本發(fā)明屬于中成藥質(zhì)量控制技術領域，具體涉及用SMRT測序技術及DNA條形碼分子鑒定技術監(jiān)測中成藥生物物種組成的方法。

背景技術：

現(xiàn)行版《中國藥典》對中成藥質(zhì)量控制的方法主要包括顯微鑒別、薄層色譜鑒別、含量測定、指紋圖譜等。然而，薄層色譜鑒別和含量測定僅可對中成藥中是否含有目標化學成分進行定性或定量監(jiān)測，無法判定該目標化學成分是來源于中成藥處方中的相應藥材或是人為添加。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的相對較短的DNA序列極性物種鑒定的一種分子生物學技術，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補充。2015年版《中國藥典》收載中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則，將其作為中藥材質(zhì)量控制方法之一，現(xiàn)已獲得廣泛應用。單分子測序技術，又稱第三代測序技術，包括單分子熒光測序和納米孔測序兩大類，如美國太平洋生物公司(Pacific Bioscience)的Pacbio RSII測序平臺，美國螺旋生物公司(Helicos)的Heliscope單分子測序平臺，英國牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)的MinION測序平臺等，均具有讀長長、速度快、精度高等特點。目前該技術主要應用于基因組測序、DNA甲基化研究、SNP檢測等方面。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成成分的監(jiān)測方法，該方法能夠?qū)ΜF(xiàn)有中成藥質(zhì)量控制方法進行有效補充，維護臨床用藥安全。

本發(fā)明的目的是通過以下技術措施來實現(xiàn)的：一種基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成成分的監(jiān)測方法，其包括如下步驟：

1)提取待檢樣品基因組DNA。

2)以上述DNA為模板，擴增其ITS2序列和psbA-trnH序列。

3)基于Pacbio RSII測序平臺，依照該平臺標準操作流程，對上述PCR產(chǎn)物進行文庫構建，并進行SMRT測序。

4)應用SMRT Analysis Server 2.3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程獲得環(huán)狀一致性序列(circular-consensus sequencing，CCS)，用CD-HIT軟件將CCS序列進行聚類，最終獲得可用于后續(xù)分析的ITS2和psbA-trnH序列。

5)將上述序列放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，進行BLAST比對，獲得物種鑒定結果。

擴增引物使用的ITS2序列引物，其序列為：

正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；

反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。

擴增引物使用的psbA-trnH序列引物，其序列為：

正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC

反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

上述引物用于擴增中成藥中各個藥材的ITS2序列和psbA-trnH序列。

本發(fā)明還提供含有上述引物的中成藥生物物種組成成分監(jiān)測相關試劑盒。

本發(fā)明方法適用性廣，能檢測所有能擴增出ITS2序列或psbA-trnH序列的中成藥樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)中成藥的生物物種組成成分的監(jiān)測，對現(xiàn)有中成藥質(zhì)量控制方法進行有效補充，維護臨床用藥安全。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明，而并非對發(fā)明的限定，依照本領域公知的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所做出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

1.材料：

試驗材料為中成藥九味羌活丸，本實施例所用材料為依照《中國藥典》中該中成藥處方的規(guī)定劑量及制法，在實驗室自制。此外，為驗證本方法的靈敏度，根據(jù)該處方中劑量最小的一味藥材細辛的用量，加入等量人參藥材作為陽性對照。

2.實驗步驟：

1)中成藥九味羌活丸處方由羌活、防風、黃芩、細辛、地黃、川芎、蒼術、白芷和甘草共9味中藥組成。本實施例所用到的各個藥材均已經(jīng)過形態(tài)學及DNA條形碼鑒定，以確保其物種的準確性，因蒼術和白芷未能獲得DNA條形碼序列，故由形態(tài)學鑒定其物種。依照《中國藥典》規(guī)定劑量及制法，將上述藥材及陽性對照藥材人參混合粉碎并過篩，制成丸劑。

2)DNA提取

取120mg上述樣品，用MM400高通量組織研磨儀(德國Retsch)研磨，用核分離液漂洗至上清液無色，用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA。

3)PCR擴增及產(chǎn)物回收

分別擴增所提取DNA的ITS2序列和psbA-trnH序列。擴增引物使用的ITS2序列正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。擴增引物使用的psbA-trnH序列正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC，由生工生物工程有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μL。

25μL反應體系：2×PCR MasterMix 12.5μL，正反向引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 20～100ng，加滅菌雙蒸水至25μL，進行PCR擴增。

PCR反應程序：在PCR儀上按照以下程序進行ITS2序列和psbA-trnH序列擴增反應：

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN N.V.，德國)進行切膠回收，獲得純化產(chǎn)物。

5)文庫構建、SMRT測序及數(shù)據(jù)處理

本實施例基于Pacbio RSII測序平臺，依照該平臺標準操作流程，對上述PCR產(chǎn)物進行文庫構建，并進行SMRT測序。

應用SMRT Analysis Server 2.3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程獲得環(huán)狀一致性序列(circular-consensus sequencing reads，CCS reads)，本實施例獲得ITS2序列和psbA-trnH序列。

6)物種鑒定

將上述序列放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，進行BLAST比對，獲得物種鑒定結果。本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風、細辛、川芎、地黃、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、川芎、黃芩、甘草以及陽性對照藥材人參。

ITS2序列與psbA-trnH序列結合，未能檢出蒼術、白芷，這與實驗步驟1)中DNA條形碼鑒定結果一致。

該結果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于實驗室自制中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例2

1.材料：

基本同實施例1，所不同的是沒有加入實施例1中的陽性對照藥材人參。

2.實驗步驟：

同實施例1。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風、細辛、川芎、地黃、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結合，未能檢出蒼術、白芷。與實施例1一致。

該結果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于實驗室自制中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例3

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準文號的中成藥九味羌活丸(批號：20141101)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、蒼術、細辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、防風、蒼術、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結合，未能檢出地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述兩個物種DNA降解嚴重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例4

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準文號的中成藥九味羌活丸(批號：20140501)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風、蒼術、細辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出川芎、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結合，未能檢出黃芩、地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述三個物種DNA降解嚴重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例5

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準文號的中成藥九味羌活丸(批號：20140501)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風、蒼術、細辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、蒼術、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結合，未能檢出地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述兩個物種DNA降解嚴重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。