本發(fā)明屬于環(huán)境生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株抗銻細(xì)菌NXH2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著銻礦采集規(guī)模的不斷擴(kuò)大，以及銻工業(yè)中廢棄物的排放，導(dǎo)致礦區(qū)周邊的土壤受到嚴(yán)重的污染。作為環(huán)境污染物，銻及銻化物已被證實(shí)是一類具有基因毒性的物質(zhì)，并對人體具有致癌作用（Huangetal.,1998;Takahashietal.,2002;Beyersmannetal.,2008）。此外，銻還能導(dǎo)致肺損傷、血尿、纖維母細(xì)胞死亡、姐妹染色單體互換、循環(huán)系統(tǒng)疾病等（Huangetal.,1998）。銻已被美國環(huán)境保護(hù)署和歐共體理事會(huì)列為優(yōu)先治理污染物，也是日本環(huán)境廳密切監(jiān)測的污染物。近年來，我國銻的污染狀況越來越嚴(yán)重，逐漸受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。同時(shí)，銻礦的采冶活動(dòng)同時(shí)會(huì)導(dǎo)致與銻伴生的重金屬元素如砷、汞等進(jìn)入礦區(qū)表生環(huán)境，污染了礦區(qū)農(nóng)田，不僅影響農(nóng)作物生長，降低農(nóng)作物質(zhì)量。對礦區(qū)的土壤也造成了很大的破壞。研究如何修復(fù)礦區(qū)土壤已成為亟待解決的難題。雖然銻對于人類來說具有很高的毒性，但一些微生物卻能夠在濃度極高的環(huán)境下生長，甚至可以利用這種元素作為能源物質(zhì)，或者是將毒性較高的Sb(Ⅲ)氧化為毒性較弱的Sb(Ⅴ)，由此，污染土壤的微生物修復(fù)理論及修復(fù)技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生（騰應(yīng)等，2007）。微生物可以通過菌體對銻的外排、高毒性的Sb（Ⅲ）的氧化成低毒性的Sb（Ⅴ）、微生物對銻的甲基化、菌體吸附等方式降低銻對菌體及環(huán)境的毒性。抗銻1971年，Lyalthova，首次報(bào)道了1株銻氧化細(xì)菌，該菌株能夠把三價(jià)的銻氧化成五價(jià)的銻為自身提供能量（Lyalthova,1971)。之后陸續(xù)有少量關(guān)于抗銻微生物的報(bào)道，總之，到目前為止己經(jīng)報(bào)道的抗銻微生物的種類相對還較少，因此，篩選具有銻抗性的微生物是實(shí)現(xiàn)銻污染修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。目前關(guān)于抗銻微生物的篩選及應(yīng)用方面的相關(guān)研究報(bào)道不多，劉成佐（2012）篩選到一株耐銻微生物，經(jīng)鑒定為青霉菌，其耐銻濃度為600mg/L。本發(fā)明專利中的菌種為克雷伯氏菌（Klebsiella）中的一株細(xì)菌，其抗銻效果明顯高于已經(jīng)報(bào)道的青霉菌。且該克雷伯氏菌具有植物促生功能，能夠產(chǎn)生IAA、鐵載體和ACC脫氨酶，對植物具有一定的促生效果；同時(shí)對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2+等多種重金屬具有很強(qiáng)的抗性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一株具有高度抗銻的細(xì)菌，經(jīng)16SrDNA測序分析，結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiellasp.），菌株編號(hào)為NXH2，該菌同時(shí)具有抗As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2等多種重金屬，以及促進(jìn)植物生長的特性。本發(fā)明的克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）NXH2，是從湖南省冷水江市錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤中分離篩選的菌種，最高能夠耐受銻濃度為3300mg/L的重金屬脅迫。菌株于2016年8月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCC（單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏編號(hào)為CGMCCNo.12896，經(jīng)檢測存活。在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后，其菌落特征是：乳白色至灰白色，圓形，邊緣完整，直徑約0.85mm，表面光滑，中央稍突起。其菌體細(xì)胞特征為：短桿菌，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢。將該菌株的16SrDNA序列通過PCR擴(kuò)增，獲得1400bp左右長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序公司進(jìn)行序列測定，將所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，該菌株與克雷伯氏菌屬（Klebsiella）中各菌同源性最高，相似度在98%以上。