基于鉑納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定dna的電化學(xué)傳感器和測定dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于鉑納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器的制備方法及其應(yīng)用，將發(fā)卡DNA1自組裝在鉑納米粒子修飾金電極表面，當(dāng)有目標(biāo)物DNA2存在時，由于目標(biāo)物DNA2與組裝在金電極表面表面上的發(fā)卡DNA1部分互補配對，打開DNA1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；然后另外一條發(fā)卡DNA3鏈通過競爭配對雜交取代目標(biāo)鏈DNA2，目標(biāo)鏈DNA2被釋放下來，釋放的目標(biāo)鏈則繼續(xù)打開新的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如此的循環(huán)作用實現(xiàn)了目標(biāo)鏈DNA2的循環(huán)使用，結(jié)合制備的納米粒子電化學(xué)探針實現(xiàn)信號的放大，再利用制備好的電化學(xué)傳感器催化PAP與PQI之間的循環(huán)，實現(xiàn)了電化學(xué)信號的進(jìn)一步放大，利用環(huán)伏安法或DPV測定電流信號強度，根據(jù)測得電流信號強度，實現(xiàn)對目標(biāo)鏈DNA2測定。本發(fā)明的傳感器具有高的檢測靈敏度。
【專利說明】基于鉑納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和電化學(xué)傳感器領(lǐng)域，涉及基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA是生物體內(nèi)的遺傳分子。DNA的檢測通常與各種疾病的診斷相關(guān)，因此DNA檢測具有重要的研究意義。目前由于DNA檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對其他生物分子如蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)的檢測也可以轉(zhuǎn)化為對DNA的檢測。DNA檢測的方法很多，比如增強納曼散射技術(shù)(Wei, X.，Su, S.，Guo, Y.，Jiang, X.，Zhong, Y.，Su, Y.，F(xiàn)an, C.，Lee,S.T.and He, Y.(2013)A Molecular Beacon - Based Signal - Off Surface - EnhancedRaman Scattering Strategy for Highly Sensitive, Reproducible, and MultiplexedDNA Detection.Small, 9，2652-2652)，熒光技術(shù)(Su, S.，Wei, X.，Zhong, Y.，Guo, Y.，Su,Y., Huang, Q., Lee, S.-T., Fan, C.and He, Y.(2012) Silicon Nanowire-Based MolecularBeacons for High-Sensitivity and Sequence-Specific DNA Multiplexed Analysis.ACSNano, 6，2582-2590)，化學(xué)發(fā)光檢測(Hun, X.，Liu, F.，Mei, Z.H.(2013) Signal amplifiedstrategy based on target-1nduced strand release couplingcleavage of nickingendonuclease for the ultrasensitive detection of ochratoxin A.Biosensors andBioelectronics, 39:145-151)、電化學(xué)檢測(Kjaliman, T.Η.M., Peng, H., Soeller, C.Travas-Sejdic J.(2010)A CdTe nanoparticle-modified hairpin probe for direct andsensitive electrochemical detection of DNA)等。這些方法各有其有點，能不同程度的滿足對DNA檢測的要求，但方法或者靈敏度不高，或者這些方法復(fù)雜。與文獻(xiàn)報道的鉬納米粒子催化方法相比，本發(fā)明具有合成鉬納米粒子簡單，測定靈敏度高的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法。發(fā)明設(shè)計兩條發(fā)卡DNA，即DNAl和DNA3。將發(fā)卡DNAl自組裝在鉬納米粒子修飾金電極表面，當(dāng)有目標(biāo)物DNA2 (Target)存在時，由于目標(biāo)物DNA2與組裝在金電極表面上的發(fā)卡DNAl部分互補配對，打開DNAl的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。然后另外一條發(fā)卡DNA3鏈通過競爭配對雜交取代目標(biāo)鏈DNA2，目標(biāo)鏈DNA2被釋放下來，釋放的目標(biāo)鏈則繼續(xù)打開新的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如此的循環(huán)作用實現(xiàn)了目標(biāo)鏈DNA2的循環(huán)使用，結(jié)合制備的納米粒子電化學(xué)探針實現(xiàn)了信號的放大。另外，由于要檢測的目標(biāo)物DNA2濃度一般都極低，所以本發(fā)明還提出了利用制備好的電化學(xué)傳感器催化PAP與PQI之間的循環(huán)，實現(xiàn)了電化學(xué)信號的進(jìn)一步放大用于DNA的測定，從而實現(xiàn)了對目標(biāo)鏈DNA2的聞靈敏度測定。
