本發(fā)明屬于微生物相關(guān)的基因工程領(lǐng)域，具體涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的抗水貂阿留申病毒單克隆抗體。

背景技術(shù)：

水貂阿留申病(aleutiandisease,ad)是由細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的水貂阿留申病毒(aleutiandiseasevirus，adv)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。amd在世界各養(yǎng)貂國家均有發(fā)生，所有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂甚至有1/3死于該病，水貂阿留申病能使母貂空懷率和仔貂死亡率顯著增高，公貂的交配能力下降，還能影響發(fā)育而使毛皮品質(zhì)低下，造成經(jīng)濟損失，是世界公認(rèn)的養(yǎng)貂的三大疫病之一。

典型ad水貂的組織、唾液、糞便、尿、血清及全血中的病毒均有感染性。水貂感染adv后10天，即可在肝、脾和淋巴結(jié)中查出，且能持續(xù)較長時間。免疫熒光研究表明adv存在于脾臟的巨噬細(xì)胞、肝臟的枯否氏細(xì)胞，多見于細(xì)胞漿中，偶爾也可在核中見到。

水貂阿留申病通過水平和垂直的方式進(jìn)行傳播。病毒由糞便、尿、唾液排出，通過糞便-口腔途徑和唾液-氣霧-呼吸道途徑傳播，公貂的精液可以帶毒，患病公貂可通過交配，引起母貂的生殖道感染，然后又由母貂通過垂直傳播將病毒傳遞給胎兒。

水貂阿留申病具有明顯的季節(jié)性，雖然常年都能發(fā)病，但在秋冬季節(jié)的發(fā)病率和死亡率大大增加。因為腎臟高度損害的病貂，表現(xiàn)渴欲增高，而在秋冬季節(jié)，由于冰凍往往不能滿足其飲水，致使原來就衰竭的病貂，在這樣急劇惡化的條件下，發(fā)生大批死亡。因此，水貂阿留申病的早期診斷及防治上有重要的作用。所以，篩選出可以分泌抗水貂阿留申病毒的雜交瘤細(xì)胞株，并鑒定出其所分泌的單克隆抗體對adv的診斷及預(yù)防具有積極意義，并為adv免疫機制的研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一株分泌抗水貂阿留申病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

本發(fā)明目的之二是提供一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體可與水貂阿留申病毒發(fā)生特異性反應(yīng)；

本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明采用trizol法提取adv病毒總dna，克隆其vp2蛋白基因，將其插入原核表達(dá)載體peasy-e1，利用peasy-e1原核表達(dá)載體對adv-vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，將所表達(dá)出的包涵體形式的adv-vp2蛋白經(jīng)his標(biāo)簽親和純化后作為免疫原，免疫balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。此外，本發(fā)明還利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對adv-vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，對所表達(dá)的包涵體形式的adv-vp2蛋白進(jìn)行包涵體純化后作為檢測用抗原，建立間接elisa檢測方法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終獲得一株穩(wěn)定分泌抗adv-vp2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號是：cgmccno.12992，其分泌的抗體命名為1m13，分類命名是：水貂阿留申病毒單克隆抗體1m13雜交瘤細(xì)胞株；保藏時間：2016年9月22日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所。

本發(fā)明還提供了一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，其命名為1m13，western-blot檢測結(jié)果表明單克隆抗體可與adv-vp2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與對照vero細(xì)胞蛋白不發(fā)生反應(yīng)；ifa檢測結(jié)果表明單克隆抗體與adv發(fā)生特異性反應(yīng)。

本發(fā)明利用肽掃描技術(shù)對1m13所識別的adv的b細(xì)胞表位進(jìn)行了鑒定，最終將表位精確定位為：hlqqnfstryiyd。

因此，本發(fā)明提出了所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備診斷或預(yù)防水貂阿留申病毒感染藥物中的應(yīng)用。及所述的單克隆抗體在制備診斷或預(yù)防水貂阿留申病毒感染藥物中的應(yīng)用。及所述的b細(xì)胞表位多肽在制備診斷水貂阿留申病毒感染藥物中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是為應(yīng)用westernblot試驗檢測單克隆抗體1m13與adv病毒的反應(yīng)性結(jié)果分析(1：1m13與adv感染的細(xì)胞裂解沉淀的反應(yīng)；2：1m13與細(xì)胞裂解沉淀的反應(yīng)；m：標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker)。

