本發(fā)明涉及一株蒂莫內(nèi)馬賽菌新菌株，還涉及該蒂莫內(nèi)馬賽菌新菌株在石油污染生物修復(fù)中的用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

石油屬于可燃性礦物質(zhì)，是地球在形成的不同歷史時(shí)期，由植物或動(dòng)物等有機(jī)物殘骸生成的。烷烴是組成石油的主要成分，隨相對(duì)分子質(zhì)量的增加，烷烴分別以氣、液、固三態(tài)存在于石油中。芳香烴占石油含量的2-4％，有單環(huán)類(如苯、甲苯、二甲苯)，還含有雙環(huán)(主要是萘)、三環(huán)芳烴(如菲)和三環(huán)以上多環(huán)烴。

石油對(duì)生物的毒性可分為兩類，一類是大量石油造成的急性中毒；另一類是長期低濃度石油的毒性效應(yīng)。一般輕質(zhì)油的煉制油品毒性比原油大，石油及石油產(chǎn)品的毒性與其中含有的可溶性芳烴衍生物(苯、萘、菲等)的含量成正比關(guān)系。石油在水體中的毒性效應(yīng)大多來自水溶性大的相對(duì)分子質(zhì)量低的正烷烴和單環(huán)芳烴。其中芳烴對(duì)生物的毒性最大。

目前在石油污染的治理中，采取的技術(shù)有物理、化學(xué)和生物方法，其中物理方法是對(duì)石油烴進(jìn)行稀釋、聚集或?qū)⑵溥w移到其他環(huán)境中，而化學(xué)方法很難將石油烴徹底降解，且化學(xué)方法會(huì)造成二次污染。相比之下，生物修復(fù)具有安全、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、去除效率高和無明顯的二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)。

許多研究表明，生物表面活性劑在石油降解中有很好的促進(jìn)作用。不同微生物往往產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的表面活性劑，主要有糖脂、脂肽、多糖-蛋白絡(luò)合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。生物表面活性劑一方面可以增加非水溶性物質(zhì)的表面積，，提高碳?xì)浠衔锏娜芙舛葟亩谏锢?；另一方面表面活性劑可以產(chǎn)生大量的生物乳化劑從而有助于生物降解過程。這都可以大大的提高可降解石油細(xì)菌的生長能力并提高這些細(xì)菌對(duì)石油烴的利用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長代謝可引起的石油-水體系表面張力的減少，表面張力的減小可以增加石油在水中的溶解性以及分散性能，從而增加了石油-水的接觸面面積與離散程度以及細(xì)菌與石油的接觸面積，對(duì)細(xì)菌的石油降解有促進(jìn)作用。而溫度、pH與石油的降解密切相關(guān)，因?yàn)樗芍苯佑绊懳⑸锏纳L和活性。

因此本課題組通過在湘江挖沙船區(qū)域底泥篩選菌種，以期得到具有良好的產(chǎn)生物表面活性劑能力、乳化活性、降低液體表面張力能力且石油降解率更高的新菌株，為降解石油污染物修復(fù)環(huán)境提供更高效更多的菌株來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有良好的表面活性劑能力、乳化活性、降低液體表面張力能力且具有石油降解能力的新菌株J42。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出所述的蒂莫內(nèi)馬賽菌屬的新菌株在修復(fù)污染環(huán)境中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種具有良好的產(chǎn)生物表面活性劑能力、乳化活性、且具有石油降解能力的新菌株，所述新菌株名稱為：J42；

所述J42菌系從湘江挖沙船區(qū)域底泥分離，篩選，純化和培育出來，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為蒂莫內(nèi)馬賽菌屬，與Massiliatimonae strain UR/MT95同源性96％。

所述B11菌主要形態(tài)學(xué)特征為：橙黃色，圓形凸起，邊緣整齊，濕潤。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：從湘江挖沙船區(qū)域底泥中分離得到一株罕見的具有石油降解能力的蒂莫內(nèi)馬賽菌-新菌株J42，該菌株不僅具有良好的產(chǎn)生物表面活性劑能力而且具有良好的乳化活性和降低液體表面張力能力。

