本發(fā)明涉及一種溫度傳感器及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物對溫度的應(yīng)激反應(yīng)的能力是必不可少的，如熱休克蛋白和分子伴侶蛋白，在各種熱冷沖擊響應(yīng)中起作用，對生物體感應(yīng)溫度變化的響應(yīng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)節(jié)作用?；赗NA的溫度響應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，利用了單股的自然趨勢RNA分子在溫度響應(yīng)中改變二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致RNA穩(wěn)定性或翻譯率改變。以RNA為基礎(chǔ)的溫度傳感器在細菌體內(nèi)是常見的。大自然產(chǎn)生的RNA熱敏元件，是經(jīng)過長期的溫度誘導(dǎo)，有很長的序列，在較低溫度下核糖體結(jié)合位點形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。這些熱敏元件包含對RNase酶裂解位點，原產(chǎn)于大腸桿菌和許多其他生物，存在于靶基因的5^/端非編碼區(qū)。在低溫度，裂解位點形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)隱退，基因表達通暢。在高溫，裂解位點閥桿展開，允許對mRNA的降解，無法表達基因序列。

熱阻遏RNA功能有各種溫度傳感器機制。例如，RpoS的表達在大腸桿菌中受DsrA的調(diào)控。DsrA可以采取兩種結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，其中一個(F形式)將結(jié)合到目標(biāo)Mrna并將RBS暴露。在較低的溫度下，F(xiàn)形式增加了穩(wěn)定性，熱阻遏表達目標(biāo)基因。然而，兩種形式之間的穩(wěn)定性差異機制是未知的。另一被研究的熱阻遏RNA熱敏傳感器是大腸桿菌的CSPAmRNA。

這些自然產(chǎn)生的RNA的溫度傳感器，很難在工程系統(tǒng)中實現(xiàn)應(yīng)用。例如，RpoS機理復(fù)雜，研究的甚少，而CSPA熱敏傳感器非常大的而且需要CSPA編碼序列的參與。這些特性阻礙了它們在生物學(xué)中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在設(shè)計長度短、機制簡單的RNA熱敏元件，這些熱敏元件的響應(yīng)在不同的溫度下存在差異。在較低的溫度下，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在高溫下，發(fā)夾是不穩(wěn)定的，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。

本發(fā)明提供4條RNA熱敏元件，序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。

通過檢測熒光蛋白的表達強度分析上述RNA熱敏元件對于溫度的響應(yīng)情況。在枯草芽孢桿菌中表達時，在20℃、25℃、30℃、37℃條件下，熒光強度逐漸增強。在20℃條件下熒光強度最低，在37℃條件下熒光強度最高。如圖1所示，對照組在20℃、25℃、30℃、37℃條件下，熒光強度不發(fā)生變化。如圖2-5所示，熒光強度在不同的溫度下高低不同。

本發(fā)明還提供一種梯度RNA熱敏元件，由序列如SEQ ID NO.1～4所示的4個RNA組成。

本發(fā)明還提供一種調(diào)控蛋白表達的方法，是將目的基因RBS序列替換為編碼序列如SEQ ID NO.1～4任一所示的RNA熱敏元件的序列。在20-37℃范圍內(nèi)，采用不同RNA熱敏元件，實現(xiàn)不同溫度下的不同的蛋白表達量。

本發(fā)明還提供一種溫度傳感器，是含有序列如SEQ ID NO.1～4所示的RNA熱敏元件中的至少一種，或者含有編碼序列如SEQ ID NO.1～4所示的RNA熱敏元件中的至少一種的脫氧核糖核酸序列。將編碼所述標(biāo)記蛋白的基因的RBS序列替換為編碼序列如SEQ ID NO.1～4任一所示的RNA熱敏元件的序列，然后根據(jù)標(biāo)記蛋白的表達量可以提示當(dāng)前表達體系所處環(huán)境的溫度范圍。

所述標(biāo)記蛋白可以是綠色熒光蛋白。

本發(fā)明設(shè)計的長度短、機制簡單的RNA熱敏元件，這些熱敏元件響應(yīng)到具體到溫度。這些熱敏元件將在類似的溫度傳感器系統(tǒng)的建設(shè)中起到一定作用。同時，可應(yīng)用于理性調(diào)控細胞的代謝系統(tǒng)。