圖2是為應(yīng)用間接免疫熒光試驗檢測單克隆抗體1m13與adv病毒反應(yīng)性結(jié)果分析。

圖3是為應(yīng)用間接免疫熒光試驗檢測單克隆抗體1m13與細(xì)胞對照反應(yīng)性結(jié)果分析。

圖4是合成短肽與1m13反應(yīng)性的間接elisa分析(其中陽性短肽23序列：hlqqnfstryiyd，其余短肽均為陰性)。

圖5是不同抗原包被濃度和阻斷抗體稀釋度下的d450nm值。

圖6是待測血清稀釋度及其對應(yīng)的抑制率。

圖7是待測血清抑制率結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會在逐步描述中更為顯現(xiàn)。

具體實施方式

主要實驗材料和來源

1.蛋白、細(xì)胞、病毒

原核表達(dá)并純化的adv-vp2蛋白、sp2/0細(xì)胞、vero細(xì)胞和cdv毒株均由本實驗室保存。

2.主要試劑和藥品

胎牛血清、dmem培養(yǎng)基購自gibco公司；二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色試劑盒、辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗鼠igg抗體、fitc標(biāo)記羊抗鼠igg抗體、膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；50％peg、50×hat、50×ht購自sigma公司；鄰苯二胺、預(yù)染蛋白marker購自fermentas公司；sbaclonotypingtmsystem/hrp抗體亞類鑒定試劑盒購于southernbiotechnology公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自axygen公司，t-e1、反轉(zhuǎn)錄酶、extaqdna聚合酶、t4dna連接酶，his標(biāo)簽純化試劑購自北京全式金公司。

3.實驗動物

6周齡balb/c小鼠由長春生物制品所提供。

實施例1adv-vp2蛋白的原核表達(dá)及純化

1.引物設(shè)計

根據(jù)genbank中已登錄的adv-g株基因序列(登錄號：m20036)，設(shè)計pcr擴增引物，序列如下：上游引物5-ggccatggatggaattggccct-3，下游引物5-gctcgagtcagtggtcctg-3

2.adv-vp2基因擴增與純化

從感染adv的crfk細(xì)胞中提取病毒基因組dna作為模板，利用所設(shè)計的pcr擴增引物，擴增adv-vp2基因。

pcr反應(yīng)體系(50μl)如下：

反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，循環(huán)30個周期；72℃延伸10min。

對pcr產(chǎn)物膠回收，將全部pcr擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下切取含有目的基因的膠塊，之后按照上康為世紀(jì)生物科技有限公司膠回收試劑盒說明書回收pcr擴增出的n基因。

3.adv-vp2蛋白原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建

將膠回收得到的基因以及原核表達(dá)載體peasy-e1分別進(jìn)行連接，連接體系為：

連接條件：16℃連接過夜。

4.轉(zhuǎn)化與挑菌

將4中得到的連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入ecolidh5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，之后42℃水浴熱刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μllb液體培養(yǎng)基，37℃搖床中搖動培養(yǎng)1h，將100μl菌液涂布于含氨芐青霉素(100μg/ml)的lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜。從平板上隨機挑取單個菌落，分別接種到3mllb(amp⁺，100μg/ml)液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。

5.重組質(zhì)粒的pcr鑒定與測序

1)利用axygen公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒，按照試劑盒說明書操作從5中培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒，將所提取的質(zhì)粒進(jìn)行pcr鑒定并測序。

2)對疑似重組質(zhì)粒進(jìn)行pcr鑒定

pcr反應(yīng)體系(50μl)如下：

反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，循環(huán)30個周期；72℃延伸10min。

將經(jīng)過pcr結(jié)果陽性的質(zhì)粒送交上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將通過序列測定鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為peasy-e1-vp2。

