本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

Y染色體是一類僅存在于男性個(gè)體的染色體，其非重組區(qū)(non-recombination regions of Y chromosome，NRY，以下未做特殊說明的Y染色體均指非重組區(qū))具有父系遺傳、非重組、有效群體小和地理學(xué)上的特殊性等特點(diǎn)。由于其僅存在于男性個(gè)體，使其在法醫(yī)學(xué)方面發(fā)揮著重要作用，如在男性作為嫌疑人的性侵案件中，以及群體災(zāi)難事件遇難者身源鑒定和失蹤人員調(diào)查中。而由于其父系遺傳及地理學(xué)上的特殊性等特點(diǎn)，也使得其成為研究人類進(jìn)化、群體結(jié)構(gòu)的重要工具之一。其中，運(yùn)用包括插入/缺失(InDel)在內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位點(diǎn)和Alu序列構(gòu)建Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行單倍群劃分則是長(zhǎng)久以來進(jìn)行人類進(jìn)化和群體結(jié)構(gòu)研究的主要手段，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不同地區(qū)、不同人群的主要單倍群。近年來，越來越多的法醫(yī)學(xué)工作者注意到，由于不同人群和不同地區(qū)間單倍群的分布存在一定的特征，可以通過對(duì)檢案中未知來源的男性樣本進(jìn)行單倍群劃分以推斷其地理來源或所屬群體，從而輔助案件偵查，因而，Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的SNP位點(diǎn)得以被發(fā)現(xiàn)，其中包括部分可用于構(gòu)建進(jìn)化樹的SNP位點(diǎn)，這在極大程度上擴(kuò)充了Y染色體進(jìn)化樹，使得單倍群的劃分可以愈發(fā)精細(xì)，截至2016年3月27日，國(guó)際遺傳系譜學(xué)會(huì)(International Society of Genetic Genealogy，ISOGG)在線提供的可用于構(gòu)建Y染色體進(jìn)化樹的SNP位點(diǎn)已達(dá)31617個(gè)。但由于這其中部分位點(diǎn)的遺傳地位相同、某些位點(diǎn)的穩(wěn)定性尚有待考證，且過多的遺傳標(biāo)記不利于快速檢測(cè)等問題，給其在法醫(yī)學(xué)檢案中的應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。如今，van Oven等人用417個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建了一個(gè)最小參考樹，該樹可提供全球范圍內(nèi)各主要單倍群的地理分布(其中包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲主要單倍群為12個(gè))，這可為法醫(yī)學(xué)檢案提供便利，但由于其僅能提供主要單倍群在各大洲的大致分布情況，并不具有較高的分辨率，因而，其在進(jìn)一步區(qū)分某樣本的地理來源或所屬人群上具有極大的限制。因此，針對(duì)各群體或地區(qū)，構(gòu)建一個(gè)具有較高分辨率的、穩(wěn)定的系統(tǒng)發(fā)育樹顯得尤為必要。中國(guó)的國(guó)土面積位居世界第三，其人口總數(shù)則位列世界第一，其中更是包含56個(gè)民族，且在此之前，各群體間群體結(jié)構(gòu)的差異就已經(jīng)得以發(fā)現(xiàn)了。在上述背景下，我們有必要構(gòu)建一個(gè)適用于中國(guó)群體的、簡(jiǎn)約的、高分辨率的系統(tǒng)發(fā)育樹，這將不僅為檢案中未知樣本的溯源提供便利，在進(jìn)一步了解中國(guó)群體亞結(jié)構(gòu)方面也可提供一定的幫助。

但隨著分辨率的提高，勢(shì)必需要使用更多的Y-SNP位點(diǎn)，其中包括InDel位點(diǎn)，這就意味著需要一種能同時(shí)大批量檢測(cè)包括InDel位點(diǎn)在內(nèi)的SNP位點(diǎn)的方法，而這個(gè)要求是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如SNaPshot無法滿足的。

