本發(fā)明屬于蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的促紅細(xì)胞生成素核酸適體及其制備方法。

背景技術(shù)：

EPO是促紅細(xì)胞生成素（ErythropoietEP）的英文簡(jiǎn)稱。人體中的促紅細(xì)胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。服用紅細(xì)胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加血流比溶度（即增加血液中紅細(xì)胞百分比）。這種藥物近年進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)。人體缺氧時(shí)，此種激素生成增加，并導(dǎo)致紅細(xì)胞增生。EPO興奮劑正是根據(jù)促紅細(xì)胞生成素的原理人工合成，它能促進(jìn)肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時(shí)間更長(zhǎng)。

促紅細(xì)胞生成素是對(duì)紅細(xì)胞的生成有增強(qiáng)作用的體液性因子。為分子量6-7萬(wàn)的糖蛋白，糖的含量多，已證明血和尿中都有它的存在。未分化的干細(xì)胞分化成紅細(xì)胞系干細(xì)胞（erythropoietEP responsive cell），促紅細(xì)胞生成素在此發(fā)揮作用，使之變?yōu)榍俺杉t細(xì)胞。對(duì)進(jìn)一步再成熟為成紅血細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，血紅蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促進(jìn)作用。一般在貧血和低氧狀態(tài)時(shí)，根據(jù)身體組織對(duì)氧的需要，促紅細(xì)胞生成素的供給量將增加，但在腎臟貧血時(shí)其含量則非常低。其生成器官和機(jī)制雖尚未清楚，可是作為某腎臟因子（renal erythropoietic factor）與血漿的基質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生腎小球的說(shuō)法是有力的。此外，起著相當(dāng)于促紅細(xì)胞生成素作用的因子中，促進(jìn)白細(xì)胞生成的有colony stimulatEPg factor，促進(jìn)血小板生成的為促血小板生成素，包括促紅細(xì)胞生成素在內(nèi)，統(tǒng)稱為造血促進(jìn)因子。

增加紅血球的數(shù)目，用于貧血、組織斷離、早產(chǎn)兒，用在癌學(xué)和血液學(xué)方面。用于治療慢性腎衰患者的貧血癥。治療最初1～3周觀察到血細(xì)胞比容增加，且與劑量成比例，在4～6周中血細(xì)胞比容水平在不同研究中可達(dá)30%～40%之間不等，患者的生活質(zhì)量提高，包括體力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對(duì)慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，使用本品也是有利的。

目前促紅細(xì)胞生成素的檢測(cè)方法有三大類：色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化；而且HPLC設(shè)備價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門的維護(hù)人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離EPO形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測(cè)游離型同型半胱胺酸，只能檢測(cè)血漿總糖化蛋白，用還原劑在37℃半小時(shí)卵育對(duì)血樣進(jìn)行還原處理。免疫學(xué)法需一小時(shí)以上才能出結(jié)果，操作步驟繁瑣，因?yàn)樾枰M(jìn)行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過(guò)程繁瑣，且檢測(cè)限低、產(chǎn)生誤差較大，價(jià)格昂貴，故得不到推廣。

核酸適配體是近年發(fā)展起來(lái)的一類新型識(shí)別分子，近年來(lái)受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對(duì)重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來(lái)；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子, 國(guó)內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí)體或核酸適配體等。SELEX 技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成) 文庫(kù),通過(guò)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過(guò)程), 并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù), 經(jīng)過(guò)多輪的循環(huán)選擇富集, 獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長(zhǎng)度一般為25~ 60 個(gè)核苷酸。

由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景, 盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少, 但應(yīng)用適體檢測(cè)球蛋白的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對(duì)于促紅細(xì)胞生成素的高效特異性識(shí)別研究還很缺乏，且針對(duì)于促紅細(xì)胞生成素的核酸適體及其篩選制備方法尚未見(jiàn)有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的促紅細(xì)胞生成素檢測(cè)技術(shù)的不足，填補(bǔ)還未見(jiàn)促紅細(xì)胞生成素的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種促紅細(xì)胞生成素核酸適體及其制備方法，本發(fā)明所提供的核酸適體命名EPO3。

本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的：一種促紅細(xì)胞生成素核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列其序列為：gtactgcata agtagctgag taagtcagtc ga。

以上所述促紅細(xì)胞生成素核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種：

（1）將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；

（2）權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；

（3）權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸；

（4）權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。

一種以上所述促紅細(xì)胞生成素核酸適體或其衍生物在識(shí)別、檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素，或者制備檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素的試劑盒方面的應(yīng)用。

為了使本發(fā)明公開充分，本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素核酸適體的制備方法步驟如下：

促紅細(xì)胞生成素核酸適體的制備方法包括以下步驟：

1） 合成單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù)：所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的兩端為固定序列，作為PCR擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)，中間為60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，庫(kù)容量10¹⁵以上。所述PCR引物為：

引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’

所述PCR引物2帶有5’端生物素標(biāo)記。

2）制備連接促紅細(xì)胞生成素的固相基質(zhì)：以微磁珠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法把促紅細(xì)胞生成素通過(guò)其羧基共價(jià)連接到微磁珠上。

3） 初次篩選目的寡核苷酸序列：將DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)與促紅細(xì)胞生成素混合，篩選除去DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中不結(jié)合和非特異結(jié)合促紅細(xì)胞生成素的寡核苷酸序列，回收特異結(jié)合促紅細(xì)胞生成素的核酸序列。

4） 制備次級(jí)單鏈DNA寡核苷酸庫(kù)：將步驟3中所得與促紅細(xì)胞生成素特異結(jié)合的寡核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)堿變性解鏈，過(guò)濾，純化，獲得次級(jí)DNA寡核苷酸庫(kù)，用于下一輪篩選。

