本申請(qǐng)涉及全基因組選擇育種技術(shù)。具體而言，本申請(qǐng)涉及利用全基因組選擇育種技術(shù)選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴于田間表現(xiàn)型的評(píng)價(jià)，根據(jù)育種家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行取舍，其最大的缺點(diǎn)在于耗時(shí)長(zhǎng)，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應(yīng)是能夠直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇提供了可能。近年來(lái)，已開(kāi)始應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇方法來(lái)改良個(gè)別目標(biāo)性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

三系雜交水稻具有穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，是在細(xì)胞質(zhì)雄性不育(即CMS，Cytoplasmic Male Sterility)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)配套的恢復(fù)系、保持系和不育系。CMS恢復(fù)系主要有野敗型(WA)CMS恢復(fù)系和紅蓮型(HL)CMS恢復(fù)系，以及粳稻包臺(tái)型(BT)CMS恢復(fù)系(萬(wàn)建民等，2008)。上述3種類型中控制著育性恢復(fù)的關(guān)鍵位點(diǎn)之一就是Rf-1基因及其相鄰區(qū)間，它包括了野敗型CMS恢復(fù)基因Rf4(Tang等，2014)、包臺(tái)型CMS恢復(fù)基因Rf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、紅蓮型CMS恢復(fù)基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥亟M核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列1078-1865位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列262-901位核苷酸的序列 或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；以及以上片段的組合。

在一實(shí)施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對(duì)與第二組引物對(duì)的組合，其包含(a)第一組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1079-1864位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1079-1864位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第1077-1078位或第1078-1079位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第1864-1865位或第1865-1866位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第1077-1078位或第1078-1079位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第1864-1865位或第1865-1866位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列1-262位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對(duì)與第四組引物對(duì)的組合，其包含(c)第三組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-262位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第263-900位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第263-900位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第262-263位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別 包含SEQ ID NO:2所示序列第900-901位或第901-902位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第262-263位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-262位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第900-901位或第901-902位核苷酸的序列的反向引物。

在一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，和5’-GAGGATGACGAGCCATTCGGTGA-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:1所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，5’-GATACGATGAATGCAGGGAA-3’，5’-GAGACGTAGCCCTTGGTGAT-3’，5’-CGAAGGAATCAAGGGCATAT-3’，5’-TCGGGTGCCTACATAGAATG-3’和5’-TTCTGGCGGAATCTGTAAT-3’。

在另一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-ACCTTAACCGTCAATTACAGGA-3’，和5’-GGATTACACCGTTTCGCCACTT-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:2所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-TTTGAATCGAAGCGGACCAT-3’，5’-CAGGCGTCGTTAGAGGTTTT-3’，5’-ATCGAATGGGATGCTACAT-3’和5’-CGCACATATCTATTGCCTGA-3’。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉x育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟，其中利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自RfC10ID161、RfC10ID14和RfC10ID35中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑倪x育含有Rf-1基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進(jìn) 行雜交，再將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161和負(fù)向選擇標(biāo)記RfC10ID14、RfC10ID35對(duì)其進(jìn)行Rf-1基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)與輪回親本再次進(jìn)行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有Rf-1基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)與輪回親本又一次進(jìn)行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161和負(fù)向標(biāo)記RfC10ID14、RfC10ID35對(duì)其進(jìn)行Rf-1基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；以及4)選擇導(dǎo)入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇，最終獲得含Rf-1基因組重組核酸片段純合且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的水稻植株。

在另一實(shí)施方案中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物，包括：用于擴(kuò)增分子標(biāo)記RfC10ID161的引物對(duì)，其中正向引物為5’-TCATGTGATGAACATTAGCTGAGT-3’，反向引物為5’-CTTAGTCAATAGCGAGGACTCA-3’；用于擴(kuò)增分子標(biāo)記RfC10ID14的引物對(duì)，其中正向引物為5’-CGGCTCATCCATGTTGACTGACT-3’，反向引物為5’-ATGTTTGGGACGTGCGTGCAGAA-3’；以及用于擴(kuò)增分子標(biāo)記RfC10ID35的引物對(duì)，其中正向引物為5’-CACCAGCTAGAGCTAGGTTATTC-3’，反向引物為5’-CCTGTTTAGATTCGTGGTCCTGT-3’。