綜上所述，篩選一組適宜的Y染色體SNP遺傳標(biāo)記，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)適用于中國(guó)人群的、簡(jiǎn)約的、高分辨率的、可將中國(guó)男性個(gè)體樣本正確歸屬至現(xiàn)已公認(rèn)的Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹分枝上的二代測(cè)序體系，將為法醫(yī)的樣本歸屬問題提供一種新的技術(shù)手段。隨著二代測(cè)序技術(shù)的普及，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出基于二代測(cè)序檢測(cè)平臺(tái)的Y染色體SNP二代測(cè)序試劑盒，將極大地推動(dòng)這種新技術(shù)在法醫(yī)樣本溯源中的推廣和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)未知來源的中國(guó)男性樣本進(jìn)行單倍群劃分以推斷其歸屬地或所屬群體。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒，包括復(fù)合擴(kuò)增引物混合物。所述的基于74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒中的復(fù)合擴(kuò)增引物混合物包含了74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的共計(jì)144條擴(kuò)增引物，各擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如表2中SEQ ID No.1至SEQ ID No.144所示：

表2復(fù)合擴(kuò)增引物

上表中，SNP位點(diǎn)M69與M82，M133與M134采用的是同一對(duì)擴(kuò)增引物。

進(jìn)一步的，所述的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒還包括復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液。

更進(jìn)一步的，上述的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)DNA。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA為2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA。

用二代測(cè)序時(shí)，用不用標(biāo)準(zhǔn)DNA都是可以的，為了質(zhì)量控制使結(jié)果更為準(zhǔn)確，因此使用標(biāo)準(zhǔn)DNA。

本發(fā)明還提供了上述的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒在對(duì)未知來源的中國(guó)男性樣本進(jìn)行單倍群劃分中的用途。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明試劑盒包含74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記，兼顧了系統(tǒng)發(fā)育樹的穩(wěn)定性和高分辨率，以盡可能少的位點(diǎn)數(shù)達(dá)到了較高的體系分辨能力，可將任一中國(guó)男性個(gè)體樣本正確地劃分至現(xiàn)已公認(rèn)的Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹分枝上。本發(fā)明是基于篩選得到的74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記構(gòu)建的法醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑盒，尤其適用于目前迅速發(fā)展的二代測(cè)序體系。本試劑盒可采用單管內(nèi)復(fù)合擴(kuò)增和具有更高通量的二代測(cè)序技術(shù)，能一次性獲得多個(gè)男性來源生物檢材的74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的基因分型，快速實(shí)現(xiàn)對(duì)生物檢材的來源地或所屬人群溯源。本試劑盒包括了標(biāo)準(zhǔn)DNA的分型結(jié)果(指用法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)DNA獲得的其Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的分型)，可確保分型準(zhǔn)確；該試劑盒復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最短僅129bp，最長(zhǎng)不超過200bp，對(duì)于法醫(yī)學(xué)常見的降解檢材的檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)，具有好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

附圖說明

圖1本發(fā)明所檢測(cè)的72個(gè)SNP位點(diǎn)所構(gòu)成的進(jìn)化樹

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明系基于Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒，是基于篩選得到的74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記，利用目前迅速發(fā)展的二代測(cè)序體系構(gòu)建的。該試劑盒由復(fù)合擴(kuò)增引物混合物、標(biāo)準(zhǔn)DNA和復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液構(gòu)成。

該試劑盒的工作原理是首先通過復(fù)合擴(kuò)增引物混合物和復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液，分別在單管內(nèi)一次性同時(shí)擴(kuò)增獲得單一樣本所有74個(gè)Y染色體SNP的72個(gè)DNA片段(構(gòu)建測(cè)序文庫(kù))。

