本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒的通用試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)，屬副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)。NDV只有一個(gè)血清型，病毒粒子呈多形性，直徑約為100～250nm，有囊膜的病毒粒子一般呈圓形，但常因囊膜破損而形態(tài)不規(guī)則。NDV為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA，全長(zhǎng)約15.2kb。在NDV基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)，其中F、HN蛋白與NDV的致病性密切相關(guān)。F蛋白具有使病毒囊膜與宿主細(xì)胞融合，進(jìn)而病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞作用。核苷酸序列分析表明，F(xiàn)蛋白基因編碼一個(gè)由553個(gè)氨基酸組成的多肽。F蛋白首先以非活性前體F0(68KD)的形式存在，此時(shí)無(wú)融合活性，當(dāng)其經(jīng)高爾基體運(yùn)輸時(shí)被裂解為由二硫鍵連接的F1(55.OKD)+F2(12.5KD)后，才使得病毒具有感染力，可以看出F蛋白與NDV的致病性密切相關(guān)。

傳統(tǒng)的NDV檢測(cè)方法主要有血凝和血凝抑制(HI)試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和病原分離。確診通常需要接種雞胚進(jìn)行病毒分離，有時(shí)還需要進(jìn)行病毒毒力測(cè)定以及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等。病毒分離方法，對(duì)采集病料的時(shí)機(jī)和病料的新鮮程度要求較高，且檢測(cè)周期往往要幾周以上，具有明顯的局限性。

生物技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，疾病的診斷、病原的檢測(cè)已從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平。NDV分子結(jié)構(gòu)與致病性關(guān)系研究的日益深入為副粘病毒的診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)不同致病性毒株存在的分子結(jié)構(gòu)差異，相繼建立了特異、快速的分子診斷技術(shù)，包括單克隆抗體技術(shù)、核酸探針技術(shù)、限制性核酸內(nèi)切酶分析、基因片段的體外擴(kuò)增技術(shù)和寡核苷酸指紋圖譜技術(shù)等。這些技術(shù)不僅應(yīng)用于NDV的檢測(cè)、鑒定和特性研究及致病性的檢測(cè)，還可以追蹤病毒的來(lái)源及流行情況。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性基因片段的技術(shù)，在疾病的檢測(cè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)能夠選擇性地將NDV基因組的一個(gè)特異性短片段放大10萬(wàn)倍以上，極大地增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性。1991年Jestin首次發(fā)展了NDV的RT-PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增F蛋白基因的238bp的目的片段。Veronique(1991)等用RT-PCR方法擴(kuò)增出約275bp的F基因產(chǎn)物并繪制酶切圖譜，證明這些病毒株都具有NDV的共同抗原表位。Seal等(1995)用PCR擴(kuò)增M基因和F基因裂解位點(diǎn)編碼片段，通過(guò)對(duì)病毒分子進(jìn)行同源進(jìn)化分析，并預(yù)測(cè)了每株病毒的致病性。Kant(1998)利用4條引物配成三對(duì)，分別對(duì)通過(guò)組織勻漿提取的NDV-RNA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果擴(kuò)增出362bp、254bp、254bp的三個(gè)目的片段。該方法不需要接種雞胚，24h之內(nèi)便可出結(jié)果，為NDV診斷提供了技術(shù)手段。大量研究結(jié)果證明，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)NDV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增不失為一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供特異性引物用于檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒的試劑盒。

本發(fā)明以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中NDV-La Sota株(GenBank登錄號(hào)為JF950510)基因組序列作為參考，上游引物在4988nt-5006nt之間，下游引物在5428nt-5448nt之間。在眾多備選的引物中，經(jīng)過(guò)多次篩選，比對(duì)試驗(yàn)，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物對(duì)。

本發(fā)明提供的優(yōu)選的特異性引物對(duì)，其序列為：

上游引物為5’-GCCAACATCCT(C/T)CGGCT(C/T)A-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物為5’-TAGGTGGCACGCATATTATTT-3’(SEQ ID NO.2)。

提取樣本總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA后，利用上述引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用下列反應(yīng)程序：起始變性94℃5min，30個(gè)循環(huán)(94℃45s，54℃45s，72℃30s)，最后經(jīng)過(guò)72℃10min延伸，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測(cè)目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為NDV陽(yáng)性，否則為陰性。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)在制備檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒試劑盒中的應(yīng)用。

含有SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對(duì)的檢測(cè)試劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

含有SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對(duì)的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒其PCR階段的工作程序?yàn)椋?4℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明的上述試劑盒是對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)后，擴(kuò)增產(chǎn)物若有461bp大小的條帶，則待測(cè)樣本中含有雞新城疫病毒。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒的非診斷目的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

(2)利用SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對(duì)對(duì)步驟(1)的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待測(cè)樣本中是否有雞新城疫病毒。