又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)重組核酸片段的方法，其包括根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物，以待測(cè)基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體地，例如，所述引物如前所述?？蛇x擇地，利用Sanger測(cè)序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體而言，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增 及檢測(cè)SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，反向引物：5’-GAGGATGACGAGCCATTCGGTGA-3’；測(cè)序引物，包括正向引物：5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，正向引物：5’-GATACGATGAATGCAGGGAA-3’，反向引物：5’-GAGACGTAGCCCTTGGTGAT-3’，正向引物：5’-CGAAGGAATCAAGGGCATAT-3’，正向引物：5’-TCGGGTGCCTACATAGAATG-3’和反向引物：5’-TTCTGGCGGAATCTGTAAT-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO:1序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外，在本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-ACCTTAACCGTCAATTACAGGA-3’，反向引物：5’-GGATTACACCGTTTCGCCACTT-3’；測(cè)序引物，包括反向引物：5’-TTTGAATCGAAGCGGACCAT-3’，反向引物：5’-CAGGCGTCGTTAGAGGTTTT-3’，正向引物：5’-ATCGAATGGGATGCTACAT-3’和反向引物：5’-CGCACATATCTATTGCCTGA-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO:2序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過(guò)檢測(cè)確定了待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)還提供了檢測(cè)重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進(jìn)一步地，本申請(qǐng)還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實(shí)施方案中，采用如前所述的引物來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另 一實(shí)施方案中，采用如前所述的檢測(cè)重組核酸片段的方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實(shí)施方案中，采用如前所述的試劑盒來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)所述方法篩選得到的含有本申請(qǐng)公開(kāi)的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕谌蚪M選擇育種技術(shù)的選育含有Rf-1基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。僅通過(guò)五世代轉(zhuǎn)育，即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材料，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。本申請(qǐng)改良的受體材料為‘華占’，是中國(guó)水稻研究所培育的秈型常規(guī)水稻，具有分蘗力強(qiáng)配合力高等特點(diǎn)。利用上述方法，可以在保留‘華占’原有特性的情況下，提高對(duì)不育系金農(nóng)2A等材料的恢復(fù)能力，擴(kuò)大配組范圍。同時(shí)，本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕蚪M重組核酸片段與育性恢復(fù)能力緊密相關(guān)，可作為基因資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說(shuō)明

圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例1中CR033208水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測(cè)結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘華占’基因型，黑色線條代表供體親本‘金恢3號(hào)’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無(wú)多態(tài)性區(qū)段。圖中第10號(hào)染色體黑色圓點(diǎn)處線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的Rf-1基因組重組核酸片段RecCR033208。

圖2A和圖2B為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR033208上游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，CR033208為獲得的新品系，HZ為受體親本‘華占’，JH3為供體親本‘金恢3號(hào)’。

圖3為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR033208下游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，CR033208為獲得的 新品系，HZ為受體親本‘華占’，JH3為供體親本‘金恢3號(hào)’。

圖4為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR033208兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖；其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖，上方堿基為供體‘金恢3號(hào)’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘華占’的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來(lái)源于‘華占’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘金恢3號(hào)’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

圖5為本申請(qǐng)實(shí)施例3中測(cè)配組合花粉I₂-KI溶液染色鏡檢結(jié)果：(A)測(cè)配組合金農(nóng)2A/CR033208花粉I₂-KI溶液染色；(B)測(cè)配組合金農(nóng)2A/華占花粉I₂-KI溶液染色。圖中，黑色表示被I₂-KI溶液完全染色，為可育花粉；灰色表示被I₂-KI溶液不完全染色，屬染敗類型，為不育花粉；透明表示未被I₂-KI溶液染色，屬圓敗類型，為不育花粉。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請(qǐng)以及在本申請(qǐng)實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書(shū)寫，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變?cè)摵塑账嵝蛄兴幋a的氨基酸序列。

具體地，本申請(qǐng)涉及對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高Rf-1基因 組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來(lái)講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對(duì)程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本申請(qǐng)的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

本申請(qǐng)還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的1078-1865位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的262-901位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段，能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進(jìn)一步地，通過(guò)鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請(qǐng)的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說(shuō)，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預(yù)計(jì)有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用水稻‘華占’作為輪回親本，采用已被 證實(shí)具有特異育性恢復(fù)能力的水稻‘金恢3號(hào)’作為供體。

在本申請(qǐng)所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準(zhǔn)確率，一般同時(shí)用兩側(cè)相鄰的兩個(gè)標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行跟蹤選擇。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中，經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正向前景選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組片段緊密連鎖的標(biāo)記RfC10ID161，負(fù)向選擇標(biāo)記是位于目標(biāo)片段上游的標(biāo)記RfC10ID14，以及位于目標(biāo)片段下游的標(biāo)記RfC10ID35。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測(cè)時(shí)，一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，且RfC10ID14或RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型；兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，且RfC10ID14和RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型。