附圖說明

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

圖1為甲苯含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2培養(yǎng)液中甲苯含量隨時(shí)間變化情況；

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步具體的說明，但是本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)采集湘江挖沙船區(qū)底泥作為樣品，4℃冰箱保存。稱取供試土壤樣品30g接入100ml無菌水中，加入10g玻璃珠。放置于180rpm的恒溫?fù)u床中，振蕩30min。

2)振蕩完成后取出三角瓶，于室溫下靜置20min，取1ml上清液，在無菌條件下進(jìn)行10倍系列梯度稀釋至10^-7，分別取10^-3、10^-5、10^-7的三個(gè)濃度的稀釋菌懸液25μL涂布在事先涂布了甲苯的酵母固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，置于真空干燥器中室溫條件培養(yǎng)24h，待平板表面不再有水滴時(shí)倒置平板。

3)根據(jù)酵母培養(yǎng)基上菌落長出的時(shí)間以及菌落的形態(tài)的不同，從培養(yǎng)基平板上挑取單菌落劃線至固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。反復(fù)劃線培養(yǎng)細(xì)菌直至平板長出的單菌落形態(tài)完全一致，并且單菌落細(xì)菌菌體在顯微鏡下個(gè)體形態(tài)也完全一致則可確認(rèn)為純培養(yǎng)。

4)挑取已經(jīng)純化好的細(xì)菌，分別接種到含甲苯的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。培養(yǎng)前期在50ml體系的培養(yǎng)基中需加入500μL濃度為2％(w/v)的酵母粉溶液。傳代兩次后，不再加酵母粉溶液，得到能以甲苯為唯一碳源的，能在液體培養(yǎng)基中良好生長的目的菌株。

含甲苯的酵母固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制：吸取25μL甲苯轉(zhuǎn)移至酵母固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒將其均勻涂抹在培養(yǎng)基表面。

含酵母的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制：即在1L體系的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中多加入2.0g尿素和1.0g酵母。

固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配制：向液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入1.5％(W/V)的瓊脂。

其中，液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O 0.005g、微量元素1mL；其中，微量元素的配方為：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O 0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖液的配方為：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、用蒸餾水定容至1000mL，pH8.0。

實(shí)施例2

本發(fā)明的J42菌株形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)研究。

其中，本實(shí)施例用的LB培養(yǎng)基配方為：酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0g，pH 7.2-7.4。

將本發(fā)明得到的J42菌株接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，在30℃條件下倒置培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

所述新菌株形態(tài)學(xué)特征為：橙黃色，圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤。

菌種鑒定

取200μL的無菌EP管，向管中加入50μL無菌雙蒸水，再取少量本發(fā)明得到的J42菌株菌體懸浮于EP管中，最后用移液器反復(fù)吸打EP管內(nèi)液體使菌體充分混勻制成菌懸液。將菌懸液于PCR儀中99℃處理5min得到破壁菌懸液。用細(xì)菌16SrRNA通用引物(上游引物27f，下游引物1492r)擴(kuò)增純化菌株的16SrRNA。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30S，72℃延伸1.5min，72℃延伸10min后保存4℃狀態(tài)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴(kuò)增獲得了大約1600bp的單一條帶。從PCR反應(yīng)物體系中回收PCR擴(kuò)增條帶，送至長沙博尚生物測序。將測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。選取得分最高的同源序列保存菌株名與堿基序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

經(jīng)過測序，菌株J42的16S rDNA與Massiliatimonae strain UR/MT95同源性高達(dá)96％。

綜合形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA測序結(jié)果，可以確定該新菌株J42為蒂莫內(nèi)馬賽菌。

實(shí)施例3

菌株的表面活性劑產(chǎn)生特性研究

本實(shí)施例所用的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O0.005g、甲苯5g、微量元素1mL；其中，微量元素的配方為：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖液的配方為：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、用蒸餾水定容至1000mL，pH8.0。

