本發(fā)明屬于生物
技術領域:
,涉及一種目標區(qū)域的捕獲方法,尤其涉及一種基于發(fā)卡結構的目標區(qū)域捕獲方法及其應用。
背景技術:
:基于二代測序的目標區(qū)域捕獲方法為生命科學研究及精準醫(yī)學帶來了強有力的技術手段。與全基因組測序相比,目標區(qū)域的捕獲富集測序極大的降低了成本,提高了對目標基因檢測的質量,減輕了冗余的數(shù)據(jù)分析過程。目前已開發(fā)了多種目標區(qū)域的捕獲策略,主要有多重PCR捕獲、固相芯片捕獲、液相探針捕獲及分子倒置探針捕獲等。多重PCR捕獲技術是應用較為廣泛的一種捕獲技術。該技術應用多對引物同時擴增多個目標區(qū)域進行測序。設計思路簡單,成本低廉,便于操作,靈敏度高。但是,大量引物對的相互干擾,往往產(chǎn)生大量非特異擴增,同時會出現(xiàn)某些捕獲區(qū)域擴增失敗的可能。固相芯片捕獲技術是將捕獲探針原位合成在DNA芯片上,通過與構建完成的文庫雜交,洗去非特異雜交文庫,保留捕獲區(qū)域后進行測序的技術。通常一個樣本需要一塊捕獲芯片,捕獲探針長度為60-90個堿基,捕獲區(qū)域為3-5Mb。該方法探針獲得簡單,捕獲區(qū)域大;但是操作復雜,實驗時間長,通量低,靈敏度低,需要大量樣本進行文庫構建后再捕獲。液相探針捕獲技術是基于固相探針合成方法的改進。該方法通過體外轉錄固相探針產(chǎn)生生物素標記的RNA探針,在溶液中進行雜交富集,獲得捕獲的目標區(qū)域。液相捕獲技術可以實現(xiàn)高通量樣本操作,捕獲特異性高;但是探針制作復雜,價格昂貴,RNA探針本身的易降解問題對操作要求高。分子倒置探針捕獲技術是基于酶學方法的改進。分子倒置探針由捕獲區(qū)域兩端特異性靶向序列和連接臂構成,由一種DNA聚合酶填補2條特異性靶向序列間的間隙從而環(huán)化,獲得目標捕獲區(qū)域。該方法無需將樣本事先機械打斷構建文庫,特異性高,操作簡便。但是分子倒置探針的獲得成本昂貴,且設計復雜。技術實現(xiàn)要素:解決的技術問題:為了克服現(xiàn)有技術的不足,獲得一種特異性強、靈敏度高,且能夠兼容高、低通量,成本低廉的目標區(qū)域捕獲方法,本發(fā)明提供了一種基于發(fā)卡結構的目標區(qū)域捕獲方法及其應用。技術方案:一種基于發(fā)卡結構的目標區(qū)域捕獲方法,包括以下步驟:第1步、向包含目標捕獲區(qū)域的基因組試樣中,加入至少一條上游引物,進行單向擴增反應并形成發(fā)卡結構;擴增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩沖液;第2步、將第1步的單向擴增產(chǎn)物置于冰上,冷卻;第3步、采用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產(chǎn)物進行消化,并利用磁珠富集法進一步純化,收集具有發(fā)卡結構的目標捕獲序列;第4步、向具有發(fā)卡結構的目標捕獲序列中加入至少一條下游引物,進行富集擴增,擴增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩沖液。優(yōu)選的,所述上游引物5’端為目標捕獲區(qū)域下游的反向互補序列,用于與單向擴增得到的目標捕獲區(qū)域下游退火形成發(fā)卡結構;上游引物3’端為目標捕獲區(qū)域上游特異性擴增序列,用于擴增目標捕獲區(qū)域;其中,上游引物5’端反向互補區(qū)域的Tm值大于55℃。優(yōu)選的,所述上游引物5’端反向互補區(qū)域的Tm值為70~80℃,且大于3’端特異性擴增序列的Tm值。優(yōu)選的,所述單鏈DNA外切酶具有3’-5’核酸外切酶活性或5’-3’核酸外切酶活性。優(yōu)選的,所述單鏈DNA外切酶為核酸外切酶I、核酸外切酶T或核酸外切酶RecJ。優(yōu)選的,所述下游引物為上游引物中5’端互補序列的部分序列。優(yōu)選的,所述下游引物為上游引物5’端互補序列中靠近3’端的序列。所述方法在核酸檢測領域中的應用。優(yōu)選的,所述方法用于檢測人BRCA1/2基因全部外顯子。進一步的,所述方法用于檢測人BRCA1/2基因全部外顯子采用的上游引物為SEQIDNO:1~41,下游引物為SEQIDNO:42~82。表1檢測人BRCA1/2基因全部外顯子的上游引物其中,引物5’端單下劃線的序列為下游捕獲區(qū)域反向互補序列,引物3’端雙下劃線的序列為上游捕獲區(qū)域特異性擴增序列。表2檢測人BRCA1/2基因全部外顯子的下游引物有益效果:(1)僅有上游引物3’端擴增的產(chǎn)物能與上游引物5’端形成發(fā)卡結構的捕獲區(qū)域,因而特異性強;(2)形成的發(fā)卡結構序列特殊,使得下游引物組可以對目標捕獲區(qū)域進行指數(shù)擴增,因而極少量基因組即可達到后續(xù)檢測需要,靈敏度高;(3)用于本方法的引物組可以通過DNA芯片技術合成引物池,因而可以同時檢測數(shù)千個目標區(qū)域,實現(xiàn)高、低通量的兼容;(4)本發(fā)明的方法設計簡單,僅需設計目標捕獲區(qū)域的上下游引物,避免固相或液相捕獲方法的設計大量全區(qū)域捕獲探針的麻煩;(5)所述方法無需采用生物素等物質標記引物,從而降低了檢測成本。附圖說明圖1是本發(fā)明目標區(qū)域捕獲方法的流程圖;圖2是實施例1中BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的捕獲電泳圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容,但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下,對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換,均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1分別捕獲BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子。為了完全覆蓋外顯子區(qū)域,分別設計了長度為510bp、1476bp和5100bp的捕獲區(qū)域,完全覆蓋了BRCA2基因的第8、第10、第11全外顯子。