一種利用固定化乳糖酶制備無乳糖乳制品的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了一種利用固定化乳糖酶制備無乳糖乳制品的方法，屬于無乳糖乳制品制備技術領域。
【背景技術】
[0002]無乳糖是指用某種工藝(乳糖酶)去除了奶中的乳糖，乳糖酶分泌過少的人應該食用無乳糖的奶制品。
[0003]乳糖是動物乳汁中一種特有雙糖，不能被人體直接吸收，必須經過乳糖酶水解成半乳糖和葡萄糖，而亞洲人由于沒有日常飲用乳的習慣，很大一部分人群體內缺乏乳糖酶，喝牛奶后的典型表現是拉肚子，即乳糖不耐癥。另外發(fā)酵乳在發(fā)酵的過程中，雖然一部分乳糖被分解，但是還有一定量的乳糖殘留，乳糖不耐癥嚴重者飲食發(fā)酵乳也會發(fā)生不適反應，同時，未有癥狀的乳糖不耐癥患者，對發(fā)酵乳營養(yǎng)的吸收也大打折扣。因此，研發(fā)一種低乳糖甚至無乳糖的發(fā)酵乳具有重要的意義。
[0004]目前傳統(tǒng)方法在制備無乳糖乳制品時，采用將乳糖酶加入鮮牛奶中將乳糖水解為葡糖糖和半乳糖，然后再接種發(fā)酵劑制得發(fā)酵乳，或者是將乳糖酶加入牛奶中并同時接種發(fā)酵劑制得低乳糖發(fā)酵乳，雖然該方法降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，但乳糖含量降低仍未達到國標規(guī)定的無乳糖限量，對乳糖不耐癥患者嚴重的人仍然不適用，而且由于酸奶發(fā)酵過程中PH會持續(xù)降低，在中性奶中適用的乳糖酶在發(fā)酵階段酶活性會降低甚至失效，導致酶解效率大幅降低，即使在配料過程中加大乳糖酶的使用量也無法制得國標限定的無乳糖發(fā)酵乳。
[0005]除此以外，目前乳糖酶并未在中國食品和乳制品工業(yè)中得到廣泛的應用，主要原因是:(I)乳糖酶的單位產量較低；(2)市場上銷售的乳糖酶多為胞內酶，酶的耐熱性差、適用范圍窄，且這種酵母來源的胞胞內酶，需破碎細胞才能得到，提取、純化工藝繁雜，另外生活中適用的乳糖酶往往為游離酶，不僅成本高、適用范圍窄，而且不能滿足食品和乳制品工業(yè)多方面的需要。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術問題:針對目前在制備無乳糖乳制品的過程中，往往使用游離的乳糖酶對原料乳進行酶解，導致在發(fā)酵階段酶活性會降低甚至失效，酶解效率大幅度降低，即使加大乳糖酶的使用量也無法制得國標限定的無乳糖發(fā)酵乳的現狀，提供了一種通過脆壁克魯維酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)制得粗酶液，經鹽析、脫鹽制得純化乳糖酶，將其用戊二醛交聯固定在凹凸棒土上，制得固定化乳糖酶，再將其用于原料乳的酶解中，從而得到利用固定化乳糖酶制備無乳糖乳制品的方法。該方法操作簡便，不僅利用固定化乳糖酶提高了酶的穩(wěn)定性，降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，達到了國家規(guī)定的無乳糖標準，而且制得的無乳糖發(fā)酵乳產品口味極佳、營養(yǎng)豐富，容易被人體吸收，適合大規(guī)模生產應用。
[0007 ]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是: (1)按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30?35°C下培養(yǎng)3?4天，用棉簽刮下孢子移入200?300mL滅菌后的質量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30?40W功率振蕩分散30?40min制得孢子懸液，通過滅菌后的漏斗過濾，得孢子；
(2)再按IX 14?2X 14個/mL的接種量，將上述所得的孢子轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25?35°C條件下培養(yǎng)7?8天后過濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液；
(3)量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸銨，于4?6°C的冰水浴中靜置鹽析12?14h后用高速離心機以10000?12000r/min轉速離心分離得到沉淀，最后用pH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；
(4)稱取100?200g凹凸棒土用研缽研磨后過100目標準篩，分別用濃度為0.lmol/L鹽酸和0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10?12h，再放入馬弗爐于300?400 °C下煅燒3?4h，得固定化酶載體；
(5)稱取10?20g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400?500mLpH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置10?12h后，再加入I?2g備用的純化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力攪拌機以300?400r/min轉速進行攪拌；
(6)在攪拌的過程中再加入50?60mL質量濃度為2%戊二醛溶液，升高水浴溫度至30?35 V，繼續(xù)攪拌交聯反應4?6h后，過濾得濾渣，移入布氏漏斗中用pH為7.0磷酸緩沖液反復抽濾洗滌3?5遍后，即得固定化乳糖酶；
(7)稱取I?2L原料乳、I?2g果膠、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均勻后倒入酶解罐，設置酶解溫度為35?40°C，保溫酶解10?12h后，過濾回收固定化乳糖酶，將得到的酶解乳制品瞬時高溫滅菌后即得利用固定化乳糖酶制備的無乳糖乳制品。
[0008]所述的馬鈴薯培養(yǎng)基是由200?300g馬鈴薯、20?30g葡萄糖、15?20g瓊脂和IL蒸餾水復配制得。