5） 篩選并鑒定促紅細(xì)胞生成素核酸適體：將步驟4所得的次級(jí)單鏈DNA寡核苷酸庫(kù)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過(guò)15輪篩選后獲得目標(biāo)寡核酸序列?？寺〔y(cè)序所述目標(biāo)寡核酸序列，通過(guò)酶聯(lián)核酸適體吸附測(cè)定法鑒定其與促紅細(xì)胞生成素結(jié)合的特異性和親和力。

6） 所述促紅細(xì)胞生成素核酸適體可作為檢測(cè)試劑用于檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素。

本發(fā)明的有益效果如下：（1）所篩選到的核酸適體分子量小，無(wú)毒性，有利于分子探針的設(shè)計(jì)，易于合成與標(biāo)記；（2）核酸適體只特異的識(shí)別促紅細(xì)胞生成素，不結(jié)合非促紅細(xì)胞生成素和其它類促紅細(xì)胞生成素分子，結(jié)合促紅細(xì)胞生成素的能力是結(jié)合非促紅細(xì)胞生成素Hb的能力的20~80倍，可以成為鑒別促紅細(xì)胞生成素的試劑，提高檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，降低成本。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明核酸適體與促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合能力，圖1中橫坐標(biāo)為核酸適體DNA濃度，縱坐標(biāo)為解離常數(shù)(Kd)相對(duì)值，圖中EPO曲線表示核酸適體EPO3與促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合曲線，EP曲線表示核酸適體EPO3與非促紅細(xì)胞生成素（血紅蛋白EP）的結(jié)合曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施1 促紅細(xì)胞生成素特異結(jié)合的核酸適體EPO3的制備

構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù)：人工合成單鏈DNA序列，構(gòu)建庫(kù)容量為1×10⁵的單鏈DNA隨機(jī)序列寡核苷酸庫(kù)，單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)包括的DNA序列為：

5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA-N_25~40-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3’

所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的DNA序列包括中間隨機(jī)序列N_25~60和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列N_25~40為30~40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為：5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA，3’-CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述兩端固定序列為PCR擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)

1）將0.5ml (1x10⁹ 微粒) Invitrogen公司的帶有活化氨基的微磁珠與1 mol/L促紅細(xì)胞生成素在偶聯(lián)緩沖液（20mM 磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, 1mM DTT, pH 5.5）中混合，加入200ul偶聯(lián)劑溶液 [57% 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)]，將上述反應(yīng)置于25oC條件下輕混24小時(shí)。將藕連促紅細(xì)胞生成素的磁珠用磁珠分離裝置和清洗液（PBS，1mM DTT， 批H7.3）清洗后，重新懸浮于0.5ml PBS中。

2）將5nmol單鏈DNA文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, 1 mM CaCl2,0.02% Tween 20, 1 mM DTT），進(jìn)行加熱處理：90 oC加熱10min，置于冰上10min，然后溫度放置5min。

3）將處理好的單鏈DNA文庫(kù)與結(jié)合有類促紅細(xì)胞生成素的微磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的液體。

4）將步驟3）收集的液體與25ul步驟1）得到的促紅細(xì)胞生成素-磁珠一起在結(jié)合緩沖液中37oC溫育30min。

5）用結(jié)合緩沖液洗滌溫育后的磁珠，然后加入200ul洗脫緩沖液（20 mM Tris-HCl pH7.6, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA），92oC孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

6）PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94oC預(yù)變性5 min; 94oC 30s，47oC 1min，72oC 1min, 擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)；最終延伸反應(yīng)為72oC 10min。

7）PCR產(chǎn)物為5’端帶有生物素標(biāo)記的雙鏈DNA，將產(chǎn)物與鏈霉親和素磁珠混合，25oC孵育30min后，用0.15 mol/L NaOH使雙鏈DNA變性為單鏈DNA，通過(guò)脫鹽柱純化即得到下一輪篩選的單鏈DNA文庫(kù)。

8）使用200pmol步驟7）得到的新單鏈DNA文庫(kù)，重復(fù)進(jìn)行步驟2）至步驟8）的篩選程序，共進(jìn)行15輪篩選。最后克隆并測(cè)序第15輪單鏈DNA文庫(kù)，得到EPO3核酸序列：gtactgcata agtagctgag taagtcagtc ga。

實(shí)施例2 以流式分析法檢測(cè)核酸適體EPO3與促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合能力

1）合成5’端帶熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記的促紅細(xì)胞生成素核酸適體。

2）使用0 nml/L, 5 nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, 100 nml/L, 200 nml/L濃度梯度的FAM標(biāo)記的核酸適體連接促紅細(xì)胞生成素(EPO)的微磁珠來(lái)測(cè)定促紅細(xì)胞生成素核酸適體的解離常數(shù)（kd）。用200μL結(jié)合緩沖液稀釋的上述各種濃度核酸適體，加入150 nmol/L連接促紅細(xì)胞生成素的微磁珠, 37oC溫育30min。用結(jié)合緩沖液洗滌磁珠后，重新懸浮在250μL結(jié)合緩沖液中。設(shè)置隨機(jī)序列的寡核苷酸片段和連接血紅蛋白(EP)的微磁珠作為對(duì)照。

3）使用BD公司的流式細(xì)胞儀對(duì)微珠進(jìn)行熒光測(cè)定，然后用Sigma plot軟件作圖，計(jì)算出所篩選到的核酸適體與同型半胱氨酸相互作用的解離常數(shù)（kd）相對(duì)值，結(jié)果如圖1所示。

序列表

<110> 柳州立潔科技有限公司

<120> 高靈敏度興奮劑核酸適體EPO3及其制備方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtactgcata agtagctgag taagtcagtc ga 42