根據(jù)BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子序列,分別設計上游擴增引物和下游擴增引物:第8外顯子上游擴增引物序列為SEQIDNO:83(5’-3’):AACAGAGAGACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTAACAGCATCATCTGACTTTCCAACT引物5’端下劃線部分為下游捕獲區(qū)域反向互補序列,Tm值為69.8℃;引物3’端波浪線部分為上游捕獲區(qū)域特異性擴增序列,Tm值為59.8℃;第10外顯子上游擴增引物序列為SEQIDNO:84(5’-3’):CCATGTTTGAGTGACCTGATTCTAAACACTGGGAAGAACAGGAGAAGGGGTGACT引物5’端下劃線部分為下游捕獲區(qū)域反向互補序列,Tm值為71.2℃;引物3’端波浪線部分為上游捕獲區(qū)域特異性擴增序列,Tm值為60.6℃;第11外顯子上游擴增引物序列為SEQIDNO:85(5’-3’):ACTCTTAATTGTTAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACACCACTGTGCCCAAACACTACCTT引物5’端下劃線部分為下游捕獲區(qū)域反向互補序列,Tm值為69.2℃;引物3’端波浪線部分為上游捕獲區(qū)域特異性擴增序列,Tm值為59.3℃。第8外顯子下游擴增引物序列為SEQIDNO:86(5’-3’):GACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTA;Tm值為60℃;第10外顯子下游擴增引物序列為SEQIDNO:87(5’-3’):TGAGTGACCTGATTCTAAACACTGG;Tm值為60.4℃;第11外顯子下游擴增引物序列為SEQIDNO:88(5’-3’):TAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACAC;Tm值為58.6℃;捕獲BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的方法,包括以下步驟:第1步、向包含BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的基因組試樣中,加入上游引物SEQIDNO:83~85,進行單向擴增反應,形成發(fā)卡結構;擴增體系和程序分別如表3、4所示:表3反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5上游引物(10μM)0.5模板DNA(10ng)1sdH2O11總體積25表4步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃2min延伸472℃3min變性598℃2min退火670℃3min第2步、將第1步的單向擴增產(chǎn)物置于冰上,冷卻5min;第3步、采用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產(chǎn)物進行消化,消化的體系及條件如表5、6所示;并利用磁珠富集法進一步純化,收集具有發(fā)卡結構的目標捕獲序列;表5表6步驟溫度時間溫浴137℃30min第4步、向磁珠富集純化后的擴增產(chǎn)物中加入下游引物SEQIDNO:86~88,進行富集擴增,擴增體系和程序如表7、8所示。表7反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5下游引物(10μM)1純化產(chǎn)物11.5總體積25表8步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃1min延伸472℃3min返回步驟2循環(huán)30次5延伸672℃10min保持74℃10min將下游引物富集擴增后的目標片段進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2所示,BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子均被捕獲。實施例2同時捕獲BRCA1/2基因的全部外顯子,根據(jù)BRCA1/2基因的全部外顯子序列設計引物,上游引物序列為SEQIDNO:1~41,下游引物序列為SEQIDNO:42~82。一種捕獲BRCA1/2基因的全部外顯子的方法,包括以下步驟:第1步、向包含目標捕獲區(qū)域的基因組試樣中,加入上游引物,進行單向擴增反應,形成發(fā)卡結構;擴增體系和程序如表9、10所示;表9反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5上游引物組(每組分1μM)2.5模板DNA(10ng)1sdH2O9總體積25表10步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃2min延伸472℃3min變性598℃2min退火670℃3min第2步、將第1步的單向擴增產(chǎn)物置于冰上,冷卻5min;第3步、采用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產(chǎn)物進行消化,消化體系及條件如表11、12所示;并利用磁珠富集法進一步純化,收集具有發(fā)卡結構的目標捕獲序列;表11反應組分體積(μL)上述反應組分2510XReactionBuffer5ExonucleaseI(20U/μL)1sdH2O19總體積50表12步驟溫度時間溫浴137℃30min第4步、向具有發(fā)卡結構的目標捕獲序列中加入至少一條下游引物,進行富集擴增,擴增體系和程序如表13、14所示。表13反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix25下游引物組(每組分1μM)5純化產(chǎn)物20總體積50表14步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃1min延伸472℃3min返回步驟2循環(huán)15次5延伸672℃10min保持74℃10min將下游引物富集擴增后的目標片段采用illumina公司NexteraDNALibraryPrepKit進行文庫構建,并測序分析。結果如表15所示,一組樣本檢測結果中,目標基因的30X捕獲覆蓋度所占比例均大于99%,顯示基本能夠完全捕獲目標區(qū)域。表15目標基因捕獲的覆蓋度統(tǒng)計當前第1頁1 2 3