本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種利用微生物發(fā)酵提高紅景天酪醇含量的方法。

背景技術(shù)：

紅景天系景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola)植物，多年生草本或亞灌木。我國紅景天屬植物約占世界紅景天種資源總量的80％，分布廣泛，一般生長在高寒、干燥、缺氧、強(qiáng)紫外線照射、晝夜溫差大的高海拔地帶，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和頑強(qiáng)的生命力。因其生長環(huán)境惡劣，使其具有抗氧化、抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗衰老、抗病毒，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)和提高免疫力等功效。紅景天中的主要有效和活性成分是紅景天苷及其苷元酪醇，常以其總含量的高低作為衡量紅景天屬植物原藥材及其制劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。但兩者在紅景天中的含量不高，利用化學(xué)方法合成產(chǎn)率低，污染環(huán)境，如何在溫和的條件下提高有效成分是目前迫切需要解決的問題。

中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取了微生態(tài)學(xué)研究成果，結(jié)合現(xiàn)代生物工程的發(fā)酵技術(shù)而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)。在中藥發(fā)酵過程中，微生物能產(chǎn)生纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶等多種次生代謝產(chǎn)物，使復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)在常溫常壓下迅速完成，比一般物理或化學(xué)的炮制手段更大幅度地增強(qiáng)和調(diào)整藥性，提高療效，降低毒副作用。經(jīng)過發(fā)酵后，可以改變其原有性能，有效成分充分分離、提取，有的更具有生物活性，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效，擴(kuò)大臨床用藥范圍，更加適應(yīng)臨床用藥的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本專利提供了一種新的技術(shù)，利用微生物發(fā)酵制藥技術(shù)來提高紅景天中的酪醇含量，使有效成分增加。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種利用微生物發(fā)酵提高紅景天中酪醇含量的方法，包括以下步驟：

(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎，過40-60目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為80-100℃，干燥時間2-3小時，使含水量2％-6％，即得紅景天粉，備用；

(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25-1:50的比例100℃提取兩次，紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足損失的水分，將提取液在2-8℃冰箱沉降過夜，5000r離心20-30分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基；

(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g酵母粉、20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min；

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入0.5％-2％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min；

(5)發(fā)酵方法：取環(huán)酵母菌CICC1339接種至種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再按2％-5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200r培養(yǎng)2-3天；

(6)酪醇含量檢測方法：將發(fā)酵液12000r離心10min除去菌體，上清過0.22μm濾器，采用C18色譜柱，在220nm以25％甲醇為流動相，進(jìn)樣量10μl流速1ml/min，柱溫30℃樣品分析時間20min。

為了取得更好的技術(shù)效果，步驟(1)中紅景天過完40-60目篩后，未通過的粗粉再粉碎，至全部過40-60目篩。

為了取得更好的技術(shù)效果，步驟(2)對紅景天進(jìn)行水提取時，每隔5分鐘進(jìn)行一次攪拌。

為了取得更好的技術(shù)效果，步驟(2)對紅景天進(jìn)行水提取時，每次提取一小時。

為了取得更好的技術(shù)效果，步驟(2)中紗布過濾時，所用紗布為八層紗布重疊一起。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：

本發(fā)明采用編號為CICC1339的酵母菌發(fā)酵紅景天，經(jīng)發(fā)酵后,其有效成分能被充分分離、提取。在酵母菌分泌的多種酶的作用下酪醇的含量明顯提高，酪醇含量可由發(fā)酵前的0.6mg/g提高到發(fā)酵后1.8mg/g，有效成分得到明顯提高。本方法可以比一般物理或化學(xué)的炮制手段更大幅度地增強(qiáng)和調(diào)整藥性，提高療效，降低毒副作用。該方法操作簡單，成本低，周期短，是在溫和條件下提高紅景天有效成分的方法，有利于中藥的綜合利用，具有廣闊的市場前景。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片20g粉碎，過40-60目篩，中粉及細(xì)粉留用，粗粉再粉碎，至全部過60目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為80℃，干燥時間2小時，使含水量6％,即得紅景天粉，備用。

(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例100℃提取兩次，每次一小時，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在4℃冰箱沉降過夜，5000r離心20分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g酵母粉、20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入2％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(5)發(fā)酵方法：取一環(huán)酵母菌CICC1339接種至種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200r培養(yǎng)3天。

(6)酪醇含量檢測方法：將發(fā)酵液12000r離心10min除去菌體，過0.22μm濾器，采用C18色譜柱，在220nm以25％甲醇為流動相，進(jìn)樣量10μl流速1ml/min，柱溫30℃樣品分析時間20min。最終得到酪醇含量1.5mg/g，比發(fā)酵前提高了150％。

實(shí)施例2

(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎20g，過60目篩，中粉及細(xì)粉留用，粗粉再粉碎，至全部過60目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為100℃，干燥時間3小時，使含水量5％,即得紅景天粉，備用。

(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例100℃提取兩次，每次一小時，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在5℃冰箱沉降過夜，5000r離心30分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g酵母粉、20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入1％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(5)發(fā)酵方法：取一環(huán)酵母菌CICC1339接種至種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再按4％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200r培養(yǎng)3天。

(6)酪醇含量檢測方法：將發(fā)酵液12000r離心10min除去菌體，過0.22μm濾器，采用C18色譜柱，在220nm以25％甲醇為流動相，進(jìn)樣量10μl流速1ml/min，柱溫30℃樣品分析時間20min，最終得到酪醇含量1.6mg/g，比發(fā)酵前提高了166％。

實(shí)施例3

(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片20g粉碎，過50目篩，中粉及細(xì)粉留用，粗粉再粉碎，至全部過50目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為90℃，干燥時間3小時，使含水量4％,即得紅景天粉，備用。

(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例100℃提取兩次，每次一小時，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在4℃冰箱沉降過夜，5000r離心25分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g酵母粉、20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入2％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，115℃滅菌20min。

(5)發(fā)酵方法：取一環(huán)酵母菌CICC1339接種至種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200r培養(yǎng)3天。

(6)酪醇含量檢測方法：將發(fā)酵液12000r離心10min除去菌體，過0.22μm濾器，采用C18色譜柱，在220nm以25％甲醇為流動相，進(jìn)樣量10μl流速1ml/min，柱溫30℃樣品分析時間20min。最終得到酪醇含量1.8mg/g，比發(fā)酵前提高了200％。

實(shí)施例1-3所得紅景天發(fā)酵液的酪醇含量和提高率

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。