本發(fā)明涉及一種乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳糖酶(lactase)，即β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，該酶可催化兩種類型的反應(yīng)：一是水解作用，即將一分子的乳糖水解為一分子的葡萄糖和半乳糖；二是半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用，即能把半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到乳糖、葡萄糖等糖基上。

乳糖酶在以乳制品加工為主的工業(yè)中運(yùn)用廣泛，主要體現(xiàn)在以下方面：

I、水解乳制品中的乳糖，生產(chǎn)低乳糖的乳制品用以供給乳糖不耐受人群食用。

對(duì)大部分正常人來(lái)說(shuō)，乳糖是不能直接被機(jī)體利用的，只有經(jīng)乳糖酶水解，變成為半乳糖與葡萄糖后才能被人體利用；如果人體由于種種原因缺乏乳糖酶時(shí)則會(huì)造成乳糖未被吸收，就會(huì)引起腹鳴、腹脹、腹痛等癥狀，這種情況稱為乳糖不耐受(Lactasenon—persistent，LNP)。由于遺傳、飲食習(xí)慣等因素的影響，亞洲人中乳糖不耐癥患者較多，我國(guó)成年人中大概有90％以上的人會(huì)出現(xiàn)乳糖酶活性下降的情況，這其中有15％左右的乳糖不耐受人群，他們不能像其他人一樣從牛奶等乳制品中獲得豐富的營(yíng)養(yǎng)，因此只有開發(fā)添加β-半乳糖苷酶后的低乳糖的乳制品方能滿足他們的需要。

II、減少乳糖結(jié)晶析出

在冷飲等食品工業(yè)中，通過(guò)添加乳糖酶，可使原來(lái)溶解度較低的乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀?、甜度更高的單糖，這樣能減少在乳類和冰淇淋中濃縮的乳糖結(jié)晶析出，同時(shí)也能夠增加食品的甜度。

III、降低廢物的排放，促進(jìn)乳清等副產(chǎn)品的綜合利用

在干奶酪加工等生產(chǎn)中過(guò)程中要產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品——乳清。如果不經(jīng)任何處理而當(dāng)廢水排放，這樣不僅會(huì)污染環(huán)境，而且還要造成極大浪費(fèi)。其實(shí)可以根據(jù)乳清中富含乳糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的特點(diǎn)，利用乳糖酶將其水解為乳清糖漿，可使其中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，這樣就會(huì)增加糖漿甜度和溶解度，可部分代替蔗糖，用于面包、飲料等食品加工工業(yè)中。

此外，利用乳糖酶的半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用生產(chǎn)的低聚半乳糖已經(jīng)開始投放市場(chǎng)，低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)不被人體吸收，但能被腸道內(nèi)雙歧桿菌所利用，是很好的益生元。

乳糖酶的分布非常廣泛，在許多植物、動(dòng)物以及微生物中都有乳糖酶的存在。尤其是在真菌和細(xì)菌等微生物中分布更加廣泛，目前已經(jīng)從多種微生物中發(fā)現(xiàn)乳糖酶，比如：細(xì)菌中有芽孢桿菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌有天藍(lán)色鏈球菌；霉菌有黑曲霉、米曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、乳酸酵母等。

β-半乳糖苷酶的編碼基因?yàn)棣?半乳糖苷酶基因，由于其來(lái)源不同，不同種屬生物的β-半乳糖苷酶基因存著較大的差異性，所編碼的乳糖酶的最適溫度，pH值等酶學(xué)性質(zhì)也各不相同。國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMA)，根據(jù)氨基酸序列一致性比較，將已發(fā)現(xiàn)的各種糖基水解酶分成了133個(gè)家族，分別命名為GH1——GH133家族。在目前發(fā)現(xiàn)的133個(gè)家族中，β-半乳糖苷酶存在主要存在于第GH2，GH42家族，而且多數(shù)來(lái)自于乳酸菌等原核生物，在同一家族中的乳糖酶基因其相似性比較高。