然后以此72個(gè)DNA片段為模板，分別加上接頭(此接頭是一致的，若要進(jìn)行多個(gè)樣本的同時(shí)測(cè)序，則需要加接頭的基礎(chǔ)上分別給不同樣本加上不同的標(biāo)簽以示區(qū)分。接頭和標(biāo)簽均為ABI公司產(chǎn)品)。混合包括分型標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本在內(nèi)的多個(gè)樣本后進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增(乳液PCR時(shí)是將用于測(cè)序的多個(gè)樣本同時(shí)擴(kuò)增的，即將所有的樣本混合到一個(gè)反應(yīng)管里面擴(kuò)增)，以獲得各待測(cè)樣本的74個(gè)Y染色體SNP的乳液PCR產(chǎn)物。

最后，2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對(duì)照與樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，得到各樣本的測(cè)序結(jié)果；此后，首先分析分型標(biāo)準(zhǔn)DNA的測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確與否，若該分型標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序結(jié)果正確，表明該次測(cè)序結(jié)果可靠，則可進(jìn)一步分析確定待測(cè)樣本74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的分型結(jié)果。

在本發(fā)明中，Y染色體SNP的選擇對(duì)二代測(cè)序試劑盒的構(gòu)建極其關(guān)鍵。如前所述，Y染色體遺傳表現(xiàn)為父系遺傳，在人類進(jìn)化研究中有重要的意義。在運(yùn)用Y染色體SNP構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，用單倍群(haplogroup，Hg)表示一組類似的單倍型(haplotype)的集合?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，其分布具有明顯的人群和地理特異性，任何合理的Y染色體DNA檢測(cè)體系都不能忽視對(duì)單倍群的劃分。ISOGG(網(wǎng)址www.isogg.org)在線提供的Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹給定了目前認(rèn)為可用于劃分單倍群的所有位點(diǎn)，這無疑將是目前已知最完整、分辨率最高的系統(tǒng)發(fā)育樹，但由于其所包含的位點(diǎn)數(shù)量極其龐大、部分位點(diǎn)的穩(wěn)定性有待考證，且各節(jié)點(diǎn)上的SNP位點(diǎn)存在冗余，使得其不適用于日常檢案。所以針對(duì)特定的群體或區(qū)域，選擇穩(wěn)定的、單倍群特定的SNP位點(diǎn)，可保證結(jié)果可靠，同時(shí)避免信息的重復(fù)，檢測(cè)較少的位點(diǎn)即可進(jìn)行單倍群的劃分，進(jìn)而追溯生物檢材的人群或地理來源。van Oven等人在ISOGG和YCC所公布的系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上篩選出了包括各大洲主要單倍群節(jié)點(diǎn)在內(nèi)的417個(gè)Y染色體SNP構(gòu)建了一個(gè)最小參考樹，但由于其所包含的具有地區(qū)或群體針對(duì)性的SNP位點(diǎn)有限，使得其分辨率低，不能將未知生物檢材進(jìn)一步溯源。

本發(fā)明試劑盒中SNP位點(diǎn)的選擇旨在使用較少SNP位點(diǎn)的同時(shí)盡可能地提高系統(tǒng)發(fā)育樹的分辨率。因此，本發(fā)明通過大量研究，得出了納入本發(fā)明試劑盒中的Y染色體SNP位點(diǎn)的采納標(biāo)準(zhǔn)：1)為中國(guó)群體特定的SNP位點(diǎn)，且不同主要單倍群的下級(jí)分枝中所包含位點(diǎn)數(shù)目依照該單倍群在人群中所占百分比而有所差異，在人群中所占比重越大，則下級(jí)分枝所包含的SNP位點(diǎn)越多；2)具有多態(tài)性的主要中間節(jié)點(diǎn)SNP，用以保證樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；3)在中國(guó)群體中多態(tài)性良好的SNP位點(diǎn)；4)可以設(shè)計(jì)出200bp以內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，最后一條是每個(gè)位點(diǎn)必備條件。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明最后確認(rèn)了74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記用于建立此二代測(cè)序體系。