[0004]本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的:基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法，其特征包括以下步驟:[0005](I)制備金納米粒子；
[0006](2) 二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)制備；
[0007](3)制備 DNA 修飾 Fc-AuNPs 探針；
[0008](4)制備鉬納米粒子；
[0009](5)制備電化學(xué)傳感器；
[0010](6)利用制備的傳感器對DNA進(jìn)行測定,構(gòu)建測定DNA的方法；
[0011](7)利用所建立的方法，對樣品進(jìn)行檢測。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金納米粒子制備包括以下步驟:把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等玻璃儀器用王水泡30min，用二次水沖洗烘干后備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入50mL ImM的HAuCl4,并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，此時溶液由無色變?yōu)榫萍t色。再加熱lOmin，攪拌15min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0013]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)制備包括以下步驟:把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等制備和儲備金屬納米粒子的所用的玻璃儀器用王水(HCl =HNO3 = 1:3)浸泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。首先，將Img Fe加入到2mL0.1OmoI/LNHS 和 0.1OmoI/L EDC 的 0.20mol/L PBS (pH7.40)溶液中，將此混合溶液在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)2h。然后向混合溶液中加入2mL金納米粒子溶液，室溫下反應(yīng)24h后離心(13000r/min，30min)，沉淀用PBS洗滌三次，以除去未反應(yīng)的Fe，最后將沉淀用水溶解分散，即得二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)，在4°C下避光儲存?zhèn)溆?br> [0014]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的DNA修飾Fc-AuNPs探針制備包括以下步驟:取2mL的樣品管，依次加入 1.5 μ L500mM 的 Tris-HCl，6 μ LlOmM 的 TCEP，7.2 μ LlOO μ M 的DNA4, 7.2 μ LlOO μ M的巰基已胺，室溫放置30min后加入ImL制得的Fc-AuNPs，室溫下反應(yīng)12h。然后在10000r/min下離心30min，棄去上清液，加入800 μ L Tris-HCl緩沖液洗3次，并用Tris-HCl緩沖溶液定容至lmL，即得DNA修飾Fc-AuNPs探針(即電化學(xué)探針)，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0015]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的鉬納米粒子制備包括以下步驟:把合成要用到的玻璃儀器如容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等用王水(HCl =HNO3 = 1:3)浸泡洗凈，用二次水沖洗烘干后備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HPtCl6,并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，此時溶液由黃色變?yōu)樽厣Ｔ偌訜醠Omin，攪拌30min，冷卻至室溫，即得鉬納米粒子(PtNPs)，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0016]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的電化學(xué)傳感器的制備包括以下步驟:(I)制備鉬納米粒子修飾金電極:取金電極經(jīng)0.2 μ m，0.03 μ m和0.05 μ m的a -Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，然后在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干。取5?20 μ L制備的PtNPs滴涂在金電極表面，置于避光處自然晾干，用二次水沖洗電極，得鉬納米粒子修飾的金電極(PtNPs/GE) ； (2)DNA的預(yù)處理:進(jìn)行發(fā)卡DNA的預(yù)處理。取一定量的0.1?10 μ M的巰基DNAl (或DNA3)于2mL離心管中，置于95 °C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNAl ； (3)制備電化學(xué)傳感器:取5?30 μ L經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)卡DNAl滴涂在PtNPs/GE表面，4°C下使其自組裝反應(yīng)24h。接著取10 μ LlOO μ M的巰基已醇封閉，得電化學(xué)傳感器。