6.adv-vp2基因的原核表達(dá)與純化

按照4所述轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒peasy-e1-vp2轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)用bl21感受態(tài)細(xì)胞，然后取出100μl菌液涂布于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取lb平板培養(yǎng)基上的白色菌落，接種于3ml含有氨芐青霉素(100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。表達(dá)誘導(dǎo)具體操作如下：取1ml重組菌菌液加入到100ml的lb培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)至od600nm約為0.5-1h，加iptg至終濃度為1mmol/l，37℃誘導(dǎo)4h。將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行sds-page電泳，通過his標(biāo)簽的親和層析方法進(jìn)行純化。親和層析方法如下：

1、將經(jīng)過iptg誘導(dǎo)的菌液離心，7000rpm，10min。收集菌體細(xì)胞，用pbs漂洗兩遍，將收集好的菌液超聲破碎，直至澄清，13000rpm，離心10min，取沉淀。再用純化所用的上樣緩沖液漂洗一遍，最后用上樣緩沖液重懸，13000rpm，離心10min，取上清，用0.45μm濾器過濾。

2、將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

3、將上清負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時，收集流穿液。使用15倍柱體積的bindingbuffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用5mlelutionbuffer洗脫，收集洗脫峰。將純化后產(chǎn)物進(jìn)行sds-page電泳檢測。

實施例2單克隆抗體的制備

1.小鼠免疫

以親和純化的原核表達(dá)的重組adv-vp2蛋白免疫5只6周齡雌性balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫間隔兩周，免疫劑量為50μg/只，免疫途徑為腹腔免疫。

分別在二免和三免后一周對小鼠進(jìn)行斷尾采血，分離血清(4℃，10000rpm，20min)，用間接elisa檢測抗體水平。在細(xì)胞融合前3天，對免疫效果好的balb/c小鼠再進(jìn)行加強免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。

2.細(xì)胞融合

融合前1天準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞，按照常規(guī)方法取balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待用。斷頸處死待取脾的小鼠，無菌取脾并分離脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞4：1的比例用peg進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞之上。

3.陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆

利用純化后的原核表達(dá)adv-vp2蛋白建立間接elisa檢測方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，對反應(yīng)陽性的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)，同時用有限稀釋法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，至少亞克隆3次，將亞克隆好的陽性雜交瘤細(xì)胞及時凍存。最終獲得一株可以穩(wěn)定分泌抗adv單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號是：cgmccno.12992；并將其分泌的單克隆抗體命名為1m13。

4.單克隆抗體的大量制備

給10周齡左右的健康balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.5ml/只，1周后腹腔注射1×10⁶個雜交瘤細(xì)胞，7～10d后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時抽取腹水，隔2d抽一次，將抽取的腹水10000r/min離心10min，去除上層油脂和沉淀，上清分裝保存于-20℃。

實施例3單克隆抗體的鑒定

1.單克隆抗體的亞類鑒定

按照sbaclonotypingtmsystem/hrp抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書對實施例2所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。

結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體1n8的重鏈為igg1，輕鏈為kappa鏈。

2.westernblot鑒定試驗

將離心收獲adv病毒上清后的細(xì)胞沉淀和crfk細(xì)胞沉淀處理后進(jìn)行sds-page電泳，然后經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)條件為18v電壓30min，用5％脫脂奶粉封閉液將轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜4℃封閉過夜；加入單克隆抗體上清室溫孵育1h，用pbst(含0.5ml/l吐溫-20的ph7.4的pbs緩沖液)洗滌三次，再與4000倍稀釋的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗鼠igg抗體室溫孵育1h，pbst洗滌3次后，用dab顯色試劑盒顯色，掃描記錄。

試驗結(jié)果證實，本發(fā)明所制備的單克隆抗體1m13能夠與adv-vp2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與對照細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)，同時根據(jù)本實驗結(jié)果推測1m13所識別的b細(xì)胞表位應(yīng)該是一個線性表位。

3.ifa鑒定試驗

將生長至70％～80％的crfk細(xì)胞接毒adv。感染48小時后冷乙醇4℃固定30分鐘，1：10倍稀釋的1n8腹水37℃孵育1h，然后1:100倍稀釋的fitc標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃孵育1h。最后熒光顯微鏡觀察拍照。

試驗結(jié)果證實，本發(fā)明所制備的單克隆抗體1m13僅能夠與cdv發(fā)生特異性反應(yīng),不與crfk細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。