其中，步驟(2)中陽(yáng)性樣本擴(kuò)增的目的片段為461bp。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，1)擴(kuò)增的目的片段位于NDV F蛋白的保守區(qū)，長(zhǎng)度為461bp，敏感性好、操作方便、對(duì)不同基因型的NDV均有較好檢出(通用性)；2)將NDV病毒樣本cDNA進(jìn)行10倍系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行10000倍稀釋后利用本方法仍能檢測(cè)到NDV特異性條帶，表明該方法具有較高的靈敏度；3)該方法對(duì)其它常見(jiàn)禽病病原，如禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，沒(méi)有交叉反應(yīng)，表明該方法亦具有良好的特異性；4)本發(fā)明方法適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進(jìn)行NDV的檢測(cè)，具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點(diǎn)，可在6h內(nèi)對(duì)臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。此方法適合大批量臨床樣本的分析與檢測(cè)，對(duì)NDV的早期快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查研究提供技術(shù)手段。

附圖說(shuō)明

圖1是最佳擴(kuò)增引物篩選電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：Marker II；1：引物1(461bp)；2：引物2(442bp)；3：引物3(566bp)；4：引物4(499bp)；5：引物5(554bp)。

圖2是RT-PCR反應(yīng)最佳退火溫度篩選電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：Marker II；1：52℃；2：53℃；3：54℃；4：55℃；5：56℃。

圖3是RT-PCR反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)篩選電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：Marker II；1：27循環(huán)；2：28循環(huán)；3：29循環(huán)；4：30循環(huán)；5：31循環(huán)；6：32循環(huán)。

圖4是根據(jù)新城疫F基因繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，●顯示用于本方法通用性檢測(cè)的不同基因型毒株。

圖5是對(duì)不同基因型雞新城疫病毒進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。加樣順序?yàn)镸：DNA Maker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：BJ14(基因VI型)；2：La Sota(基因II型)；3：aSG10(基因VII型)；4：F48E8(基因IX型)。

圖6是對(duì)該引物檢測(cè)雞新城疫病毒的靈敏度電泳結(jié)果。加樣順序?yàn)镸：DNA maker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍。

圖7為采用現(xiàn)有技術(shù)的引物進(jìn)行RT-PCR通用性檢測(cè)結(jié)果，樣品順序：M：Marker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：PPMV-1(基因VI型)；2：La Sota(基因II)；3：aSG10(基因VII型)；4：F48E8(基因IX)。

圖8為采用現(xiàn)有技術(shù)的引物進(jìn)行RT-PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果，樣品順序：M：Marker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍。

圖9是對(duì)其它常見(jiàn)禽病病原進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。其中M：DNA Maker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：H5亞型禽流感病毒；2：H7亞型禽流感病毒；3：H9亞型禽流感病毒；4：傳染性支氣管炎病毒(IBV)；5：傳染性法氏囊病毒(IBDV)；6：禽呼腸孤病毒(REOV)；7：禽腺病毒(FAdV)；8：傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

下列實(shí)施例中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，參見(jiàn)Sambrook等編寫(xiě)的分子克隆。儀器的使用參照儀器操作說(shuō)明。LEGEND MICRO 17R低溫臺(tái)式離心機(jī)，為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；VS-1渦旋振蕩器購(gòu)自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S組織研磨震蕩器購(gòu)自鼎昊源科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制劑(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍體積的反應(yīng)緩沖液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和隨機(jī)引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，購(gòu)自北京愛(ài)普銳晟科技有限公司；DEPC處理水，購(gòu)自北京明豪至遠(yuǎn)有限公司。Marker II DNA Ladder購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京誠(chéng)茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；HW·SYII-KP3型電熱恒溫水槽購(gòu)自北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。

本發(fā)明實(shí)施例中選用的生物材料如下：禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒，新城疫病毒BJ14(基因VI型)、La Sota(基因II型)、aSG10(基因VII型)、F48E8(基因IX型)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院保藏和提供。

實(shí)施例1用于檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒的特異性引物的設(shè)計(jì)

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中NDV-La Sota株(GenBank登錄號(hào)為JF950510)基因組序列作為參考，設(shè)計(jì)特異性引物。在眾多備選的引物中(表1所示)，經(jīng)過(guò)多次篩選，比對(duì)試驗(yàn)，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，經(jīng)反復(fù)篩選和驗(yàn)證，最終獲得優(yōu)化后的引物對(duì)，各引物擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示。選擇擴(kuò)增目的條帶最亮，無(wú)非特異性雜帶的引物對(duì)1為最佳引物，上游引物在登錄號(hào)為JF950510序列的4988nt-5006nt之間，下游引物在5428nt-5448nt之間。

表1用于檢測(cè)不同基因型NDV備選引物序列

本發(fā)明提供的優(yōu)選特異性引物對(duì)，其序列為：上游引物：5’-GCCAACATCCT(C/T)CGGCT(C/T)A-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物：5’-TAGGTGGCACGCATATTATTT-3’(SEQ ID NO.2)。

實(shí)施例2檢測(cè)新城疫病毒的RT-PCR檢測(cè)方法最佳退火溫度的摸索

1、檢測(cè)樣品的預(yù)處理

(1)組織樣品處理：取100mg臟器組織樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用研磨器進(jìn)行研磨混懸，組織懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)分析。

(2)泄殖腔或口咽拭子樣品處理：將拭子樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用渦旋振蕩器振蕩混懸，樣品懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)。