[0017]優(yōu)選的，一種對DNA2檢測方法，其特征是:取5?20 μ L目標(biāo)物DNA2滴加到電化學(xué)傳感器的電極表面，37°C下孵育30min。取5?20 μ L發(fā)卡DNA3滴加到電極表面。37°C下孵育4h,孵育完成后用PBS沖洗兩次。最后,取5?50 μ L制備的電化學(xué)探針滴加到電極表面，37°C下繼續(xù)孵育lh。將電極插入0.5mL50mM的硼氫化鈉，1.75mL20mM的PNP和3.25mLPBS混合液中，采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極或修飾金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，利用循環(huán)伏安法或DPV測定電流信號強度，根據(jù)測得電流信號強度的變化，計算目標(biāo)鏈DNA2的濃度。
[0018]根據(jù)電流信號強度對DNA2進(jìn)行定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和信號關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]具體實驗原理如圖1所示。
[0020]不同電極測定目標(biāo)物DNA2時的電流信號強度比較如圖2所示。
[0021 ] 目標(biāo)物DNA2的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
[0022]分析性能如下:
[0023]本發(fā)明研究了不同濃度目標(biāo)物DNA2與電流信號強度之間的關(guān)系，得到了檢測目標(biāo)物DNA2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。
[0024]當(dāng)目標(biāo)物DNA2的濃度在0.2fM_700fM之間時，隨著目標(biāo)物DNA2濃度的變化，電流信號強度有明顯變化。經(jīng)計算得到檢測目標(biāo)物DNA2的非線性方程為y = -0.003x2+3.783x+21.90(7是體系的電流信號強度3是目標(biāo)物0嫩2的濃度，單位€1;11= 12，η表示同一濃度測定次數(shù)R = 0.9987)。目標(biāo)物DNA2的濃度在0.2fM?10.0fM范圍內(nèi)與電流信號強度呈一定的線性關(guān)系，其線性回歸方程是y = 7.401X+1.001，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.9990，檢測限是0.1fM(3 σ )。該測定方法的精密度通過對濃度為IOfM的目標(biāo)物DNA2進(jìn)行11次平行測定而計算得出，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.8%，表明本發(fā)明的測定方法有較好的重現(xiàn)性。
[0025]另外，金電極不經(jīng)過鉬納米粒子修飾，利用裸金電極直接固定發(fā)卡DNA1，其他步驟相同按本發(fā)明的方法制備電化學(xué)傳感器，然后利用其對目標(biāo)物DNA2進(jìn)行檢測，測定的檢測限為150fM。表明本發(fā)明提出的基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法具有高的靈敏度。所制備的鉬納米粒子修飾電極信號強度(1.520 μ A)是金電極不經(jīng)過鉬納米粒子修飾電極信號強度(0.0727 μ Α)的23倍(空白信號為0.0662 μ Α)(圖2)，增強效果較文獻(xiàn)報道6.66倍的效果要好(In situamplified electronic signal for determination of low—abundance proteins couplingwith nanocatalyst-based redox cycling.Juan Tang, Jun Zhou, Qunfang Li，DianpingTang, Guonan Chen and Huanghao YangChem.Commun.，2013，49，1530—1532)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1.基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的原理圖。
[0027]圖2.不同電極測定目標(biāo)物DNA2時的電流信號強度比較圖。㈧裸金電極對目標(biāo)物DNA2的響應(yīng)；(B)鉬納米粒子修飾電極對不含目標(biāo)物DNA2的響應(yīng)；(C)鉬納米粒子修飾電極對含目標(biāo)物DNA2的響應(yīng)。[0028]圖3.目標(biāo)物DNA2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)x是目標(biāo)物DNA2濃度，單位是fM，縱坐標(biāo)y是體系的電流信號強度。
【具體實施方式】
[0029]下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
[0030]實例:基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法。