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及16SrDNA序列分析，該菌株確定為克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）。該菌株在含有不同濃度Sb（酒石酸銻鉀）的CDM固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察其生長情況，結(jié)果表明，該菌抗Sb能力極強(qiáng)，對三價(jià)銻耐受性達(dá)3300mg/L。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的菌種是從湖南省冷水江錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤中分離篩選出的一株高抗銻（Sb）細(xì)菌，經(jīng)鑒定該為克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）。本發(fā)明菌株除了具有很強(qiáng)的抗重金屬銻的特性，而且該菌株對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2+等重金屬具有很強(qiáng)的抗性，特別是對As3+的耐受濃度達(dá)到4000mg/L以上。同時(shí)該菌還具有植物促生功能，能夠產(chǎn)生IAA、鐵載體及ACC脫氨酶這三種植物促生因子，并對Sb污染土壤中的植物生長有促進(jìn)作用，例如對油菜生長具有一定的促進(jìn)效果。目前關(guān)于抗銻細(xì)菌的多種抗重金屬能力及促生效果方面的研究在國內(nèi)外還未見相關(guān)報(bào)道。因此，從礦區(qū)污染地篩選耐受重金屬的高抗促生微生物，對促進(jìn)當(dāng)?shù)刂脖簧L、緩解植物對重金屬的毒害具有重要意義。該菌在重金屬污染的礦區(qū)土壤的生物修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用潛力。附圖說明圖1本發(fā)明克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）的培養(yǎng)物。圖2本發(fā)明克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）的16SrDNA基因序列。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。實(shí)施例1抗銻細(xì)菌的分離篩選及抗Sb能力采集湖南省冷水江市錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤樣品，稱取上述新鮮土壤樣品100g，加入適量的酒石酸銻鉀（[C8H4K2O12Sb2·3(H2O)]），使土樣中銻的最終濃度為1000mg/kg，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)一周。取上述土樣10g放于裝有10粒玻璃珠、并盛有90mL0.85%NaCl無菌溶液中，30℃，180rmin-1搖床中搖30min，使樣品充分散開。取0.1mL涂布到CDM培養(yǎng)基上（CDM培養(yǎng)基配方：MgSO4·7H2O2.0g，NH4Cl1.0g，Na2SO41.0g，K2HPO40.013g，CaCl2·2H2O0.067g，Na-lactate5.0g，瓊脂15.0g，加蒸餾水至1000mL，pH7.2），其中CDM培養(yǎng)基中以酒石酸銻鉀為脅迫因子，使最終培養(yǎng)基中銻的濃度為50μM，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，每天觀察其生長狀況。將上述初步分離出的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化獲得純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將篩選所得的菌株接種于LB培養(yǎng)基中（LB培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000mL，pH7.2），活化24h，取2mL轉(zhuǎn)入裝有100mLLB液體培養(yǎng)基的250mL三角中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，以未接種的LB液體培養(yǎng)基為對照，選擇600nm的波長，用酶標(biāo)儀測定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的光密度值(OD600)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌的生長曲線，以了解菌株的生長周期，為后期進(jìn)一步研究菌株對Sb、As等重金屬的耐受性、抗性及促生效果的研究適宜生長周期的菌體。向CDM培養(yǎng)基中添加Sb儲(chǔ)備液，使培養(yǎng)基中的Sb的終濃度分別為1、2、4、6、8和10mmol/L及以上濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次提高重金屬濃度，將斜面保存的抗Sb菌株在LB培養(yǎng)液中活化24h，在固體培養(yǎng)基上分離純化出單菌落，再轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)濃度Sb的固體培養(yǎng)基上，觀察菌株生長情況，能夠抑制菌株生長的最低濃度為該菌株的最低抑菌濃度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)。