在本申請(qǐng)中，可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本申請(qǐng)所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用本申請(qǐng)人在中國(guó)專利申請(qǐng)CN102747138A中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2014/121419中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請(qǐng)文件中的全部?jī)?nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明而非限制本申請(qǐng)范圍的目的。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

本申請(qǐng)中所使用的水稻植株材料信息均可參見(jiàn)中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請(qǐng)中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實(shí)施例1 選育導(dǎo)入Rf-1基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘華占’及水稻‘金恢3號(hào)’。

水稻‘金恢3號(hào)’具有特異育性恢復(fù)能力，并推測(cè)可能是第10染色體的Rf-1基因組片段對(duì)該材料的恢復(fù)能力起到了關(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過(guò)程中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇，對(duì)所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。

使用Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)‘華占’和‘金恢3號(hào)’兩個(gè)親本進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行定量，使用MiSeq V2Reagent Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用Miseq臺(tái)式測(cè)序儀(illumina)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟及方法參見(jiàn)各試劑盒及測(cè)序儀使用說(shuō)明書(shū)。選取第10號(hào)染色體18,340,000至19,390,000DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，尋找堿基差異較大的位置，之后利用Premier 5.0軟件在上述位置設(shè)計(jì)InDel標(biāo)記共42對(duì)。通過(guò)PCR的方法，篩選上述引物對(duì)在‘金恢3號(hào)’及‘華占’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記，分別是正向選擇標(biāo)記RfC10ID161和負(fù)向選擇標(biāo)記RfC10ID14、RfC10ID35。用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見(jiàn)表1。

表1前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將水稻‘金恢3號(hào)’中前述基因簇所在的基因組片段導(dǎo)入到水稻‘華占’中，具體過(guò)程如下：

以‘華占’為輪回親本，‘金恢3號(hào)’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘華占’進(jìn)行回交，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161和負(fù)向選擇標(biāo)記RfC10ID14、 RfC10ID35進(jìn)行重組單株選擇，篩選出52個(gè)在目標(biāo)基因組DNA片段一側(cè)同源重組的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，且RfC10ID14或RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對(duì)其進(jìn)行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的52個(gè)單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果，選擇背景回復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)，使其與輪回親本‘華占’再次進(jìn)行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的重組單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)，使其與輪回親本‘華占’又一次進(jìn)行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161和負(fù)向標(biāo)記RfC10ID14、RfC10ID35對(duì)收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組DNA片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得6個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，且RfC10ID14和RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對(duì)上述6個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)(此世代背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標(biāo)記RfC10ID161對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號(hào)’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的株系一個(gè)，命名為CR033208。芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2 導(dǎo)入Rf-1基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的育性恢復(fù)能力基因組片段大小，對(duì)‘華占’導(dǎo)入 片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測(cè)序。將CR033208所含的Rf-1基因組重組核酸片段命名為RecCR033208。

通過(guò)水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測(cè)結(jié)果初步確定，RecCR033208位于兩個(gè)SNP標(biāo)記F1018826255GT和R1019050984GT之間。

同時(shí)，使用Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)CR033208全基因組測(cè)序,方法見(jiàn)實(shí)施例1所示，對(duì)‘華占’、‘金恢3號(hào)’和CR033208三個(gè)樣品的全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

根據(jù)前述SNP芯片及Miseq測(cè)序結(jié)果，將RecCR033208上游同源重組片段定位在第10染色體的18832043bp到18834870bp區(qū)間，下游同源重組片段定位于19044989bp到19047257bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對(duì)應(yīng)區(qū)段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增及測(cè)序引物，設(shè)計(jì)要求為引物長(zhǎng)22nt左右、GC含量40-60％且沒(méi)有錯(cuò)配。

以受體親本‘華占’和供體親本‘金恢3號(hào)’為對(duì)照，對(duì)RecCR033208上游和下游同源重組片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件，確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。下游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。由此，最終各篩選出一對(duì)擴(kuò)增引物用于上游和下游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)實(shí)際測(cè)序效果，最終各篩選出6條和4條測(cè)序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測(cè)序。具體的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物序列見(jiàn)表2，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2A、圖2B和圖3。

RecCR033208上游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為2067bp(SEQ ID NO:1)。1-1078bp為受體‘華占’的基因組區(qū)段，與供體‘金恢3號(hào)’比較，存在3個(gè)SNP。1079-1864bp這一786bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。 1865-2067bp為供體‘金恢3號(hào)’基因組片段，與‘華占’比較，存在3個(gè)SNP,1個(gè)Indel。