[0009]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是由5?1g果膠、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸銨、10?12g磷酸氫二鉀和IL蒸餾水復配制得。
[0010]本發(fā)明的應用方法是:本發(fā)明利用固定化乳糖酶制備的無乳糖乳制品無需冷藏，早上食用早餐時，飲用200?300mL本發(fā)明制得的無乳糖乳制品，連續(xù)堅持食用20?25天，可明顯感覺人體抵抗力得到提高，睡眠得到改善，且口味極佳、營養(yǎng)豐富，容易被人體吸收。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法獨特新穎，利用固定化乳糖酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)游離乳糖酶，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，而且使得制得的無乳糖乳制品達到了國家規(guī)定的無乳糖標準；
(2)本發(fā)明制得的無乳糖乳制品口味極佳、營養(yǎng)豐富，容易被人體吸收，具有較好的市場前景，可大規(guī)模生產應用。
【具體實施方式】
[0012]首先按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30?35°C下培養(yǎng)3?4天，用棉簽刮下孢子移入200?300mL滅菌后的質量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30?40W功率振蕩分散30?40min制得孢子懸液，通過滅菌后的漏斗過濾，得孢子;然后再按I X 14?2X 14個/mL的接種量，將上述所得的孢子轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25?35°C條件下培養(yǎng)7?8天后過濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液;接下來量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸銨，于4?6°C的冰水浴中靜置鹽析12?14h后用高速離心機以10000?12000r/min轉速離心分離得到沉淀，最后用PH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；之后稱取100?200g凹凸棒土用研缽研磨后過100目標準篩，分別用濃度為0.1 mo I/L鹽酸和
0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10?12h，再放入馬弗爐于300?400°C下煅燒3?4h，得固定化酶載體；隨后稱取10?20g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400?500mL pH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置10?12h后，再加入I?2g備用的純化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力攪拌機以300?400r/min轉速進行攪拌;在攪拌的過程中再加入50?60mL質量濃度為2%戊二醛溶液，升高水浴溫度至30?35°C，繼續(xù)攪拌交聯反應4?6h后，過濾得濾渣，移入布氏漏斗中用pH為7.0磷酸緩沖液反復抽濾洗滌3?5遍后，即得固定化乳糖酶;最后稱取I?2L原料乳、I?2g果膠、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均勻后倒入酶解罐，設置酶解溫度為35?40°C，保溫酶解10?12h后，過濾回收固定化乳糖酶，將得到的酶解乳制品瞬時高溫滅菌后即得利用固定化乳糖酶制備的無乳糖乳制品。其中所述的馬鈴薯培養(yǎng)基是由200?300g馬鈴薯、20?30g葡萄糖、15?20g瓊脂和IL蒸餾水復配制得，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是由5?1g果膠、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸銨、10?12g磷酸氫二鉀和IL蒸餾水復配制得。
[0013]實例I
首先按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30°C下培養(yǎng)3天，用棉簽刮下孢子移入200mL滅菌后的質量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30W功率振蕩分散30min制得孢子懸液，通過滅菌后的漏斗過濾，得孢子;然后再按I X 14個/mL的接種量，將上述所得的孢子轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C條件下培養(yǎng)7天后過濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液;接下來量取300mL得到的粗酶液，向里加入1g硫酸銨，于4°C的冰水浴中靜置鹽析12h后用高速離心機以lOOOOr/min轉速離心分離得到沉淀，最后用pH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；之后稱取10g凹凸棒土用研缽研磨后過100目標準篩，分別用濃度為
0.lmol/L鹽酸和0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10h，再放入馬弗爐于300°C下煅燒3h，得固定化酶載體;隨后稱取1g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400mL pH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置1h后，再加入Ig備用的純化乳