本發(fā)明涉及一種產(chǎn)堿性果膠酶的重組菌及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

果膠酶是一種復(fù)合酶，能夠?qū)⒐z聚合物分解成不飽和寡聚半乳糖醛酸。該酶分布廣泛，在部分寄生線蟲(chóng)、植物和微生物內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。果膠酶應(yīng)用廣泛，已有40多年的工業(yè)應(yīng)用史。根據(jù)最適反應(yīng)pH的不同將果膠酶分為酸性果膠酶和堿性果膠酶(Alkaline Polygalacturonate Lyase，PGL)，其中酸性果膠酶主要應(yīng)用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果實(shí)脫皮等方面。PGL應(yīng)用主要應(yīng)用于紡織、食品、造紙行業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域。應(yīng)用酶法作用上述領(lǐng)域相關(guān)反應(yīng)具有環(huán)保、節(jié)約原料耗材和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。然而目前對(duì)PGL進(jìn)行分子改造研究較少，進(jìn)行商品化的PGL也很少。

目前表達(dá)堿性果膠酶的宿主主要是畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。雖然通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化等手段可以有效提高堿性果膠酶的產(chǎn)量，但當(dāng)達(dá)到一定限度堿性果膠酶的產(chǎn)量不能進(jìn)一步提高，限制了堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此需從源頭解決限制堿性果膠酶表達(dá)的因素。

畢赤酵母宿主雖然具有表達(dá)蛋白易于純化等優(yōu)點(diǎn)，然而目前的堿性果膠酶在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，存在表達(dá)量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分適合于畢赤酵母宿主的問(wèn)題，從而限制了堿性果膠酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)，酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中存在的糖基化現(xiàn)象對(duì)堿性果膠酶的高效表達(dá)及性質(zhì)存在極大影響。

因此，有必要對(duì)堿性果膠酶糖基化位點(diǎn)的處理，進(jìn)一步提高堿性果膠酶生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力以更適應(yīng)工業(yè)化的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種糖基化位點(diǎn)刪除的堿性果膠酶，以及表達(dá)該堿性果膠酶的畢赤酵母基因工程菌。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種堿性果膠酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是所述基因編碼的堿性果膠酶。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述基因的載體或細(xì)胞系。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一株畢赤酵母基因工程菌，以pPIC9K為載體，表達(dá)SEQ ID NO.1所示的堿性果膠酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以Pichiapastoris GS115為宿主。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法是將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的堿性果膠酶基因與表達(dá)載體pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟如下：

(1)以基因K314Mopt(申請(qǐng)?zhí)枮?01610170070.0，公開(kāi)日為2016年7月13日的專利申請(qǐng)中公開(kāi))為起始基因，通過(guò)點(diǎn)突變改造堿性果膠酶基因PGL/N185Q，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將步驟(1)獲得的堿性果膠酶基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-N185Q；

(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒pPIC9K-N185Q轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115得到糖基化位點(diǎn)刪除的表達(dá)堿性果膠酶的基因工程菌株。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種搖瓶生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，是將所述的基因工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基中，發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是先將基因工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～24h后再轉(zhuǎn)接至含有占培養(yǎng)基體積7-10％的甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，于22-28℃、200～220rpm下誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中每24h添加終濃度為10-20mL/L發(fā)酵液的甲醇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述BMGY培養(yǎng)基每升含：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述BMMY培養(yǎng)基每升含：蛋白胨20g，酵母粉10g，70-100mL甲醇，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法在發(fā)酵罐中進(jìn)行，將所述基因工程菌在液體培養(yǎng)基中活化，將活化后的菌液以10～15mL菌液/100mL培養(yǎng)基的接種量接種于裝液量500～1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500～550r/min，通氣量為1.5～2vvm，控制pH 5.5-6.0，生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為28-30℃；當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加甘油，待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)1～2h，再流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并將溫度降低至22-28℃，攪拌轉(zhuǎn)速升高至900-1000r/min；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有12ml/L PTM₁的甲醇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有85％磷酸26.7ml/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM₁ 4.35ml/L。