通過上述分離篩選，獲得若干抗Sb細(xì)菌，大多數(shù)株菌在48h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株對數(shù)期為6h-36h。其中，本發(fā)明菌株（編號(hào)為NXH2）生長較快，在36h后就進(jìn)入穩(wěn)定期，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)24h的菌體進(jìn)行研究。通過測定Sb對分離菌株最低抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)菌株NXH2對Sb的抗性非常高，最低抑菌濃度達(dá)28mM，折合成質(zhì)量濃度大致為3300mg/L。實(shí)施例2NXH2菌株的鑒定將該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征以及16SrDNA的序列測序分析。16SrDNA分子鑒定按照以下步驟進(jìn)行：挑取篩選菌株的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)，在24h取出培養(yǎng)液，5000r/min離心1min取上清液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司提供），提取菌落DNA；通用引物27F和1492R對提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R序列為5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行序列分析，并進(jìn)行同源性比較。NXH2菌株的菌體形態(tài)特征如下：短桿菌，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，菌落特征如下：在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后，其菌落特征是：乳白色至灰白色，圓形，邊緣完整，直徑約0.85mm，表面光滑，中央稍突起，見圖1。該菌16SrDNA基因序列長度為1411bp，將基因序列提交到Genbank上，進(jìn)行同源性比較，然后采用MEGA6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株的種屬。結(jié)果表明該序列與克雷伯氏菌屬（Klebsiella）中各菌的16SrDNA基因序列相似度最高，達(dá)98%以上，同時(shí)結(jié)合菌落形態(tài)特征、菌體顯微特征確定NXH2菌株為克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.），其16SrDNA基因序列如圖2所示。該菌于2016年8月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCC（單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏編號(hào)為CGMCCNo.12896。實(shí)施例3：克雷伯氏菌NXH2對多種重金屬的耐受性分別配制含有不同濃度As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2重金屬的CDM固體培養(yǎng)基，Cd2+、Cr6+、Hg2重金屬濃度從100mg/L起，依次為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L，As3+濃度從100mg/L起，依次為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L，以不加重金屬的處理作為對照。將克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）NXH2菌株接種到不含重金屬的CDM培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24h，取0.1mL分別接種于含有不同種類、不同濃度重金屬的培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)24h，觀察菌體在含有各種類、不同濃度重金屬的培養(yǎng)基中生長情況，結(jié)果見表1。從表中可以看出，NXH2菌株對上述幾種重金屬均具有較強(qiáng)的耐受性，對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2的耐受濃度分別為4000mg/L，1200mg/L，1600ml/L和800mg/L。表1克雷伯氏菌NXH2在不同重金屬濃度下的生長情況注：“+”表示生長良好；“-”表示不生長；“+/-”表示能長，但生長不良。實(shí)施例4克雷伯氏菌NXH2的植物促生特性具有植物促生作用的微生物往往通過向環(huán)境中分泌吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid,IAA）、產(chǎn)生鐵載體和ACC脫氨酶，起到促進(jìn)植物生長的效果。通過以下實(shí)驗(yàn)操作，可以驗(yàn)證克雷伯氏菌NXH2具有植物促生特性。