[0031]1.實驗部分
[0032]1.1儀器與試劑
[0033]1.1.1儀器設(shè)備
[0034]CHI660B電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機，上海市安亭科學(xué)儀器廠；HS-3D型酸度計，上海雷磁儀器廠；實驗用三電極系統(tǒng):金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0035]1.1.2 試劑
[0036]三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，氯金酸(HAuCl4)，氯鉬酸(H2PtCl6)，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7),氧化鋁粉末U-Al2O3)均購自上海阿拉丁試劑公司；巰基已醇(HS- (CH2) 6-0H)，巰基已胺HS- (CH2) 6_NH2，三(羥甲基)氨基甲烷(Tri s)，對硝基苯酚(PNP)，二茂鐵甲酸(Fe)，硼氫化鈉(NaBH4),均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N_羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)購于Sigma。
[0037]PBS緩沖溶液是0.20M, pH = 7.4，其的配制方法是稱取0.2g KH2PO4,8.0g NaCl、
2.9g Na2HPO4.12H20 及 0.2g KCl 溶解于 IL 水中。
[0038]Tris-HCl緩沖溶液配置，稱1.576g Tris用IOOOmL蒸餾水溶解，用6M的NaOH調(diào)pH到8.2，即得。
[0039]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下:
[0040]優(yōu)選的DNA4 部分序列為:5' -TTT TTT ATT CGA TCC GGT GCT CTT ATG CCC-HS-3'
[0041]優(yōu)選的DNA2 部分序列為:5’ -CAA TAA CTA CCG GGC ATT ACT GGC CTT-3’ ；
[0042]優(yōu)選的DNAl 部分序列為:5’-SH-AAA GCC AGT AAT GCC CGG TAG TTA TTC CATCGT GTACAA TAA CTA CCG GGC ATA AGA GCA CCC TTG TAC-3，
[0043]優(yōu)選的DNA3部分序列為:5’_TAG TTA TTG TAC ACG ATG GAA TAA CTA CCG GGCATC CATCGT GTA C-3，；。
[0044]1.2金納米粒子的制備
[0045]把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等玻璃儀器用王水泡30min，用二次水沖洗烘干后備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入50mL，ImM的HAuCl4，并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的朽1檬酸鈉(Na3C6H5O7),此時溶液由無色變?yōu)榫萍t色。再加熱IOmin,攪拌15min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0046]1.3 二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)的制備
[0047]把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等制備和儲備金屬納米粒子的所用的玻璃儀器用王水(HCl =HNO3 = 1:3)浸泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。首先，將Img Fe加入到2mL含0.1OmoI/L NHS和0.1OmoI/L EDC的PBS溶液中，將此混合溶液在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)2h。然后向混合溶液中加入200mL金納米粒子溶液,室溫下反應(yīng)24h后離心(13000r/min，30min)，沉淀用PBS洗滌三次，以除去未反應(yīng)的Fe，最后將沉淀用水溶解分散，即得二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)，在4°C下避光儲存?zhèn)溆谩?br> [0048]1.4DNA修飾Fc-AuNPs探針的制備
[0049]取2mL 的樣品管，依次力卩入 1.5μ L500mM 的 Tris-HCl，6 μ LlOmM 的 TCEP,
7.2 μ LlOO μ M的DNA4，7.2 μ LlOO μ M的巰基已胺，室溫放置30min后加入ImL制得的Fc-AuNPs，室溫下反應(yīng)12h。然后在100001'/1^11下離心301^11，棄去上清液，加入80(^1^Tris-HCl緩沖液洗3次，并用Tris-HCl緩沖溶液定容至lmL，即得DNA修飾Fc-AuNPs探針(即電化學(xué)探針)，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0050]1.5鉬納米粒子的制備