本發(fā)明還提供所述堿性果膠酶在食品、紡織、環(huán)境、造紙方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：相對(duì)于未刪除糖基化位點(diǎn)的基因工程菌株，本發(fā)明的基因工程菌株P(guān)ichia pastoris GS115-N185Q在搖瓶水平上的酶活可達(dá)到566.4U/mL(96h)，提高了87.9％；在3L罐上22℃誘導(dǎo)時(shí)酶活提高143.14％，28℃誘導(dǎo)時(shí)酶活提高213.81％，達(dá)到2411.57U/mL，是現(xiàn)有報(bào)道的畢赤酵母中的最高水平，且實(shí)現(xiàn)了在28℃(相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的較高溫度)下高效表達(dá)，為堿性果膠酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明得到的堿性果膠酶可在堿性條件下催化通過(guò)反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷鍵裂解，廣泛應(yīng)用于食品、紡織和造紙等行業(yè)。

附圖說(shuō)明

圖1為不同點(diǎn)突變對(duì)PGL糖基化程度及分泌的影響；泳道1為K314Mopt；2-8分別為K314Mopt、N128Q、N185Q、N353Q、N128Q-N185Q、N128Q-N353Q、N185Q-N353Q、N128Q-N185Q-N353Q；

圖2為不同點(diǎn)突變對(duì)PGL胞外酶活及熱穩(wěn)定性的影響；

圖3為28℃誘導(dǎo)條件下K314Mopt及N185Q 3L罐發(fā)酵水平；a代表K314Mopt，b代表N185Q。

具體實(shí)施方式：

樣品預(yù)處理：發(fā)酵液8000rpm離心10min，胞外PGL即包含于發(fā)酵上清液之中，取一定量做檢測(cè)。

堿性果膠酶酶活測(cè)定：采用分光光度法測(cè)定，在235nm處測(cè)定吸光度值。

PGL反應(yīng)體系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol·L_-¹，0.44mmol·L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，待測(cè)樣品20μL，無(wú)活性的酶液為空白對(duì)照。

PGL反應(yīng)條件：將反應(yīng)體系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L^-1)終止反應(yīng)，在235nm處測(cè)定吸光度值。

單位酶活定義：?jiǎn)挝粫r(shí)間裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所用的酶量。

酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定：取離心后的發(fā)酵上清液，于55℃反應(yīng)30min，測(cè)定殘余酶活。

BMGY培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，商業(yè)YNB培養(yǎng)基13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

BMMY培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，70-100mL，商業(yè)YNB培養(yǎng)基13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

實(shí)施例1：重組菌的構(gòu)建及鑒定

以基因K314Mopt為起始對(duì)照基因，通過(guò)點(diǎn)突變改造形成糖基化位點(diǎn)刪除的堿性果膠酶基因PGL/N185Q，獲得如SEQ ID NO.1的堿性果膠酶基因，再設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法獲得堿性果膠酶基因N185Q，將其克隆至表達(dá)載體pPIC9K上，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-N185Q，將重組載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，經(jīng)篩選鑒定獲得重組菌株P(guān)ichia pastoris GS115-pPIC9K-N185Q。

引物如下：

PGL-F：GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTGATTTGGGTCATCAAACACTTG

PGL-R：AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTTCAATTTTCCAGCACCTGCT

采用電轉(zhuǎn)化法將基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞。具體步驟如下：挑取酵母受體菌的單菌落接種于25mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床過(guò)夜；以5％接種量轉(zhuǎn)接50mLYPD液體培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.3-1.5；4℃離心5000rpm，5min，棄上清；用50mL冰預(yù)冷無(wú)菌水將菌體重懸；4℃離心5000rpm，5min，棄上清；用25mL冰預(yù)冷無(wú)菌水將菌體重懸；4℃離心5000rpm，5min，棄上清；再用5mL 1mol·L^-1的冰預(yù)冷的山梨醇洗滌1次，重懸，4℃，5000rpm離心5min，棄上清；加入適量體積1mol·L^-1的冰預(yù)冷的山梨醇，重懸；分裝至無(wú)菌EP管中，每管80ul，以備轉(zhuǎn)化。將提取的共表達(dá)載體pPIC9K-PGL用酶Sal I線性化，在80μl酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入線性化的質(zhì)粒1-5μg冰上放置15分鐘，迅速加入0.2cm電擊杯中(冰預(yù)冷)，1500v電擊，迅速加入1mL冰預(yù)冷的山梨醇，涂MD平板，培養(yǎng)3-4天后挑取單克隆進(jìn)行下一步篩選。