乳糖酶的工業(yè)生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法，根據(jù)其發(fā)酵菌株的不同，制取得到的乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)也各不相同。為了獲得產(chǎn)酶量高的菌株，除了常規(guī)的微生物誘導(dǎo)篩選方法外，目前常采取利用基因工程等技術(shù)手段，將乳糖酶基因克隆并轉(zhuǎn)化到其他生物細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)的方法來(lái)構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)的工程菌株。

Kefir粒(開菲爾粒)是一種原產(chǎn)于高加索地區(qū)的用于生產(chǎn)開菲爾發(fā)酵乳的發(fā)酵劑，它是一種由不同的微生物所構(gòu)成的一個(gè)凝膠狀微生物群落。Kefir粒中的微生物間存在著一種復(fù)雜共生關(guān)系，組成Kefir粒的微生物菌相非常復(fù)雜，其中乳酸菌含量最多，約占整個(gè)菌群總數(shù)的90％以上，而且其構(gòu)成也非常復(fù)雜，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的乳酸菌有：乳桿菌類的馬奶酒樣乳桿菌Lactobacillus kefiranofaciens，嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus，短小乳桿菌Lactobacillus brevis，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，干酪乳桿菌Lactobacillus casei，瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus，發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum，德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，以及小鼠乳桿菌Lactobacillus murinus，戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus，Japonicus葡糖桿菌Gluconobacter japonicus，雙歧桿菌Bifidobacterium等；乳球菌類乳酸乳球菌Lactococcus lactis，嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophiles，腸膜明串珠菌Leuconostoc mesentroides等。Kefir粒存在于牛乳、羊乳等富含乳糖的環(huán)境中，需要依靠其豐富乳酸菌群產(chǎn)生大量不同種類的乳糖酶，將乳糖水解成單糖后作為碳源利用。因此Kefir粒也是一個(gè)天然的乳糖酶資源庫(kù)。

乳酸菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的微生物的通稱。乳酸菌廣泛地存在于自然界、動(dòng)物體內(nèi)、乳制品和發(fā)酵食品中，且大多數(shù)為非致病菌，通常被認(rèn)為是安全的GRAS級(jí)(Generally Recognized As Safe)的微生物，在醫(yī)藥、食品及飼料等工業(yè)中獲得了日益廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法與應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種建立乳糖酶工程菌資源庫(kù)的特異引物組，所述特異引物組包含兩對(duì)特異引物，分別為GH2家族特異引物和GH42家族特異引物，GH2家族特異引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GH42家族特異引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

GH2家族特異引物核苷酸序列如下(I為次黃嘌呤)：

GH2-up:GGATCCATGIAAGCAAAIATIAAATGG——BamHI SEQ ID NO.1

GH2-down:CTCGAGTTAAAAITIGTTIAIIATGAAIGA——XhoI SEQ ID NO.2

GH42家族特異引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAIAAACITTAICACGI——BamHI SEQ ID NO.3

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAAIACTTGIAC——XhoI SEQ ID NO.4

一種乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法，包括如下步驟：

(1)將Kefir粒放入滅菌后的脫脂牛奶中，在20～30℃的條件下培養(yǎng)60～84h，然后離心，收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，離心取沉淀，然后用濃度為45～55mmol/L、pH7.5～8.5的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液進(jìn)行第二次重懸，離心取沉淀，然后用含有濃度為45～55mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和18～22mmol/L EDTA、pH7.5～8.5的混合溶液進(jìn)行第三次菌體重懸，制得菌懸液；然后提取DNA，制得基因組DNA；

(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，分別用上述GH2家族特異引物和GH42家族特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得擴(kuò)增產(chǎn)物lacgh2和lacgh42；

(3)將步驟(2)制得的擴(kuò)增產(chǎn)物lacgh2和lacgh42經(jīng)BamH I和Xhol I雙酶切后，與同樣經(jīng)BamH I和Xhol I雙酶切的質(zhì)粒表達(dá)載體pET30a連接，制得重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，篩選轉(zhuǎn)化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌資源庫(kù)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，提取DNA的步驟如下：

