本發(fā)明涉及多肽合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種五肽胃泌素合成方法。

背景技術(shù)：

五肽胃泌素為白色或類白色粉末。本品能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶及內(nèi)因子的分泌，其促胃酸分泌作用相當(dāng)于內(nèi)源性胃泌素的1/4，作用可持續(xù)10～40分鐘。臨床上主要用于胃酸分泌機(jī)能的檢查。

目前，五肽胃泌素合成方法較為復(fù)雜，合成難度高，成本高，收率低，并且成品的雜質(zhì)含量多，純度不高

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種五肽胃泌素合成方法。本發(fā)明方法的合成工藝簡(jiǎn)單，減少了合成難度，減少雜質(zhì)(純度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種五肽胃泌素合成方法，包括以下步驟：

1)制備樹(shù)脂(1)：

將樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有機(jī)溶液DCM或DMF中浸泡，使樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶脹；用有機(jī)溶液DMF或DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，與樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震蕩，常溫下過(guò)夜反應(yīng)，抽掉溶液，用DMF，DCM，無(wú)水甲醇各洗三遍；然后加入過(guò)量無(wú)水甲醇震蕩或攪拌1-4h封閉樹(shù)脂，抽干，得到樹(shù)脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽樹(shù)脂：

以步驟1)所得的樹(shù)脂(1)為載體通過(guò)固相合成法，依次偶聯(lián)Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；具體方法如下：

2.1)樹(shù)脂預(yù)處理：將樹(shù)脂(1)用DMF或DCM浸泡充分溶脹，抽掉后用DMF洗凈；

2.2)加入脫帽試劑：

向樹(shù)脂(1)中加入其2-3倍體積量的脫帽試劑反應(yīng)4-6min，然后抽濾，用DMF洗滌，抽濾，再添加樹(shù)脂(1)2-3倍體積量的脫帽試劑反應(yīng)8-12min，去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)；然后洗滌6遍，洗滌劑依次為：DMF、無(wú)水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF或用DMF洗6遍，抽掉；以DMF為溶劑加入1.2-3倍摩爾量的Fmoc-Met-OH，和偶聯(lián)劑，1.2-6倍摩爾量的有機(jī)堿，偶聯(lián)1-3小時(shí)，用茚三酮檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗凈；重復(fù)2.2)中上述步驟直至完成最后一個(gè)氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，無(wú)水甲醇洗三遍；完成洗滌和樹(shù)脂收縮，干燥得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；

3)切割：

以DCM為溶劑，配制體積比為2％的TFA切割試劑，進(jìn)行冷凍；取出后向切割試劑中加入步驟2)所得的五肽胃泌素肽樹(shù)脂，在-10至10℃下震蕩18-22min；然后升溫至23-27℃震蕩1.5-2.5h；抽濾，收集濾液；濾液加入有機(jī)堿，調(diào)解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚或乙醚洗滌3-6遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通過(guò)HPLC檢測(cè)粗品純度，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干后得五肽胃泌素精品。

五肽胃泌素的序列為：N-t-Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂。本發(fā)明方法概述：在片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂的(ASP)的側(cè)鏈羧基上鏈接樹(shù)脂：2-Chlorotrityl Chloride Resin。得到：

再采用固相合成的方法依次偶聯(lián)Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂，再通過(guò)溫和的切割方式(2％TFA/DCM)裂解樹(shù)脂，洗滌，干燥得到五肽胃泌素粗品。純化，凍干，得到精品。簡(jiǎn)化了工藝，減少了合成難度，減少雜質(zhì)(純度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

因片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂在市場(chǎng)上較少，而Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂市場(chǎng)上很常見(jiàn)，可采用已知方法自行制備Fmoc-Asp-Phe-NH₂或采用以下液相方法制得：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH2為原料，加入HOBT，DCC或DIC溶于有機(jī)溶劑THF或DCM或DMF中，25-35℃下反應(yīng)2-8小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后處理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解2-6小時(shí)后處理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