產(chǎn)生IAA的功能鑒定方法如下：在培養(yǎng)微生物的特定液體培養(yǎng)基加入0.5g/LL-色氨酸（約2.5mmol/L）后高溫滅菌，用牙簽將株菌株挑入液體培養(yǎng)基，放在恒溫培養(yǎng)搖床內(nèi)30℃培養(yǎng)24小時(shí)，吸取2mL菌液，2mL菌液中加入2mLSalkowski試劑（12gFeCl3，430mL98%H2SO4，570mLH2O）顯色。呈粉紅色的菌液則為陽性，說明此菌株產(chǎn)IAA。產(chǎn)生鐵載體的功能鑒定方法如下：配制CAS檢測培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)中將分離純化的菌株點(diǎn)在CAS檢測培養(yǎng)基上，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；通過觀察細(xì)菌分泌鐵載體形成的橙色暈圈的大小做定性篩選，橙色暈圈越大，說明菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)。ACC脫氨酶鑒定方法如下：配制DF培養(yǎng)基（DF培養(yǎng)基配方：KH2PO44g，Na2HPO46g，MgSO4·7H2O0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸2mL，檸檬酸2g，(NH4)2SO42g，蒸餾水定容至1L，pH7.2），用干凈牙簽將待測菌株挑入固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，再將菌株用干凈牙簽將待測菌株挑入轉(zhuǎn)接到無氮且含ACC的ADF培養(yǎng)基(以3mmol/LACC代替DF培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4為唯一氮源)中，放在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，在ADF培養(yǎng)基上能夠長出菌落的菌株，可以初步確定具有ACC脫氨酶活性。CAS檢測培養(yǎng)基配制方法如下：溶液a：將0.012gCAS（鉻天青S）溶于10ml蒸餾水中，再加入含有10mmol/LHCl2ml的1mmol/LFeCl3溶液；溶液b：取0.015gHDTMA（十六烷基三甲基溴化銨）溶于8mL蒸餾水中；染料溶液c：將溶液a緩慢加入溶液b中，輕輕晃動(dòng)，使得兩溶液互相混合均勻，得到染液c；將10×MM9鹽溶液：(Na2HPO430g，KH2HPO41.5g，NaCl2.5g，NH4Cl5g，雙蒸水500ml)20mL和哌嗪二乙醇磺酸6.04g加入有150ml的雙蒸水的潔凈三角瓶中，混勻后用50%的NaOH調(diào)節(jié)pH到6.8，并加入瓊脂粉3.2g，并得到培養(yǎng)基d。將染料溶液c、培養(yǎng)基d和1mmol·L-1CaCl2、1mmol·L-1MgSO4·7H2O,20%的葡萄糖分別滅菌（115℃，20min）,10%的酸水解酪蛋白過濾除菌后，都置于50℃水浴鍋保溫待用。分別量取上述0.2ml1mmol/LCaCl24ml，1mmol/LMgSO4·7H2O6ml，10%的酪蛋白氨基酸及2ml20%的葡萄糖，加入培養(yǎng)基d中再沿瓶壁加入染液c，充分混勻，即得藍(lán)色定性檢測培養(yǎng)基，然后按每皿30ml傾注于培養(yǎng)皿中，置于無菌操作臺(tái)待用。通過上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：克雷伯氏菌NXH2能夠產(chǎn)生IAA、鐵載體和ACC脫氨酶，具有潛在的植物促生功能。實(shí)施例5克雷伯氏菌NXH2對油菜生長的影響以北京某地區(qū)的農(nóng)田土為盆栽基質(zhì)。土壤風(fēng)干后過20目篩，測定含水量，以烘干土重20Kg稱取對應(yīng)風(fēng)干土重，把應(yīng)加入的銻的量配置成250mL溶液，與上述土壤充分混勻，使土壤中含銻濃度為20mg/Kg、50mg/Kg、100mg/Kg、250mg/Kg、500mg/Kg，以田間持水量70%加入相應(yīng)的去離子水，置于避光條件下平衡2個(gè)月，不加銻的為銻濃度為0mg/kg的處理為對照，平衡后的土壤裝盆，備用。實(shí)驗(yàn)前先選取一定數(shù)量顆粒飽滿，大小均勻的油菜種子放于10%雙氧水溶液中浸泡15min，然后用ddH2O沖洗干凈，消毒后的種子均勻的灑在鋪有三層紗布的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，待種子露白時(shí)選取發(fā)芽勢接近的種子播種于上述不同銻污染土壤中，每盆播種30粒，播種后每盆用噴壺接入約108CFU/g培養(yǎng)的菌液10mL，以不接菌的處理為對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。定期澆水，保持每天8h的光照，植株在溫室下生長14d后測量植物株高、根長。由表2可以看出：在不同銻濃度的土壤中，添加克雷伯氏菌NXH2的各處理油菜株高及根長均高于未加菌的處理，說明克雷伯氏菌NXH2在減輕銻對植物毒害、促進(jìn)植物生長方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。表2克雷伯氏菌NXH2對油菜株高及根長的影響Sb(mg/kg)不加菌株高加菌株高不加菌根長加菌根長012.4313.973.437.972013.2315.324.388.385013.7716.324.157.4810013.1714.933.686.4325012.7613.423.775.6250011.6812.683.386.92當(dāng)前第1頁1 2 3