本發(fā)明研究確認(rèn)的74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記位點(diǎn)包含可覆蓋所有中國(guó)人群主要單倍群及其亞群的共計(jì)64個(gè)單倍群的特異SNP。經(jīng)過群體調(diào)查實(shí)驗(yàn)(即實(shí)施例的檢測(cè)實(shí)驗(yàn))證明，本發(fā)明的Y染色體SNP二代測(cè)序體系可將任一中國(guó)男性樣本正確歸屬至現(xiàn)已公認(rèn)的Y染色體進(jìn)化樹分枝上。

試劑盒中所涉及的74個(gè)Y染色體SNP位點(diǎn)信息如表3。

表3 74個(gè)Y染色體SNP位點(diǎn)

本發(fā)明試劑盒在Y染色體SNP的檢測(cè)中運(yùn)用了復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)可以在單個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的DNA片段，具有方便、快捷、節(jié)約樣本和成本等優(yōu)點(diǎn)。但這對(duì)引物設(shè)計(jì)有較高的要求，本次引物設(shè)計(jì)通過賽默飛公司白手套計(jì)劃完成，設(shè)計(jì)完成后的72對(duì)引物混合在同一引物池(primer pool)中。其中，由于SNP位點(diǎn)M69與M82，M133與M134位置相近，本發(fā)明對(duì)這四個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)擴(kuò)增引物，每對(duì)位點(diǎn)上下游擴(kuò)增引物序列相同，位于同一條擴(kuò)增產(chǎn)物上。

本發(fā)明試劑盒利用上述復(fù)合擴(kuò)增引物，獲得了包含74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物(即，文庫(kù))，繼而以此為模板，進(jìn)行二代測(cè)序反應(yīng)。

本試劑盒采用的測(cè)序可在PGM(Ion Personal Genome來自賽默飛公司)平臺(tái)上進(jìn)行。該平臺(tái)的二代測(cè)序技術(shù)是一種基于堿基延伸時(shí)釋放氫離子，從而改變微環(huán)境pH值這一原理進(jìn)行的檢測(cè)技術(shù)。芯片中含有大量的微孔(依型號(hào)不同而有所差異)，每個(gè)微孔理論上僅容納單個(gè)微珠，而經(jīng)過乳液PCR反應(yīng)之后，理論上一個(gè)微珠上僅存在一條擴(kuò)增片段的多個(gè)克隆，即，理論上，單個(gè)微孔內(nèi)僅存在一條擴(kuò)增引物的多個(gè)克隆。通過同時(shí)檢測(cè)各個(gè)微孔中反應(yīng)液在加入不同堿基后pH是否變化，即可反映實(shí)際得以延伸的堿基類型，直至所有文庫(kù)的檢測(cè)完成。其特點(diǎn)在于，可以同時(shí)分析多個(gè)樣本的多個(gè)SNP位點(diǎn)，且得到的結(jié)果是包括側(cè)翼序列在內(nèi)的整條核苷酸序列，因而不僅可以了解到目的位置的堿基分布情況，還可以看到側(cè)翼序列的堿基排布，通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)序列，可以更直觀地對(duì)分型結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。

在每一樣本檢測(cè)SNP位點(diǎn)數(shù)一定的情況下，為了實(shí)現(xiàn)單次檢測(cè)更多樣本，需要注意各測(cè)序模版間量的均衡性，而此均衡性的主要影響因素則為文庫(kù)構(gòu)建結(jié)果，即在于文庫(kù)內(nèi)各擴(kuò)增產(chǎn)物片段間數(shù)量的差異，而導(dǎo)致這一差異的主要原因則在于不同引物擴(kuò)增效能的差異，因而在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和混合引物池時(shí)需要尤其注意。

最后設(shè)計(jì)出的所有74個(gè)Y染色體SNP位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增引物序列參見表2。

本發(fā)明試劑盒中引入陽性對(duì)照是作為質(zhì)量控制，用以評(píng)估單次測(cè)序結(jié)果是否可靠。本發(fā)明中提供的陽性對(duì)照包括了2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的所有74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分型結(jié)果。對(duì)未知樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，并列地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA的擴(kuò)增和測(cè)序，通過對(duì)2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA分型結(jié)果的分析，評(píng)估當(dāng)次檢測(cè)結(jié)果的可靠性，決定是否進(jìn)行后續(xù)分析。若結(jié)果可靠，則可對(duì)未知樣本進(jìn)行分型，并對(duì)其所屬單倍群進(jìn)行劃分。

