本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL、SNP分子標記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大豆是高蛋白和高油作物，可通過與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮，來滿足大豆生長發(fā)育和繁殖對高氮的需求。在大豆生命周期中，萌發(fā)期和幼苗發(fā)育需要的氮素從子葉和土壤中吸收獲得；隨后大豆幼苗在低氮條件下可以很快和根瘤菌建立共生關(guān)系，結(jié)瘤數(shù)量不斷增多，共生固氮效率隨之增高，在生長后期，尤其是開花和鼓粒期達到最高。提高大豆固氮效率才是促進大豆生長，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵?？刂拼蠖购线m的結(jié)瘤數(shù)是實現(xiàn)大豆高效固氮的有效辦法。最適結(jié)瘤數(shù)下，固氮量占植物所需總氮量的95％。

然而現(xiàn)有技術(shù)中，對于大豆結(jié)瘤數(shù)的直觀鑒定費時費力，目前對可以用于大豆育種過程中父母本篩選的標記位點的研究較少，不利于高效結(jié)瘤性狀的大豆品種選育，因此有必要尋找一個可以有效反應(yīng)大豆結(jié)瘤數(shù)的QTL(數(shù)量性狀基因座位，quantitative trait locus)以及與其相關(guān)的SNP(單核苷酸的多態(tài)性)分子標記。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL、SNP分子標記，與大豆結(jié)瘤數(shù)性狀緊密相關(guān)，可以用于高效結(jié)瘤性狀的大豆品種選育。

本發(fā)明的目的是提供一種與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL，與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL位于7號染色體的M33594-M33587-M33586區(qū)間，由SNP分子標記M33594、M33587、M33586定位。

本發(fā)明還提供了一種與上述QTL緊密連鎖的SNP分子標記，所述SNP分子標記為M33594，M33594的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，M33594的擴增引物為：

M94F：5’-CGATCCTTTGTGAGTGTGGGT-3’，如SEQ ID NO.4所示；

M94R：5’-GCCGAATCGTGCTCACAAC-3’，如SEQ ID NO.5所示。

本發(fā)明還提供了一種與上述QTL緊密連鎖的SNP分子標記，所述分子標記為M33587，M33587的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，M33587的擴增引物為：

M87F：5’-TGGTAACCCAGACTCCCTTGC-3’，如SEQ ID NO.6所示；

M87R：5’-GTGGGTACCCTCCTTGGTCA-3’，如SEQ ID NO.7所示。

本發(fā)明還提供了一種與上述QTL緊密連鎖的SNP分子標記，所述分子標記為M33586，M33586的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，M33586的擴增引物為：

M86F：5’-AACCCAGACTCCCTTGCTTTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；

M86R：5’-GTTTGACAGGAGGATTGGCAA-3’，如SEQ ID NO.9所示。

本發(fā)明還提供了上述QTL在大豆結(jié)瘤數(shù)性狀選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述任一SNP分子標記，在大豆結(jié)瘤數(shù)性狀分子標記輔助選擇選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL，作圖區(qū)間M33594-M33587-M33586僅為0.659cM，距離很小，且篩選出的分子標記M33594、M33587、M33586均與大豆結(jié)瘤數(shù)的性狀緊密連鎖、顯著相關(guān)，可用于分子標記輔助選擇育種，能夠顯著提高高效結(jié)瘤材料的選擇效率，為進一步豐富大豆結(jié)瘤數(shù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一種最經(jīng)濟有效的分子育種新途徑。

附圖說明

圖1是位于7號染色體上的50-150cM遺傳圖譜部分與結(jié)瘤數(shù)有關(guān)的QTL的掃描結(jié)果；

圖2是位于7號染色體上M33594-M33587-M33586區(qū)間的遺傳圖譜及QTL作圖區(qū)間。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明提供的一種與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL，與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL位于7號染色體的M33594-M33587-M33586區(qū)間，由SNP分子標記M33594、M33587、M33586定位。具體按照以下方法獲得：

一、遺傳群體的構(gòu)建

以結(jié)瘤數(shù)多的大豆地方品種一千粒為母本，結(jié)瘤數(shù)少的長嶺野生豆為父本，進行有性雜交，F(xiàn)₁代選擇長勢良好，結(jié)實多的單株收獲，然后采用單粒傳法，繁種加代到F₅，接著單株收獲，次年種成株行，連續(xù)種植3代，獲得F_5:8家系，從中隨機選取200個家系進行遺傳圖譜構(gòu)建。

二、遺傳圖譜的構(gòu)建

1.用CTAB法提取上述親本及200個子代F_5:8家系的DNA，用Thermo nanodrop 2000檢測DNA濃度，并用1％瓊脂糖電泳檢測DNA的純度及完整性。

