異性單鏈，從而獲得高特異性的適配體。對(duì)于后期的分子間的機(jī)理研究以及技術(shù)檢測(cè)具有非常重要的作用。技術(shù)方法快速、準(zhǔn)確、成本低,配基特異性高，為早期檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單的方法。為腫瘤的治療提供了一種新的載體。適配體可以偶聯(lián)治療腫瘤的藥物并定向地輸送到特異性腫瘤細(xì)胞中。

以上內(nèi)容是結(jié)合優(yōu)選技術(shù)方案對(duì)本發(fā)明所做的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定發(fā)明的具體實(shí)施僅限于這些說(shuō)明。對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思的前提下，還可以做出簡(jiǎn)單的推演及替換，都應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。