向菌懸液中按0.8～1.2mg/mL的比例加入溶菌酶，按0.08～0.12mg/mL的比例加入蛋白酶K以及按質(zhì)量百分比濃度0.8～1.2％的比例加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，35～38℃保溫25～40min裂解細(xì)胞；然后8000～12000rpm離心8～15min，收集上清液，按體積比25:24的比例加入苯酚/氯仿溶液，離心去除沉淀，上清液中加入8～10倍體積無(wú)水乙醇，取沉淀，用體積濃度為70％的乙醇沖洗后，即得。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述苯酚/氯仿溶液為苯酚與氯仿按體積比1:1的比例混合的混合液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系如下，總體系50μl:

PCR擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，雙酶切體系如下，總體系20μl:

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，大腸桿菌為大腸桿菌E.coli BL21。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，轉(zhuǎn)化條件為：

將感受態(tài)細(xì)胞與重組表達(dá)載體混合后，置于冰上25～35min；然后迅速放入40～45℃水浴鍋內(nèi)1～2min，進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化后置于冰上1.5～2.5min；加入2倍體積以上的LB液體培養(yǎng)基，放到搖床上35～38℃振蕩培養(yǎng)40～50min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，篩選步驟如下：

將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌E.coli BL21涂布于含有50μg/mL的卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，35～38℃培養(yǎng)12～14h，選取白色光滑菌落，即得。

上述構(gòu)建的乳糖酶工程菌資源庫(kù)在篩選特異乳糖酶中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明以Kefir粒為對(duì)象，通過(guò)提取其基因組，然后以宏基因?yàn)檠芯繉?duì)象，根據(jù)第GH2，GH42家族乳糖酶的不同特點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)通用引物組，分別克隆出不同乳糖酶基因，插入到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了該基因在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)的工程菌庫(kù)，為進(jìn)一步篩選能夠適應(yīng)不同條件的乳糖酶，或者制取乳糖酶復(fù)合制劑奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖 1、乳糖酶重組菌蛋白的表達(dá)與純化電泳結(jié)果照片；

圖中：M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.E.coli BL21/pET30a-lac轉(zhuǎn)化子純化后蛋白；2.E.coli BL21/pET30a-lac轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后的總蛋白；3.E.coli BL21/pET30a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后的總蛋白(對(duì)照)；

圖2重組菌在X-Gal培養(yǎng)基中的顯色反應(yīng)結(jié)果照片；

圖3不同設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增兩種類型乳糖酶基因的半定量PCR凝膠電泳圖；

圖4不同方法提取Kefir?；蚪M凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施是為了更好地說(shuō)明參數(shù)本發(fā)明的內(nèi)容，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。

菌株與載體

Kefir粒來(lái)源于高加索開菲爾菌，從市場(chǎng)購(gòu)得，購(gòu)于無(wú)錫市多洪食品有限公司；

大腸桿菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET30a均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；

酶與試劑盒

限制性內(nèi)切酶，DNA聚合酶，T₄連接酶等酶制劑均購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；其余均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)試劑。

細(xì)菌基因組提取試劑盒，高純度質(zhì)粒提試劑盒，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，細(xì)菌蛋白抽提試劑盒，Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒等均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；

培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基：

NaCl 10g與胰蛋白胨10g，酵母粉5g混合，加蒸餾水定容至1L，用NaOH調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20min后保存。

LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基：

在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度為2％的瓊脂粉，加蒸餾水定容至1L，用NaOH調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20min后保存。

實(shí)施例1

一種乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法，包括如下步驟：

(1)將Kefir粒放入滅菌后的脫脂牛奶中，在25℃的條件下培養(yǎng)72h，然后離心，收集菌體，然后用PBS緩沖液重懸菌體，離心取沉淀，然后用濃度為50mmol/L、pH8.0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液進(jìn)行第二次重懸，離心去上清，然后用含有濃度為50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和20mmol/L EDTA、pH8.0的混合溶液進(jìn)行第三次菌體重懸，制得菌懸液；然后提取DNA，制得基因組DNA；