更具體的，本發(fā)明試劑盒具體包括的組分可為：

a)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液：含DNA聚合酶的PCR緩沖液、去核酸酶水。

b)復(fù)合擴(kuò)增引物混合物：如表1所示的74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的擴(kuò)增引物對(duì)組成的復(fù)合擴(kuò)增引物池。

c)部分消化引物序列試劑：FuPa反應(yīng)液。

d)接頭連接反應(yīng)試劑：包括接頭、標(biāo)簽、轉(zhuǎn)換液及連接酶。

e)文庫(kù)純化試劑：包括XP反應(yīng)液、70％乙醇和低濃度TE緩沖液。

f)文庫(kù)定量反應(yīng)試劑：包括E.coli標(biāo)準(zhǔn)品、MasterMix和Assay。分別對(duì)各文庫(kù)進(jìn)行定量，跟據(jù)定量結(jié)果，將文庫(kù)按相應(yīng)比例稀釋，以保證后續(xù)用于乳液PCR的模版混合物中來自各樣本的模版含量均衡。

g)乳液PCR反應(yīng)試劑：包括緩沖液、酶、ISP(Ion Sphere Particle)、反應(yīng)油在內(nèi)的反應(yīng)混合物、Ion OneTouch^TM反應(yīng)液和Ion OneTouch^TM油以及破乳溶液。

h)文庫(kù)富集試劑：包括洗脫液、文庫(kù)富集Beads、NaOH溶液、Beads洗脫液、Tween溶液、中和液、去核酸酶水。

i)測(cè)序反應(yīng)混合物：含有聚合酶、測(cè)序引物、內(nèi)參ISP。

j)測(cè)序反應(yīng)其它試劑：W2溶液、W3溶液、氯片、Annealing緩沖液、NaOH溶液、dNTPs。

k)2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA：作為質(zhì)控指標(biāo)，從文庫(kù)構(gòu)建開始，與其它樣本并行處理。

上述a、c、d、f到j(luò)中各試劑除純水和NaOH外，一般需使用配套的商業(yè)化的產(chǎn)品，本次所用試劑為Hi-Q^TM系列，購(gòu)自賽默飛公司。文庫(kù)純化試劑e中的XP反應(yīng)液購(gòu)自Beckman公司。試劑k作為男性樣本標(biāo)準(zhǔn)品則購(gòu)自Promega公司。

至于提取待檢測(cè)樣本中的DNA的模板，可使用本領(lǐng)域目前的各種常規(guī)試劑，提取DNA模板可以參照現(xiàn)有的常規(guī)方法即可進(jìn)行，亦可使用商業(yè)化試劑按指南進(jìn)行。

利用本發(fā)明所述試劑盒，可以對(duì)法醫(yī)DNA樣本進(jìn)行分析。分析方法包括以下步驟；

1)提取待檢測(cè)樣本的DNA，作為擴(kuò)增模板。

2)利用上述復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液和復(fù)合擴(kuò)增引物混合物對(duì)步驟1提取的DNA以及上述2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行單管內(nèi)復(fù)合擴(kuò)增(即，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建)。

所述復(fù)合擴(kuò)增PCR的反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：99℃，2分鐘；99℃，15秒，60℃，4分鐘，19個(gè)循環(huán)后10℃保存。