選取石油降解菌新菌株B11，接種到液體培養(yǎng)基中，控制初始接種濃度為1O⁷cells/mL，恒溫空氣浴搖床中30℃，180rpm培養(yǎng)5天。五天后吸取細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行生物表面活性劑產(chǎn)生能力測試實(shí)驗(yàn)。具體步驟為：

向微量滴定板板蓋上滴加2μL的原油，并在室溫下放置1小時(shí)，之后向當(dāng)中加入5μL的細(xì)菌培養(yǎng)液。室溫條件下等待1分鐘，觀察細(xì)菌培養(yǎng)液液滴的形狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)液呈平鋪開狀且面積較大。由此可知，此細(xì)菌有良好的生產(chǎn)生物表面活性劑的能力。

實(shí)施例4

蒂莫內(nèi)馬賽菌J42乳化性

分別考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和菌濃度三個(gè)因素對(duì)細(xì)菌乳化活性大小的影響。

本實(shí)施例所用的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O0.005g、甲苯5g、微量元素1mL；其中，微量元素的配方為：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O 0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖液的配方為：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、用蒸餾水定容至1000mL，pH 8.0。

1)培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌乳化活性的影響

接入實(shí)施例1獲得的初始接種濃度為10⁷cells/ml的菌株J42，在pH值為6以及搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)溫度梯度為25℃、30℃和35℃的條件下液體培養(yǎng)5天。完成細(xì)菌培養(yǎng)后振蕩混勻細(xì)菌培養(yǎng)液，取當(dāng)中液體進(jìn)行乳化實(shí)驗(yàn)，具體步驟為：

分別向3個(gè)洗凈烘干的比色皿中各加入1ml的正十六烷，之后再分別加入對(duì)應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)液各1ml。均在室溫條件下高速震蕩混勻2min并靜置10min，分別觀察并記錄乳化層厚度與液體總厚度，并用它們的比值表示石油降解菌的在不同溫度下的乳化活性大小。

結(jié)果顯示J42菌在培養(yǎng)溫度為25℃、30℃和35℃時(shí)，其乳化活性分別為0％、47.76％和15.82％，培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)乳化活性效果最好，在偏低溫和偏高溫條件下細(xì)菌乳化活性都受到抑制。

2)培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌乳化活性的影響

接入實(shí)施例1獲得的初始接種濃度為10⁷cells/ml的菌株J42，在溫度30℃以及搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)基初始pH值梯度為6、7、8的條件下液體培養(yǎng)5天。完成細(xì)菌培養(yǎng)后振蕩混勻細(xì)菌培養(yǎng)液，取當(dāng)中液體進(jìn)行乳化實(shí)驗(yàn)，具體步驟為：

分別向3個(gè)洗凈烘干的比色皿中各加入1ml的正十六烷和對(duì)應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)液各1ml。高速震蕩混勻2min并靜置10min，觀察并分別記錄乳化層厚度與液體總厚度及它們的比值。

結(jié)果顯示J42菌在pH值為6、7和8時(shí)，其乳化活性分別為47.76％、57.48％和50.25％，表面在pH值為7時(shí)J42菌乳化效果最好。

3)菌濃度對(duì)細(xì)菌乳化活性大小的影響

接入實(shí)施例1獲得的初始接種濃度為10⁷cells/ml的菌株J42，在溫度30℃以及搖床轉(zhuǎn)速180rpm的條件下液體培養(yǎng)5天。完成細(xì)菌培養(yǎng)后10000rpm條件下離心15min，分離細(xì)菌菌體與上清液。以無菌水稀釋細(xì)菌菌體制備菌懸液，控制細(xì)菌稀釋后菌濃度為10⁶cells/ml、10⁷cells/ml和10⁸cells/ml，進(jìn)行乳化實(shí)驗(yàn)，具體步驟為：

結(jié)果表明J42菌在細(xì)菌濃度為10⁶cells/ml、1O⁷cells/ml和10⁸cells/ml時(shí)，其乳化活性分別為0％、10.00％和47.76％，菌濃度越高乳化活性越強(qiáng)。

由此可知，在30℃培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH為7且菌濃越大的情況下，J42菌具有良好的乳化活性。