作為優(yōu)選，步驟2.2)中所述脫帽試劑為體積比為20％的DBLK溶液。

作為優(yōu)選，步驟2.2)中所述偶聯(lián)劑選自TBTU、HBTU、HATU、PYBOP、HOBT、DIC。

作為優(yōu)選，所述有機(jī)堿為DIPEA或NMM。

作為優(yōu)選，步驟2.2)中，用無(wú)水甲醇洗三遍時(shí)，無(wú)水甲醇每次洗滌時(shí)間為5-10min。

與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法的合成工藝簡(jiǎn)單，減少了合成難度，減少雜質(zhì)(純度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明制得的五肽胃泌素的HPLC圖譜；

圖2為本發(fā)明制得的五肽胃泌素的MS圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1

一種五肽胃泌素合成方法，包括以下步驟：

1)制備樹(shù)脂(1)：

將樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有機(jī)溶液DCM中浸泡，使樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶脹；用有機(jī)溶液DMF溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，與樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震蕩，常溫下過(guò)夜反應(yīng)，抽掉溶液，用DMF，DCM，無(wú)水甲醇各洗三遍；然后加入過(guò)量無(wú)水甲醇震蕩2.5h封閉樹(shù)脂，抽干，得到樹(shù)脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽樹(shù)脂：

以步驟1)所得的樹(shù)脂(1)為載體通過(guò)固相合成法，依次偶聯(lián)Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；具體方法如下：

2.1)樹(shù)脂預(yù)處理：將樹(shù)脂(1)用DMF浸泡充分溶脹，抽掉后用DMF洗凈。

2.2)加入脫帽試劑：

向樹(shù)脂(1)中加入其2.5倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)5min，然后抽濾，用DMF洗滌，抽濾，再添加樹(shù)脂(1)2.5倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)10min，去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)；然后洗滌6遍，洗滌劑依次為：DMF、無(wú)水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF，抽掉；以DMF為溶劑分別加入3倍摩爾量的Fmoc-Met-OH、TBTU和6倍摩爾量的DIPEA，常溫偶聯(lián)2小時(shí)，用茚三酮檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗凈；重復(fù)2.2)中上述步驟直至完成最后一個(gè)氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，無(wú)水甲醇洗三遍(每次洗滌時(shí)間為7.5min)；完成洗滌和樹(shù)脂收縮，干燥得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；

3)切割：

以DCM為溶劑，配制體積比為2％的TFA切割試劑，進(jìn)行冷凍；取出后向切割試劑中加入步驟2)所得的五肽胃泌素肽樹(shù)脂，在0℃下震蕩20min；然后升溫至25℃震蕩2h；抽濾，收集濾液；濾液加入DIPEA，調(diào)解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚洗滌5遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通過(guò)HPLC檢測(cè)粗品純度，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干后得五肽胃泌素精品。

實(shí)施例2

一種五肽胃泌素合成方法，包括以下步驟：

1)制備樹(shù)脂(1)：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂為原料，加入HOBT，DCC溶于有機(jī)溶劑THF中，30℃下反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后處理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解4小時(shí)后處理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

將樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有機(jī)溶液DMF中浸泡，使樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶脹；用有機(jī)溶液DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，與樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震蕩，常溫下過(guò)夜反應(yīng)，抽掉溶液，用DMF，DCM，無(wú)水甲醇各洗三遍；然后加入過(guò)量無(wú)水甲醇攪拌1h封閉樹(shù)脂，抽干，得到樹(shù)脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽樹(shù)脂：

以步驟1)所得的樹(shù)脂(1)為載體通過(guò)固相合成法，依次偶聯(lián)Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；具體方法如下：