2.利用北京百邁客生物科技有限公司自主研發(fā)的SLAF-seq技術(shù)和HighMap軟件對2個親本和200個子代開發(fā)高密度分子標簽，進行遺傳圖譜構(gòu)建，具體步驟如下：

(1)基因組酶切：利用酶切預(yù)測軟件對已公布大豆參考基因組進行酶切預(yù)測，選擇內(nèi)切酶RsaI和HaeIII對檢測合格的各樣品基因組進行酶切，然后選擇基因組片段范圍在364-414bp的SLAF-seq片段。

(2)基因測序：對得到的SLAF-seq片段用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下進行3′端加A處理，連接Dual-index測序接頭，然后進行PCR擴增及PCR擴增產(chǎn)物的純化、切膠回收目的片段，并對回收的目的片段進行cDNA文庫質(zhì)檢，cDAN文庫質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM 2500進行測序。為評估建庫實驗的準確性，選用水稻(Oryza sativa)作為對照(Control)進行相同的處理參與建庫和測序。

所述PCR擴增使用的引物為F：AATGATACGGCGACCACCGA和R：CAAGCAGAAGACGGCATACG。

利用Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe，UK)進行PCR擴增產(chǎn)物的純化。

(3)SNP標簽與基因分型：根據(jù)測序Reads在參考基因組上的定位結(jié)果，利用GATK軟件進行局部重比對(Local Realignment)和變異檢測，同時采用samtools軟件進行變異檢測，取GATK軟件和samtools軟件兩種方法得到的交集變異位點等步驟，以保證檢測得到的SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)的準確性，最終篩選可用的SNP標簽為111399個。

(4)SNP標簽的篩選：為保證遺傳圖譜質(zhì)量，完整度低于70％及嚴重偏分離的SNP標簽被去除。為了避免染色體上的SNP標簽聚集現(xiàn)象對遺傳圖譜構(gòu)建過程中的影響，在進行遺傳圖譜構(gòu)建之前，對部分SNP標簽進行了去除冗余處理，對每個重疊群(contig/supercontig)，在一定大小的窗口(本實施例采用120kb)內(nèi)，取唯一一個SNP標簽測序深度均值最高的Marker代表該區(qū)段，用于后續(xù)分析，共計篩選出的4902個SNP標簽。

(5)連鎖分析：將(4)篩選出的4902個SNP標簽，通過與參考基因組的定位，將SNP標簽分為20個連鎖群，通過兩兩標簽之間計算MLOD值(距離指標)，共上圖4564個，定位為上圖標記(記作上圖Marker)。以連鎖群為單位，采用HighMap軟件將分析獲得連鎖群內(nèi)的上圖Marker進行線性排列，并估算相鄰上圖Marker間的遺傳距離，最終得到總圖距為3403.90cM的遺傳圖譜，圖1是位于7號染色體上的與結(jié)瘤數(shù)有關(guān)的QTL遺傳圖譜的50-150cM部分掃描結(jié)果。

三、人工接種鑒定親本及200個子代的結(jié)瘤數(shù)

1.試驗于2015年1月至2016年5月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院安普智能溫室進行了兩批次實驗。

2.大豆植株培養(yǎng)：以河沙作為栽培介質(zhì)，栽培桶高30cm、直徑25cm，每份材料3個桶，每桶4株。同期播種，出苗后，每隔10天澆1L無氮營養(yǎng)液。

3.接種根瘤菌鑒定結(jié)瘤數(shù)：待大豆對生真葉初步展開時，利用BNCC134953大豆慢生根瘤菌于每株大豆子葉節(jié)下的根部接種2mL活化的根瘤菌液，每毫升活化的根瘤菌液含有10⁷的根瘤菌，參照王宏光等(大豆科學(xué)，大豆根瘤菌HD001的分離鑒定及結(jié)瘤能力檢測：2014)方法?；ㄆ谌〈蠖谷盟磧艉?，測定大豆的結(jié)瘤數(shù)。需要說明的是，本步驟接種的根瘤菌也可以選擇其他根瘤菌，只要是便于測定大豆結(jié)瘤數(shù)的根瘤菌即可。

四、大豆結(jié)瘤數(shù)的QTL分析

利用兩批次結(jié)瘤數(shù)的平均值及構(gòu)建的總圖距為3403.90cM的遺傳圖譜，采用rQTL作圖軟件的復(fù)合區(qū)間(CIM)作圖法，以LOD(連鎖系數(shù))≥3為標準，對大豆結(jié)瘤數(shù)進行QTL分析。在7號染色體上發(fā)現(xiàn)QTL區(qū)間M33594-M33587-M33586與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)，如表1所示。