實(shí)施例5

分別考察培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)液表面張力的影響。

本實(shí)施例所用的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O0.005g、甲苯5g、微量元素1mL；其中，微量元素的配方為：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O 0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖液的配方為：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、用蒸餾水定容至1000mL，pH8.0。

細(xì)菌表面張力實(shí)驗(yàn)開始前，先用全自動(dòng)表/界面張力儀測定實(shí)驗(yàn)材料的表面張力，具體步驟為：

先打開儀器電源開關(guān)和測定儀防風(fēng)門，用鑷子取下白金板掛鉤于酒精燈外焰上燒去白金板上面的雜質(zhì)，最后將白金板掛回儀器掛鉤上。再用去離子水洗干凈培養(yǎng)皿，烘干后倒入液體培養(yǎng)基使液面高度為3-7mm，放置于白金板正下方平臺(tái)上。接著關(guān)上防風(fēng)門，待白金板掛鉤穩(wěn)定不動(dòng)后按下去皮鍵，數(shù)據(jù)顯示屏顯示數(shù)值穩(wěn)定后再按下“向上”，等待出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。讀出實(shí)驗(yàn)結(jié)果后按“向下”，等白金板脫離液體后按“停止”結(jié)束實(shí)驗(yàn)。重復(fù)測量3次，取平均值作為液體培養(yǎng)基的表面張力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基在加入甲苯前，表面張力為72.16mN/m。

1)培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌乳化活性大小的影響

接入實(shí)施例1獲得的初始接種濃度為10⁷cells/ml的菌株J42，在pH值為6以及搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)溫度梯度為25℃、30℃和35℃的條件下液體培養(yǎng)5天。完成細(xì)菌培養(yǎng)后，10000rpm條件下離心15min，分離細(xì)菌菌體與上清液。收集離心后上清液用于表面張力測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示J42菌在培養(yǎng)溫度為25℃、30℃和35℃時(shí)，培養(yǎng)五天后培養(yǎng)液的表面張力分別為34.86mN/m、53.35mN/m和46.71mN/m。結(jié)果表明培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)對(duì)降低液體表面張力有明顯作用。

2)培養(yǎng)基不同初始pH值條件下細(xì)菌培養(yǎng)液的表面張力

接入實(shí)施例1獲得的初始接種濃度為10⁷cells/ml的菌株J42，在溫度30℃以及搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)基初始pH值梯度為6、7、8的條件下液體培養(yǎng)5天。完成細(xì)菌培養(yǎng)后，10000rpm條件下離心15min，分離細(xì)菌菌體與上清液。收集離心后上清液，用于表面張力測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示J42菌在培養(yǎng)基初始pH值為6、7和8時(shí)，培養(yǎng)五天后培養(yǎng)液的表面張力分別為53.35mN/m、54.18mN/m和54.39mN/m。表面J42菌具有一定的降低表面張力的能力。

由此可知J42菌株在25℃及特定條件下具有明顯的降低液體表面張力的作用。

實(shí)施例6

新菌株J42對(duì)甲苯單體的降解應(yīng)用

本實(shí)施例用的LB培養(yǎng)基配方為：酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0g，pH 7.2-7.4。

本實(shí)施例所用的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O0.005g、甲苯5g、微量元素1mL；其中，微量元素的配方為：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖液的配方為：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、用蒸餾水定容至1000mL，pH 8.0。

取一定量分析純的甲苯試劑，溶解于分析純甲醇中，分別配制成濃度為10，20，30，40，50，60μg/ml的甲苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾后用于實(shí)驗(yàn)。用高效液相色譜法進(jìn)行甲苯標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甲苯在C18的液相色譜柱中的保留時(shí)間為9.18min。以峰面積為縱坐標(biāo)、苯濃度為橫坐標(biāo)，甲苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到甲苯標(biāo)準(zhǔn)方程為：y＝-8.388+2.717x。