[0051]把合成要用到的玻璃儀器如容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等用王水(HCl =HNO3 =1:3)浸泡洗凈，用二次水沖洗烘干后備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入50mL，ImM的HPtCl6,并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，此時溶液由黃色變?yōu)樽厣?。再加熱lOmin，攪拌30min，冷卻至室溫，即得鉬納米粒子(PtNPs)，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0052]1.6電化學(xué)傳感器的制備
[0053]1.6.1鉬納米粒子修飾金電極的制備
[0054]取金電極經(jīng)0.2μL?，0.03μπι和0.05μπι的a-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾
水沖洗干凈，然后在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干。取10 μ L制備的PtNPs滴涂在金電極表面，置于避光處自然晾干，用二次水沖洗電極，得鉬納米粒子修飾的金電極(PtNPs/GE)。1.6.2DNA 的預(yù)處理
[0055]進(jìn)行發(fā)卡DNA的預(yù)處理。取一定量的10-6Μ的巰基DNAl (或DNA3)于2mL離心管中，置于95°C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNA-Hl。
[0056]1.6.3電化學(xué)傳感器的制備
[0057]取10μ L經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)卡DNAl滴涂在PtNPs/GE表面，4°C下使其自組裝反應(yīng)24h。接著取10 μ L，100 μ M的巰基已醇封閉，得電化學(xué)傳感器
[0058]L7DNA 檢測
[0059]取IOyL目標(biāo)物DNA2滴加到電化學(xué)傳感器的電極表面，37°C下孵育30min。取10 μ L發(fā)卡DNA3滴加到電極表面。37°C下孵育4h，孵育完成后用PBS沖洗兩次。最后，取IOyL制備的電化學(xué)探針滴加到電極表面，37°C下繼續(xù)孵育lh。將電極插入0.5mL50mM的硼氫化鈉，1.75mL20mM的PNP和3.25mL PBS混合液中，采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極或修飾金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，通過循環(huán)伏安法或DPV測得電流的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和信號關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0060]1.8樣品分析
[0061]將含目標(biāo)物DNA2的樣品溶液按步驟1.7方法進(jìn)行實驗，根據(jù)電流信號強度和步驟
1.7所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可以獲取目標(biāo)物DNA2含量。
[0062]根據(jù)發(fā)明的方法對目標(biāo)物DNA2含量進(jìn)行了測定，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對方法進(jìn)行了評價，樣品測定回收率為98.9 - 104.3%，測定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在目標(biāo)物DNA2檢測中具有精密度高的特點。[0063]表1.樣品分析測定結(jié)果
[0064]
【權(quán)利要求】
1.基于鉬納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征包括以下步驟: (1)制備鉬納米粒子修飾金電極:取金電極經(jīng)0.2 μ m, 0.03 μ m和0.05 μ m的a -Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，然后在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干；取5~20 μ L制備的PtNPs滴涂在金電極表面，置于避光處自然晾干，用二次水沖洗電極，得鉬納米粒子修飾的金電極(PtNPs/GE)； (2)DNA的預(yù)處理:進(jìn)行發(fā)卡DNA的預(yù)處理，取一定量的0.1~10 μ M的巰基DNAl (或DNA3)于2mL離心管中，置于95°C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNAl ； (3)制備電化學(xué)傳感器:取5~30μ L經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)卡DNAl滴涂在PtNPs/GE表面，.4°C下使其自組裝反應(yīng)24h ;接著取10 μ LlOO μ M的巰基已醇封閉，得電化學(xué)傳感器； 其中:所述的鉬納米粒子制備包括以下步驟:把合成要用到的玻璃儀器如容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等用王水(HCl =HNO3 = 1:3)浸泡洗凈，用二次水沖洗烘干后備用；在IOOmL圓底燒瓶中加入50mL，0.1~50mM的HPtCl6,并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，此時溶液由黃色變?yōu)樽厣?；再加熱lOmin，攪拌30min，冷卻至室溫，即得鉬納米粒子(PtNPs)，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> 2.