表1大豆結(jié)瘤數(shù)QTL區(qū)間

五、結(jié)瘤數(shù)QTL區(qū)間標記的應(yīng)用

與大豆結(jié)瘤數(shù)相關(guān)的QTL緊密連鎖的SNP分子標記為M33594、M33587、M33586，其是以待鑒定材料的基因組DNA作為模板，以引物進行PCR擴增所得的片段；其中M33594的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，M33587的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，M33586的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，M33594的擴增引物為：

M94F：5’-CGATCCTTTGTGAGTGTGGGT-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

M94R：5’-GCCGAATCGTGCTCACAAC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

M33587的擴增引物為：

M87F：5’-TGGTAACCCAGACTCCCTTGC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

M87R：5’-GTGGGTACCCTCCTTGGTCA-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

M33586的擴增引物為：

M86F：5’-AACCCAGACTCCCTTGCTTTG-3’(如SEQ ID NO.8所示)；

M86R：5’-GTTTGACAGGAGGATTGGCAA-3’(如SEQ ID NO.9所示)。

利用上述SNP分子標記輔助判斷結(jié)瘤數(shù)的具體步驟如下：

1.利用CTAB法提取待鑒定材料基因組DNA

1)取大豆新鮮葉片加入液氮研磨成粉狀，取適量放入1.5mL離心管中。

2)加入0.6mL預(yù)熱的CTAB提取液，顛倒混勻幾次，在65℃的溫度下水浴一小時，每15min混勻一次，12000rpm離心15min。

3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：異戊醇溶液，顛倒混勻5-10次，10000rpm離心15min。

4)取上清溶液轉(zhuǎn)移到另外一個空的離心管中，用24:1(V/V)的氯仿：異戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μLRNase(10mg/mL)室溫下放置30min。

5)加等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm離心10min去上清。

6)用70％乙醇清洗兩次。吹干后用滅菌水溶解，得到基因組模板DNA，將基因組模板DNA放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7)用0.8％的瓊脂糖檢測DNA的濃度，稀釋到工作濃度用于PCR擴增。

2.分別利用M33594、M33587、M33586的引物進行PCR擴增，分別得到M33594擴增產(chǎn)物、M33587擴增產(chǎn)物和M33586擴增產(chǎn)物。

1)PCR擴增體系：總體積為20μL，包括10ng基因組模板DNA2μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，10mM的引物各2μL和ddH₂O 4μL。

2)PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

3.根據(jù)序列比對結(jié)果判斷結(jié)瘤數(shù)

分別將M33594擴增產(chǎn)物、M33587擴增產(chǎn)物和M33586擴增產(chǎn)物進行測序分析，M33594擴增產(chǎn)物自5’端第179位在母本一千粒中為G、父本長嶺野生豆中為A；M33587擴增產(chǎn)物自5’端第148位在母本一千粒中也為T、父本長嶺野生豆中為C；M33586擴增產(chǎn)物自5’端第108位在母本一千粒中為T、父本長嶺野生豆中為C。當子代這些位點的SNP與母本一致時，結(jié)瘤數(shù)多，當與父本一致時結(jié)瘤數(shù)少，M33594的判斷準確率為81.6％，M33587的判斷準確率高達90.5％，M33586的判斷準確率為82.3％，因此上述SNP分子標記M33594、M33587、M33586可作為大豆結(jié)瘤數(shù)性狀的共顯性分子標記。

本發(fā)明以M33587居中的M33586-M33587-M33594的QTL區(qū)間都是大豆開花期的理想標記區(qū)間(見表1所示)，其中M33587為LOD最高點，其貢獻率為31.7％。與此標記緊密相連的QTL區(qū)間的加性效應(yīng)為正值，即一千粒為該QTL的供體。因此，無論是從該QTL區(qū)間的定位，還是該QTL區(qū)間對表型的貢獻率來看，以M33587居中的M33586-M33587-M33594的區(qū)間都是大豆結(jié)瘤數(shù)的理想標記區(qū)間。

圖2是位于7號染色體上M33594-M33587-M33586區(qū)間的遺傳圖譜及QTL作圖區(qū)間，如圖1或圖2所示，利用本發(fā)明提供的如表1所示的大豆結(jié)瘤數(shù)染色體(07)作圖區(qū)間M33594-M33587-M33586僅為0.659cM，距離很小，且篩選出的分子標記M33594、M33587、M33586與大豆結(jié)瘤數(shù)緊密連鎖、顯著相關(guān)，可用于分子標記輔助選擇育種，顯著提高高效結(jié)瘤材料的選擇效率，為進一步豐富大豆結(jié)瘤數(shù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一種最經(jīng)濟有效的分子育種新途徑。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。