采用上述相同的策略構(gòu)建刪除其他幾個(gè)糖基化位點(diǎn)的菌株N128Q、N353Q，及組合突變的菌株N128Q-N185Q、N128Q-N353Q、N128Q-N185Q-N353Q。

實(shí)施例2：基因工程菌株搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)方法：菌株在種子活化后接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)基YPD，于30℃、220rpm條件下培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接至優(yōu)化后的生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY培養(yǎng)基于30℃、220rpm條件下培養(yǎng)24h，再將菌株轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中22℃、220rpm，每24h添加1.5％(1.5mL甲醇/100mL發(fā)酵液)的甲醇，誘導(dǎo)堿性果膠酶的表達(dá)。

選用碧云天SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒配制12％分離膠和5％濃縮膠，具體操作方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。樣品與5×上樣緩沖液以體積比4:1混合，沸水浴10min，冷卻后上樣。電泳時(shí)，80V恒壓電壓，待指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)至150V，待指示劑至膠底時(shí)結(jié)束電泳。用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，染色1h后脫色。

SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，糖基化位點(diǎn)刪除的各突變株所表達(dá)的PGL蛋白條帶有不同程度的下移，說(shuō)明糖基化程度有不同程度緩解，在相同點(diǎn)樣量下重組菌GS115/N185Q、GS115/N185Q-N353Q及GS115/N128Q-N185Q-N353Q較GS115/K314Mopt分泌量有明顯增加。

搖瓶發(fā)酵及酶熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出重組菌GS115/N185Q、GS115/N185Q-N353Q及GS115/N128Q-N185Q-N353Q分別較GS115/K314Mopt胞外酶活提高87.9％，114.8％及101.4％，極大促進(jìn)了PGL的表達(dá)水平。但突變菌株堿性果膠酶熱穩(wěn)定性有所降低，如圖2所示，單點(diǎn)突變N128Q及N353Q殘余酶活分別為47.6％及7.43％，較K314Mopt的59.2％有所下降，組合突變N128Q-N185Q、N128Q-N353Q及N128Q-N185Q-N353Q 55℃保溫30min殘余酶活分別為14.5％、3.6％及3.7％，穩(wěn)定性下降更加明顯。而N185Q 55℃保溫30min殘余酶活分別為57.9％相比于K314Mopt的59.2％變化不大。

實(shí)施例3：基因工程菌株3L罐發(fā)酵

從平板上挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中30℃，220rpm培養(yǎng)24h，以10％接種量接種于包含800mL分批發(fā)酵培養(yǎng)基(85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM₁ 4.35mL/L)的3L發(fā)酵罐(美國(guó)NBS公司)中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500-550r/min，通氣量為1.5-2vvm，50％氨水及30％磷酸控制pH5.5，生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為28-30℃，當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加50％(w/v含12mL/L PTM₁)甘油。流加速率按下式計(jì)算：(t)為流加速率(L/h)，X₀為細(xì)胞密度(g/L)，V₀為初始體積(L)，S_f代表補(bǔ)料液中甘油濃度(g/L)，Y_X/S對(duì)底物細(xì)胞得率(g/L)，μ_set為設(shè)定的比生長(zhǎng)速率(h^-1)。其中μ_set為0.176h^-1，Y_X/S為0.435g/g，S_f為500g/L。

待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)1～2h，開(kāi)始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100％甲醇含12mL/L PTM₁)，同時(shí)溫度降低至22-28℃，攪拌轉(zhuǎn)速升高至900r/min，誘導(dǎo)PGL表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分階段流加方式：0-8h流速2mL/h，8-90h流速9.6mL/h，＞90h流速2mL/h。

對(duì)工程菌GS115/K314Mopt及GS115/N185Q進(jìn)行3L罐發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示，基因工程菌株GS115/N185Q28℃誘導(dǎo)時(shí)96h時(shí)酶活達(dá)到2411.57U/ml，較GS115/K314Mopt提高了213.81％，極大的提高了堿性果膠酶的表達(dá)水平。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。