附圖說明

圖1是構(gòu)建的對照菌株在4種溫度下的熒光強度變化趨勢；

圖2是構(gòu)建的溫控序列1在4種溫度下的熒光強度變化趨勢；

圖3是構(gòu)建的溫控序列2在4種溫度下的熒光強度變化趨勢；

圖4是構(gòu)建的溫控序列3在4種溫度下的熒光強度變化趨勢；

圖5是構(gòu)建的溫控序列4在4種溫度下的熒光強度變化趨勢。

具體實施方式

實施例1質(zhì)粒構(gòu)建方法

綠色熒光蛋白因熒光性質(zhì)穩(wěn)定，大量表達對細胞沒有毒性，檢測方便的特點，我們選擇綠色熒光蛋白作為檢測熱敏元件的表達效果。以質(zhì)粒Phtc-gfp(該質(zhì)粒的構(gòu)建方法參見Sen Yang,Zhen Kang,Wenlong Cao,Guocheng Du,&Chen,2015)為模板，通過設(shè)計引物F、R0、R1、R2、R3、R4進行PCR，將原有RBS序列GATGCAGCTTAATAAAAGGTGGTGAACTACT分別替換為編碼如下(1)～(4)所示的設(shè)計的RNA熱敏元件的基因序列：

(1)GAUGUACCUUAAUAAAAGGUGGUGAACUACUAUG，

(2)GAUGUUACCUUAAUAAAAGGUGGUGAACUACUAUG，

(3)GAUGCUACCUUAAUAAAAGGUGGUGAACUACUAUG人工序列

(4)GAUGCUACCUAAAAAAGGUGGUGAACUACUAUG，以原有RBS序列作為對照。PCR產(chǎn)物磷酸化連接轉(zhuǎn)入E.coli JM109擴增，提純后轉(zhuǎn)入B.subtilis 168進行表達。

實施例2溫度傳感器的檢測

將長出的菌落挑入含3mL的卡納抗性的LB液體培養(yǎng)基中進行12h的培養(yǎng)，再將菌液按10％的接種量接入含200μL發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔平板，每個樣品做三個平行，分別加入4個96孔板中，在20℃、25℃、30℃、37℃條件下，轉(zhuǎn)速90rpm，培養(yǎng)48小時。每隔一段時間使用Synergy H4全功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光490nm，發(fā)射光530nm，Gain值是70，檢測高度7mm條件下測熒光強度，并在600nm波長下檢測菌體濃度，并繪制出熒光強度變化趨勢圖(如圖1至圖5所示)。圖2所示溫控序列1熒光強度變化趨勢可以看出，37℃的熒光強度比20℃熒光強度高15000，熒光強度增加1.9倍；圖3所示溫控序列2熒光強度變化趨勢可以看出，37℃的熒光強度比20℃熒光強度高3156，熒光強度增加2.2倍；圖4所示溫控序列3熒光強度變化趨勢可以看出，37℃的熒光強度比20℃熒光強度高9339，熒光強度增加3.3倍；圖5所示溫控序列4熒光強度變化趨勢可以看出，37℃的熒光強度比20℃熒光強度高19758，熒光強度增加10倍。可以看出，溫控序列4的溫控效果優(yōu)于溫控序列1、2和3，37℃的熒光強度與20℃的熒光強度相差最大，效果最好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種溫度傳感器及其應(yīng)用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gauguaccuu aauaaaaggu ggugaacuac uaug 34

<210> 2

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gauguuaccu uaauaaaagg uggugaacua cuaug 35

<210> 3

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaugcuaccu uaauaaaagg uggugaacua cuaug 35

<210> 4

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaugcuaccu aaaaaaggug gugaacuacu aug 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgcagctt aataaaaggt ggtgaactac t 31

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttcagcatc tatttatcac ataagatgac aattg 35

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatgcagctt aataaaaggt ggtgaactac tatgggtaag ggagaagaac ttttcac 57

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgtacctt aataaaaggt ggtgaactac tatgggtaag ggagaagaac ttttcac 57

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatgttacct taataaaagg tggtgaacta ctatgggtaa gggagaagaa cttttcac 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatgctacct taataaaagg tggtgaacta ctatgggtaa gggagaagaa cttttcac 58

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatgctacct aaaaaaggtg gtgaactact atgggtaagg gagaagaact tttcac 56