2、樣品總RNA的提取

參照Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

3、反轉(zhuǎn)錄為cDNA

在0.2ml離心管內(nèi)加入下列成分：RNA溶液4μl，隨機(jī)引物1μl，輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反應(yīng)緩沖液 4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制劑 1μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC處理水7.5μl，輕輕混勻，37℃作用1h，得到樣本cDNA。

4、PCR檢測(cè)

利用實(shí)施例1最終確定的引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，設(shè)計(jì)不同的退火溫度梯度(52℃、53℃、54℃、55℃和56℃)對(duì)NDV進(jìn)行RT-PCR。在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，以不同退火溫度分別進(jìn)行如下反應(yīng)：起始變性94℃5min，94℃45s，(52℃、53℃、54℃、55℃和56℃)45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min，PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe，取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶長(zhǎng)度為461bp則證明待測(cè)樣品為NDV檢測(cè)陽(yáng)性，否則為檢測(cè)陰性。

電泳結(jié)果如圖2所示，54℃為擴(kuò)增目的條帶最亮，結(jié)合退火溫度過(guò)高不利于引物與模板結(jié)合，所以選擇該溫度為最佳溫度。

實(shí)施例3檢測(cè)新城疫病毒的RT-PCR檢測(cè)方法最佳循環(huán)數(shù)摸索

檢測(cè)樣品的預(yù)處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見(jiàn)實(shí)施例2對(duì)應(yīng)的方法。利用實(shí)施例1和2確定的條件，設(shè)計(jì)6個(gè)不同的循環(huán)數(shù)(27、28、29、30、31和32)對(duì)NDV進(jìn)行RT-PCR。

在0.2ml離心管中加入成分參見(jiàn)實(shí)施例2。輕輕混勻后，以不同循環(huán)數(shù)分別進(jìn)行如下反應(yīng)：起始變性94℃5min，94℃45s，54℃45s，72℃30s，進(jìn)行不同的循環(huán)數(shù)(27、28、29、30、31和32)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶461bp，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為雞新城疫病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則為雞新城疫病毒檢測(cè)陰性。電泳結(jié)果如圖3所示，30個(gè)循環(huán)數(shù)擴(kuò)增目的條帶與更多循環(huán)數(shù)亮度相似，且沒(méi)有非特異性雜帶，能節(jié)省時(shí)間、提高檢測(cè)效率，因此選擇其為最佳循環(huán)數(shù)。

實(shí)施例4檢測(cè)不同基因型雞新城疫病毒的RT-PCR檢測(cè)方法的建立

檢測(cè)樣品的預(yù)處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見(jiàn)實(shí)施例2對(duì)應(yīng)的方法。

在0.2ml離心管中加入成分參見(jiàn)實(shí)施例2。輕輕混勻后，以不同循環(huán)數(shù)分別進(jìn)行如下反應(yīng)：起始變性94℃5min，94℃45s，54℃45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶461bp，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為雞新城疫病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則為雞新城疫病毒檢測(cè)陰性。

利用上述方法分別對(duì)不同基因型(圖4所示)NDV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有較好的檢出，如圖5所示，表明本方法具有良好的通用性。

實(shí)施例5檢測(cè)雞新城疫病毒的RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性檢測(cè)

按照實(shí)施例4建立的方法進(jìn)行。將cDNA溶液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)♂尪葹?0、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分別以稀釋后的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。94℃預(yù)變性5min，94℃45s，54℃45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶461bp，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為雞新城疫病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則為雞新城疫病毒檢測(cè)陰性。

利用上述方法分別對(duì)雞新城疫病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)反轉(zhuǎn)錄的雞新城疫病毒cDNA稀釋10⁴倍后，仍能檢測(cè)到病毒DNA，如圖6所示，表明本方法具有良好的敏感性。

與現(xiàn)有技術(shù)雞新城疫病毒檢測(cè)方法的通用性、靈敏度比較

國(guó)標(biāo)GB/T 16550-2008的新城疫診斷技術(shù)推薦使用的引物序列：ND-535-F：ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC，ND-535-R：CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC。發(fā)明人采用上述引物對(duì)NDV進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7中1-4為不同基因型NDV毒株。與本發(fā)明實(shí)施例1確定的最佳引物相比，該文獻(xiàn)所用引物通用性差，未擴(kuò)增出PPMV-1(基因VI型)的目的片段。靈敏度結(jié)果見(jiàn)圖8，上述文獻(xiàn)推薦的引物僅能檢測(cè)到稀釋10³倍后的NDV cDNA，因此，其敏感性遠(yuǎn)不如本發(fā)明方法的敏感性(10⁴倍)。

實(shí)施例6檢測(cè)雞新城疫病毒的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)禽常見(jiàn)病病原的特異性檢測(cè)

利用實(shí)施例4建立方法對(duì)其它常見(jiàn)的禽病病原：禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示，結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照外，其他實(shí)驗(yàn)對(duì)象皆為陰性，表明本方法在檢測(cè)禽類(lèi)常見(jiàn)的其他病原體過(guò)程中，實(shí)施例4建立的方法針對(duì)不同基因型NDV具有良好的特異性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。