將上述甲苯單體馴化保存的J42單菌落接種到LB培養(yǎng)基中活化48h后得到富集菌液，用來進(jìn)行甲苯單體的降解實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中由于甲苯有一定的揮發(fā)性，所以樣品需取樣后立即分析，而且一旦打開鋁蓋就不能再度將培養(yǎng)瓶放回?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)。所以實(shí)驗(yàn)時(shí)J42菌設(shè)置五個(gè)重復(fù)，其培養(yǎng)條件均為：初始接種濃度10⁷cells/ml，溫度30℃，pH值為6，搖床轉(zhuǎn)速180rpm。培養(yǎng)第2、4、6、8、10天時(shí)各打開一個(gè)瓶子進(jìn)行高效液相色譜，檢測當(dāng)中甲苯的含量。同時(shí)在設(shè)置1個(gè)空白試驗(yàn)，即培養(yǎng)條件與上述培養(yǎng)一致，唯獨(dú)不接種細(xì)菌。在搖床中放置1、10天時(shí)，檢測當(dāng)中甲苯含量。

圖2中第0天時(shí)的數(shù)據(jù)來自于空白對(duì)照第1天時(shí)的甲苯含量。由圖2知J42菌處理甲苯水溶液時(shí)，在第8天時(shí)水中檢測不出甲苯含量。圖中顯示降解甲苯的速率先快后慢，可能原因?yàn)殡S著細(xì)菌的生長代謝細(xì)菌產(chǎn)生的生物表面活性劑越來越多、乳化活性也越來越強(qiáng)，導(dǎo)致甲苯在水溶液的溶解度加大，而隨著甲苯含量的降低，揮發(fā)的氣體甲苯也開始重新回到溶液當(dāng)中，從而被B11細(xì)菌降解掉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明J42菌對(duì)溶液中甲苯的降解達(dá)到100％。

實(shí)施例7

本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述新菌株對(duì)石油廢水中COD的降解應(yīng)用，如下：

將上述甲苯單體馴化的J42菌以10⁷cells/ml的接種量接種到100ml 10％原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm的條件下培養(yǎng)7天。

所述10％原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基：即在900ml體系的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入100ml原油。

所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括：碳酸鹽緩沖液1000mL、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NH₄Cl 0.5g、Na₂HPO₄0.5g、CaCl₂·6H₂O 0.01g、FeSO₄.7H₂O 0.005g、微量元素1mL。

所述碳酸鹽緩沖液包括：Na₂CO₃0.105g、NaHCO₃0.756g、pH8.0與蒸餾水1000mL。

所述微量元素包括：ZnSO₄·7H₂O 0.44g、CuSO₄·5H₂O 0.20g、MnSO₄·2H₂O0.17g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.10g、CoCl₂·6H₂O 0.08g、蒸餾水1000mL。

每隔一天從各瓶吸取1.5ml菌懸液于1.5ml的EP管中12000rpm離心吸取上清液1ml于10ml比色管中，分別加入9ml蒸餾水稀釋。先稱取0.12g HgSO₄于消解管，加入50ul H₂SO₄和450ul H₂O震蕩至消解。加入6ml H₂SO₄與Ag₂SO₄混合溶液，再加入1ml K₂CrO₄溶液，加入3ml樣品(空白管加入3ml蒸餾水)混勻，置于消解儀165℃消解15分鐘。再在消解儀中冷卻2分鐘取出繼續(xù)冷卻后，加入3ml H₂O，混勻，至沉淀(管內(nèi)溶液無明顯漂浮顆粒)測量COD值。比色皿潤洗晾干后加入空白管中溶液，COD測量儀顯示屏點(diǎn)擊空白鍵，再點(diǎn)擊測量鍵，此時(shí)COD值顯示為0。依次加入各樣品于比色皿中測量COD值。

測定結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)J42菌在處理煉油廢水時(shí)在第七天COD值由6030mg/L降低到3290mg/L，COD去除率在第七天接近50％，并且COD降解率有進(jìn)一步提高可能。

通過以上實(shí)例，表明新菌株J42具有良好的產(chǎn)生物表面活性劑能力、乳化活性、降低液體表面張力能力且石油降解率高。