RecCR033208下游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為1437bp(SEQ ID NO:2)。1-262bp為供體‘金恢3號(hào)’的基因組區(qū)段，與‘華占’比較，存在1個(gè)SNP，2個(gè)Indel。263-900bp這一638bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。901-1437bp為受體‘華占’的基因組區(qū)段，與供體‘金恢3號(hào)’比較，存在5個(gè)SNP，1個(gè)Indel。

圖4為RecCR033208兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體‘金恢3號(hào)’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘華占’的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來(lái)源于‘華占’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘金恢3號(hào)’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

表2 Rf-1基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測(cè)序引物信息

實(shí)施例3 ‘華占’導(dǎo)入Rf-1基因組片段后育性恢復(fù)鑒定

在水稻三系雜交系統(tǒng)中，不育系的細(xì)胞質(zhì)會(huì)導(dǎo)致雜交F1代花粉不育，當(dāng)恢復(fù)系中存在對(duì)應(yīng)的恢復(fù)基因時(shí)，可使雜交F1代育性恢復(fù)、正常結(jié)實(shí)。CR033208與原品系‘華占’需要與相應(yīng)的不育系‘金農(nóng)2A’ 進(jìn)行測(cè)配，觀察雜交F1代育性，來(lái)測(cè)試兩者育性恢復(fù)能力的差異。

1、雜交種子制備

2014年冬季在海南進(jìn)行材料的種植，其中父本為改良品系CR033208和原品系‘華占’，測(cè)配母本為‘金農(nóng)2A’。父本抽穗期間，母本選取盛花期植株，剪去已經(jīng)開(kāi)過(guò)的穎花，將已經(jīng)成熟未開(kāi)放的穎花噴水后逐粒剪去上部1/3的穎殼，不傷及柱頭，套上紙袋。次日上午水稻盛花時(shí)段，剪取父本盛花的稻穗，從套袋頂端開(kāi)口伸到母本稻穗的上方，充分抖粉，隨后將套袋上口折合，注明父本編號(hào)和日期。20天后收獲種子，完成兩個(gè)測(cè)配組合金農(nóng)2A/CR033208和金農(nóng)2A/華占F₁代的制備，每個(gè)組合收獲100粒左右種子。

2、F₁代種植

2015年夏季在武漢種植F₁代，上述兩個(gè)F₁代雜交種分別種植24株，單株插秧，株距20cm，行距20cm，中間留走道40cm，常規(guī)栽培管理。

3、花粉育性考察

抽穗階段，每個(gè)組合F₁代取5株，每株1穗。在穗上、中、下部各取成熟穎花1～2朵，每朵穎花剝?nèi)?～3枚花藥，用鑷子將花藥在玻片上搗碎，用1％I₂-KI溶液染色后，置于100倍顯微鏡下觀察花粉形態(tài)和染色程度。

I₂-KI染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)附圖5，(A)為測(cè)配組合金農(nóng)2A/CR033208花粉I₂-KI溶液染色；(B)為測(cè)配組合金農(nóng)2A/華占花粉I₂-KI溶液染色。圖中，黑色為被I₂-KI溶液完全染色，為可育花粉；灰色為被I₂-KI溶液不完全染色，屬染敗類型，為不育花粉；透明為未被I₂-KI溶液染色，屬圓敗類型，為不育花粉。以可育花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100％表示花粉育性，取5株平均值，考察結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示測(cè)配組合金農(nóng)2A/CR033208花粉數(shù)目明顯多于測(cè)配組合金農(nóng)2A/華占，且前者的花粉育性明顯高于后者，表明F₁代育性得到恢復(fù)。

4、自然結(jié)實(shí)率考察

每個(gè)組合F₁代灌漿結(jié)實(shí)20天后，各取5株，每株1穗，考察稻 穗的自然結(jié)實(shí)情況，以結(jié)實(shí)粒數(shù)/穗總粒數(shù)×100％表示自然結(jié)實(shí)率，取5株平均值，考察結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示測(cè)配組合金農(nóng)2A/CR033208自然結(jié)實(shí)率較測(cè)配組合金農(nóng)2A/華占大幅提高，F(xiàn)₁代育性得到恢復(fù)。

表3 F₁代花粉育性及自然結(jié)實(shí)率考察結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本申請(qǐng)作了詳盡的描述，但在本申請(qǐng)基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本申請(qǐng)精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。