2.1)樹(shù)脂預(yù)處理：將樹(shù)脂(1)用DCM浸泡充分溶脹，抽掉后用DMF洗凈。

2.2)加入脫帽試劑：

向樹(shù)脂(1)中加入其2倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)4min，然后抽濾，用DMF洗滌，抽濾，再添加樹(shù)脂(1)2倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)8min，去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)；然后用DMF洗滌6遍，抽掉；以DMF為溶劑分別加入3倍摩爾量的Fmoc-Met-OH、HBTU和6倍摩爾量的NMM，在25℃溫度下偶聯(lián)3小時(shí)，用茚三酮檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗凈；重復(fù)2.2)中上述步驟直至完成最后一個(gè)氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，無(wú)水甲醇洗三遍(每次洗滌時(shí)間為5min)；完成洗滌和樹(shù)脂收縮，干燥得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；

3)切割：

以DCM為溶劑，配制體積比為2％的TFA切割試劑，進(jìn)行冷凍；取出后向切割試劑中加入步驟2)所得的五肽胃泌素肽樹(shù)脂，在-10℃下震蕩22min；然后升溫至23℃震蕩2.5h；抽濾，收集濾液；濾液加入NMM，調(diào)解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用乙醚洗滌3遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通過(guò)HPLC檢測(cè)粗品純度，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干后得五肽胃泌素精品。

實(shí)施例3

一種五肽胃泌素合成方法，包括以下步驟：

1)制備樹(shù)脂(1)：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂為原料，加入HOBT，DIC溶于有機(jī)溶劑DCM中，35℃下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后處理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解6小時(shí)后處理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

將樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有機(jī)溶液DMF中浸泡，使樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶脹；用有機(jī)溶液DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，與樹(shù)脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震蕩，常溫下過(guò)夜反應(yīng)，抽掉溶液，用DMF，DCM，無(wú)水甲醇各洗三遍；然后加入過(guò)量無(wú)水甲醇攪拌4h封閉樹(shù)脂，抽干，得到樹(shù)脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽樹(shù)脂：

以步驟1)所得的樹(shù)脂(1)為載體通過(guò)固相合成法，依次偶聯(lián)Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；具體方法如下：

2.1)樹(shù)脂預(yù)處理：將樹(shù)脂(1)用DMF浸泡充分溶脹，抽掉后用DMF洗凈。

2.2)加入脫帽試劑：

向樹(shù)脂(1)中加入其3倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)6min，然后抽濾，用DMF洗滌，抽濾，再添加樹(shù)脂(1)3倍體積量的體積比為20％的DBLK溶液反應(yīng)12min，去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)；然后洗滌6遍，洗滌劑依次為：DMF、無(wú)水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF，抽掉；以DMF為溶劑分別加入3倍摩爾量的Fmoc-Met-OH、HOBT、DIC，在32℃溫度下偶聯(lián)1小時(shí)，用茚三酮檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗凈；重復(fù)2.2)中上述步驟直至完成最后一個(gè)氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，無(wú)水甲醇洗三遍(每次洗滌時(shí)間為10min)；完成洗滌和樹(shù)脂收縮，干燥得到五肽胃泌素肽樹(shù)脂；

3)切割：

以DCM為溶劑，配制體積比為2％的TFA切割試劑，進(jìn)行冷凍；取出后向切割試劑中加入步驟2)所得的五肽胃泌素肽樹(shù)脂，在10℃下震蕩18min；然后升溫至27℃震蕩1.5h；抽濾，收集濾液；濾液加入NMM，調(diào)解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚洗滌6遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通過(guò)HPLC檢測(cè)粗品純度，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干后得五肽胃泌素精品。

本發(fā)明制得的五肽胃泌素純度在98％以上，

本發(fā)明制得的五肽胃泌素的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明制得的五肽胃泌素的HPLC圖譜如圖1所示，其中各峰情況如下表所示：

本發(fā)明制得的五肽胃泌素的MS圖譜如圖2所示，

本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州固拓生物科技有限公司

<120> 一種五肽胃泌素合成方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Trp Met Asp Phe

1 5