一種利用權(quán)利要求1制備的電化傳感器檢測DNA含量的方法，其特征在于:取5~20 μ L目標(biāo)物DNA2滴加到電化學(xué)傳感器的電極表面，37°C下孵育30min ;取5~20 μ L發(fā)卡DNA3滴加到電極表面；37°C下孵育4h，孵育完成后用PBS沖洗兩次；最后，取5~50 μ L制備的電化學(xué)探針滴加到電極表面，37°C下繼續(xù)孵育Ih ;將電極插入0.5mL50mM的硼氫化鈉，1.75mL20mM的PNP和3.25mL PBS混合液中，采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極或修飾金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，利用循環(huán)伏安法或DPV測定電流信號強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和信號關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線； 所述的 DNAl 的部分序列為:5’ -SH-AAA GCC AGT AAT GCC CGG TAG TTA TTC CATCGT GTACAA TAA CTA CCG GGC ATA AGA GCA CCC TTG TAC-3’ ； 所述的 DNA2 的部分序列為:5’ -CAA TAA CTA CCG GGC ATT ACT GGC CTT-3’ ；
所述的 DNA3 的部分序列為:5’ -TAG TTA TTG TAC ACG ATG GAA TAA CTA CCG GGCATC CATCGT GTA C-3，； 所述的 DNA4 的部分序列為:5' -TTT TTT ATT CGA TCC GGT GCT CTT ATGCCC-HS-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器在檢測DNA含量中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其中所述的金納米粒子制備包括以下步驟:把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等玻璃儀器用王水泡30min，用二次水沖洗烘干后備用；在IOOmL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4,并在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入5mL的38.8mM的檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，此時溶液由無色變?yōu)榫萍t色；再加熱lOmin，攪拌15min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，并放于4°C溫度下儲存?zhèn)溆谩?br> 5.一種利用權(quán)利要求2檢測DNA含量的方法，其中所述的二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)制備包括以下步驟:把容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等制備和儲備金屬納米粒子的所用的玻璃儀器用王水(HCl =HNO3= 1:3)浸泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用；首先，將 Img Fe 加入到含 2mL0.1OmoI/L NHS 和 0.1OmoI/L EDC 的 0.20mol/L PBS (pH7.40)溶液中，將此混合溶液在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)2h ;然后向混合溶液中加入2mL金納米粒子溶液，室溫下反應(yīng)24h后離心(13000rpm/min, 30min),沉淀用PBS洗漆三次，以除去未反應(yīng)的Fe，最后將沉淀用水溶解分散，即得二茂鐵修飾的金納米粒子(Fc-AuNPs)。
6.一種利用權(quán)利要求2檢測DNA含量的方法，其中所述的DNA修飾Fc-AuNPs探針制備包括以下步驟:取2mL的樣品管，依次加入1.5μ L500mM的Tris-HCl，6 μ LlOmM的TCEP，7.2 μ LlOO μ M的DNA4, 7.2 μ LlOO μ M的巰基已胺，室溫放置30min后加入ImL制得的Fc-AuNPs，室溫下反應(yīng)12h ;然后在10000r/min下離心30min，棄去上清液，加入800 μ LTris-HCl緩沖液洗3次，并用Tris-HCl緩沖溶液定容至lmL，即得DNA修飾Fc-AuNPs探針(即電化學(xué)探針)，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求2檢測DNA含量的方法，其特征在于所述PBS緩沖溶液是0.20M, pH =7.4，其的配制方法是稱取 0.2g KH2PO4,8.0g NaCl,2.9g Na2HPO4.12H20 及 0.2g KCl 溶解于IL水中，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6 所述的DNA修飾Fc-AuNPs探針制備，其特征在于所述Tris-HCl緩沖溶液配置，稱1.576g Tris用1000mL蒸餾水溶解，用6M的NaOH調(diào)pH到8.2，即得。
【文檔編號】G01N27/48GK104007152SQ201410273296
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】混旭, 柏莉, 謝國亮 申請人:青島科技大學(xué)