所述步驟(1)中，提取DNA的步驟如下：

向菌懸液中按1mg/mL加入溶菌酶，0.1mg/mL加入蛋白酶K以及1％加入SDS，37℃保溫30min裂解細(xì)胞；然后10000rpm離心10min，收集上清液，按25:24加入苯酚/氯仿溶液，苯酚/氯仿溶液為苯酚與氯仿按體積比1:1的比例混合的混合液，離心去除沉淀，上清液中加入10倍體積無(wú)水乙醇，取沉淀，用體積濃度為70％乙醇沖洗2遍后，即得。

(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，分別用GH2家族特異引物和GH42家族特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得擴(kuò)增產(chǎn)物lacgh2和lacgh42；

GH2家族特異引物核苷酸序列如下(I為次黃嘌呤)：

GH2-up:GGATCCATGIAAGCAAAIATIAAATGG——BamHI SEQ ID NO.1

GH2-down:CTCGAGTTAAAAITIGTTIAIIATGAAIGA——XhoI SEQ ID NO.2

GH42家族特異引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAIAAACITTAICACGI——BamHI SEQ ID NO.3

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAAIACTTGIAC——XhoI SEQ ID NO.4

PCR擴(kuò)增體系如下，總體系50μl:

PCR擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

PCR擴(kuò)增后用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，兩種家族乳糖酶基因PCR產(chǎn)物分別命名為lacgh2和lacgh42，挑選部分PCR產(chǎn)物送金唯智公司測(cè)序。然后分別回收兩種家族乳糖酶基因PCR產(chǎn)物將其純化后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

(3)將步驟(2)制得的擴(kuò)增產(chǎn)物lacgh2和lacgh42經(jīng)BamH I和Xhol I雙酶切后，與同樣經(jīng)BamH I和Xhol I雙酶切的質(zhì)粒表達(dá)載體pET30a(提取質(zhì)粒表達(dá)載體pET30a的方法參照康維世紀(jì)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21中，篩選轉(zhuǎn)化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌資源庫(kù)。

所述雙酶切體系如下，總體系20μl:

所述步驟(3)中，轉(zhuǎn)化條件為：

在100μL感受態(tài)細(xì)胞加入3μL重組表達(dá)載體，置于冰上30min；然后迅速放入42℃水浴鍋內(nèi)1.5min，進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化后快速置于冰上2min；加入2倍體積以上的LB液體培養(yǎng)基，放到搖床上37℃輕柔振蕩培養(yǎng)45min。

所述步驟(3)中，篩選步驟如下：

將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌E.coli BL21涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～14h，選取白色光滑菌落，即得。

實(shí)施例2乳糖酶基因的表達(dá)庫(kù)的活性檢測(cè)

1、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將含有乳糖酶基因全長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆接種于50μg·L^-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1:50接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD₆₀₀約為0.5，加入IPTG至終濃度為0.5mmol·L^-1，27℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h以誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。蛋白純化方法參照(Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒)說(shuō)明書。

用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物，分離膠濃度為12％。蛋白純化產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，由圖結(jié)果可知：與對(duì)照菌株(pET-30a)相比，原核表達(dá)菌(pET-30a-lac)在相對(duì)分子量35kD和76kD附近出現(xiàn)兩條新帶，與文獻(xiàn)中報(bào)到的GH2和42GH乳糖酶家族中乳糖酶蛋白分子量一致。

2、乳糖酶的活性測(cè)定

使用液相色譜法通過(guò)測(cè)定乳糖的減少量以及半乳糖和葡萄糖的量來(lái)間接反應(yīng)β-半乳糖苷酶的活力大小。

分別準(zhǔn)確稱取1.00g左右的乳糖，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至50mL，配成濃度為20mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取糖標(biāo)準(zhǔn)液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00mL于10mL容量瓶中，用水稀釋定容，分別吸20μL注入高效液相色譜儀，以葡萄糖和乳糖的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過(guò)待測(cè)樣品的峰面積換算出乳糖或者葡萄糖的數(shù)量。色譜條件為：