實施例4肽掃描鑒定b細(xì)胞表位

1.單克隆抗體的純化

用硫酸銨沉淀法初步提純igg分子，將初提純的igg分子在磷酸鹽緩沖液中透析去硫酸銨之后過蛋白a/g親和層析柱，用0.2m的甘氨酸-hcl(ph2.3)洗脫與蛋白a/g結(jié)合的特異性抗體，并立即在洗脫之后的抗體中加入1m的tris-hcl(ph9.0)調(diào)ph值到7.0左右。

2、肽段設(shè)計

肽段設(shè)計范圍是adv-vp2表達(dá)蛋白的一級結(jié)構(gòu)序列，每15個aa做為一個肽段，每條肽段位移5個aa。基本上能覆蓋整個蛋白抗原。

3、抗原表位的初步鑒定

經(jīng)多肽合成后分別以100ng/孔包被elisa反應(yīng)板，以單克隆抗體1m13細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗37℃孵育1h，然后hrp標(biāo)記的山羊抗鼠igg為二抗37℃孵育1h進(jìn)行間接elisa實驗。結(jié)果顯示1m13與短肽hlqqnfstryiyd發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他對照短肽均不反應(yīng)。進(jìn)而將1n8所識別的cdv-n蛋白b細(xì)胞表位定位于hlqqnfstryiyd所示的氨基酸序列上。

實施例4利用水貂阿留申病毒單克隆抗體1m13建立檢測水貂阿留申病毒抗體的阻斷elisa方法

1、抗原包被濃度和阻斷抗體稀釋度的確定

水貂阿留申病毒以41.6mg/l濃度包被，單克隆抗體做1:1000、1：2000、1：4000、1：8000稀釋，進(jìn)行間接elisa，結(jié)果表明，確定的抗原工作濃度為10.4mg/l，阻斷抗體的稀釋度為1：4000(見附圖5)。

2、待檢血清稀釋度的確定

將血清分別做1：2.5；1：5；1：10；1：20；1：40；1：80倍比稀釋，按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行間接阻斷elisa，結(jié)果顯示：當(dāng)血清1：20稀釋時，免疫血清的抑制率在50％以上，而未免疫血清的抑制率在25％以下。因此，血清稀釋度規(guī)定為1：20(見圖6)。

3、判斷結(jié)果確定

抑制率(％)＝(阻斷抗體d450nm-樣本d450nm)/阻斷抗體d450nm*100％

用間接阻斷elisa反應(yīng)條件，對10份cdv未免疫血清樣本進(jìn)行檢測。根據(jù)公式計算臨界值,臨界值＝陰性樣品平均抑制率+2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。對未免疫血清樣本的檢測結(jié)果顯示，cdv的平均抑制率為29％；大于29％則為陽性血清，小于29％則為陰性血清。

4、基于單克隆抗體1m13的阻斷elisa方法檢測8份血清效價

主要操作方法如下：

將adv以碳酸鹽緩沖液(ph9.6，0.05mol/l)稀釋后加入96孔酶標(biāo)板中，100μl/孔，37℃包被3h后，用pbst洗板機洗滌3次；用2％bsa封閉，200μl/孔，37℃封閉2h，再用pbst洗板機洗滌3次；將待檢水貂血清用pbst稀釋后加入酶標(biāo)板中，50μl/孔，37℃孵育30min后，加入等量按工作濃度(1：4000)稀釋的單克隆抗體1m13孵育1h后，用pbst洗板機洗滌3次；將羊抗鼠酶標(biāo)抗體經(jīng)pbst稀釋后，100μl/孔，37℃孵育1h，用pbst洗板機洗滌3次；最后加tmb顯色液，100μl/孔，室溫作用10min；每孔加入50μl濃度為2mol/l的濃硫酸終止顯色后，測定d450nm值，計算抑制率。每次均設(shè)cdv陽性血清對照(未阻斷)。實驗結(jié)果見附圖7。

結(jié)果顯示，4份adv陽性血清抑制率均在29％以上，而陰性血清抑制率在29％以下。與預(yù)期結(jié)果一致。所以，基于犬瘟熱病毒單克隆抗體1m13的阻斷elisa方法，有效并實用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的規(guī)定范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。