色譜柱：氨基柱，5μm，4.6×300mm；

柱溫：室溫；

流動(dòng)相：乙腈：水＝75：25；

流速：10mL/min；

示差折光檢測(cè)器內(nèi)溫：40℃；

進(jìn)樣量:20μL

將實(shí)施例1中構(gòu)建好的乳糖酶基因表達(dá)庫(kù)中的E.coli BL21菌群發(fā)酵液菌體收集，使用超聲波破碎，添加到牛乳中，37℃條件下存放24小時(shí)，測(cè)定其乳糖含量，如果大部分乳糖發(fā)生水解，證明其具有乳糖酶活性。

實(shí)施例3從乳糖酶基因表達(dá)庫(kù)中篩選所需的工程菌

根據(jù)特定的需要，配制不同條件的LB平板，如要獲得耐酸的工程菌，可將LB平板pH調(diào)至酸性條件，然后在每個(gè)平板上涂布少量的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)溶液，再涂布實(shí)施例1中構(gòu)建好的乳糖酶基因表達(dá)庫(kù)中的菌液，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，當(dāng)有藍(lán)色的菌落出現(xiàn)，如圖2所示，則表明該菌能在特定條件下生長(zhǎng)，并且具有β-半乳糖苷酶水解活性，有可能是所需要的工程菌，從而進(jìn)行后續(xù)分離篩選即可。

對(duì)比例1

如實(shí)施例1所述的乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法，不同之處在于，步驟(2)PCR擴(kuò)增采用的引物核苷酸序列如下：

GH2-up:GGATCCATGAAAGCAAATATCAAATGG——BamHI

GH2-down:CTCGAGTTAAAATTAGTTGAGAATGAATGA——XhoI

GH42家族特異引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAAAAACATTATCACGT——BamHI

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAATACTTGAAC——XhoI

考慮到引物的兼并性，實(shí)施例1中在乳糖酶的基因差異較大位點(diǎn)使用了次黃嘌呤I，其主要目的是為了提高與Kefir粒中不同來(lái)源的乳糖酶基因的結(jié)合率，因?yàn)榇吸S嘌呤能很好的和4種堿基配對(duì)。因此相比對(duì)比例1中引物，能擴(kuò)增出更多的乳糖酶基因片段，其結(jié)果可以通過(guò)采取半定量PCR等方法進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)比例2

如實(shí)施例1所述的乳糖酶工程菌資源庫(kù)的建立方法，不同之處在于，步驟(1)如下：

將Kefir粒放入滅菌后的脫脂牛奶中，在25℃的條件下培養(yǎng)72h，然后離心，收集菌體，然后用PBS緩沖液重懸菌體，離心取沉淀，重復(fù)PBS緩沖液重懸菌體2次，制得菌懸液；然后提取DNA，制得基因組DNA。

實(shí)驗(yàn)例1

將實(shí)施例1與對(duì)比例1中引物，以相同的基因組為模版，進(jìn)行半定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。

通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)20輪循環(huán)后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在引物和模板量相同的情況下，使用實(shí)施例1的兩種引物，泳道1和3中的擴(kuò)增條帶亮度非常高；與此相對(duì)應(yīng)的是，泳道2和4是采用了對(duì)比例1的引物擴(kuò)增后的條帶，亮度偏暗，說(shuō)明該引物擴(kuò)增出的乳糖酶基因數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)施例1，由此可以判定實(shí)施例1中的引物具有更好的兼容性。

實(shí)驗(yàn)例2

將實(shí)施例1與對(duì)比例2提取的基因組通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)后，結(jié)果如圖4所示。

由電泳圖可以看到，泳道1為采用實(shí)施例1的PBS，Tris以及Tris+EDTA三部洗脫法提取的基因組比較完整，無(wú)斷裂條帶，無(wú)明顯的蛋白雜帶等，DNA提取濃度高，提取的樣品可以作為模板進(jìn)行下一步的基因克隆擴(kuò)增。而泳道2為采用對(duì)比例2的方法，基因組出現(xiàn)了非常彌散的條帶，而且在底部出現(xiàn)了大量的小分子量的亮帶，估計(jì)是斷裂的DNA片段或者是少量尚未降解的RNA，因此不適合做下一步基因擴(kuò)增。