3)利用上述部分消化引物序列試劑部分消化步驟2)所構(gòu)建文庫(kù)的引物。

所述部分消化文庫(kù)引物的循環(huán)參數(shù)為：50℃，10分鐘，55℃，10分鐘，60℃，20分鐘。

4)利用上述接頭連接反應(yīng)試劑在上述方法步驟3中所述產(chǎn)物上加接頭，并利用文庫(kù)純化試劑對(duì)其進(jìn)行純化。

所述加接頭的循環(huán)參數(shù)為：22℃，30分鐘，72℃，10分鐘。

5)利用上述文庫(kù)定量反應(yīng)試劑對(duì)上述方法步驟4中所述產(chǎn)物進(jìn)行定量，以保證后續(xù)的文庫(kù)混合時(shí)各文庫(kù)間量的均衡。

所述定量反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：50℃，2分鐘，95℃，2分鐘；95℃，15秒，60℃，1分鐘，40個(gè)循環(huán)。

6)利用上述乳液PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行乳液PCR反應(yīng)，并對(duì)上述步驟5中的產(chǎn)物進(jìn)一步富集，以保證測(cè)序時(shí)的質(zhì)量和數(shù)量均達(dá)到較高水平。

所述乳液PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)依所使用試劑盒而定：儀器預(yù)設(shè)提供所有可用試劑盒的參數(shù)，使用時(shí)選擇所用試劑盒即可。

7)利用測(cè)序反應(yīng)混合物和測(cè)序反應(yīng)其它試劑對(duì)上述步驟6中的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得標(biāo)準(zhǔn)DNA及樣本各位點(diǎn)基因型。

所述加入測(cè)序引物后孵育條件為：95℃，2分鐘，37℃，2分鐘。

所述測(cè)序反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)依所需測(cè)序的遺傳標(biāo)記類型及片段長(zhǎng)度、所用芯片等而定。

進(jìn)一步的，上述方法步驟7中所述的測(cè)序結(jié)果分析包括以下步驟：將富集后的產(chǎn)物加上測(cè)序所需試劑后，載入測(cè)序芯片內(nèi)，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到含有該位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果的excel表格，以及測(cè)序原始文件(包括序列信息文件bam.和對(duì)應(yīng)的定位信息文件bai.)，在對(duì)2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA分型結(jié)果及序列分析，認(rèn)為該次測(cè)序結(jié)果可信后，方可進(jìn)行對(duì)該次測(cè)序其它樣本進(jìn)行分析，獲得待測(cè)樣本基因型。

以下用具體實(shí)例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，其中所用試劑無特殊說明均使用以下試劑和儀器：

1)Nanodrop-1000微量紫外可見分光光度計(jì)，賽默飛公司

2)ProFlex^TM PCR擴(kuò)增儀，賽默飛公司

3)純水裝置，Millipore公司

4)臺(tái)式高速離心機(jī)，賽默飛公司

5)移液器EPPENDORF公司

6)芯片載樣所用移液器為Rainin移液器，梅特勒-托利多公司

7)磁力架，賽默飛公司

8)實(shí)時(shí)定量PCR儀7500型，賽默飛公司

9)PGM二代測(cè)序系統(tǒng)，賽默飛公司

10)Ion 318芯片，賽默飛公司

11)漩渦振蕩器，賽默飛公司

實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的制備

用于檢測(cè)的Y染色體SNP二代測(cè)序試劑盒可包括分別包裝的以下試劑：

a)復(fù)合擴(kuò)增引物混合物。由表3所示的擴(kuò)增引物混合得到，由賽默飛公司合成并混合至一個(gè)引物池。

b)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液、部分消化引物序列試劑。本實(shí)施例中使用賽默飛公司Ion AmpliSeq^TM Library Kit 2.0提供的PCR反應(yīng)混合液。

c)接頭連接反應(yīng)試劑。本實(shí)施例中使用賽默飛公司的Ion Xpress^TM Barcode Adapter，將接頭和標(biāo)簽按1：1混合為標(biāo)簽-接頭混合物，2倍稀釋備用。需要說明的是，由于標(biāo)簽的主要作用為區(qū)分不同樣本，因而在單次測(cè)序樣本數(shù)僅為1的情況下可不使用標(biāo)簽。

d)文庫(kù)純化試劑。本實(shí)施例中使用XP反應(yīng)液，70％乙醇溶液按乙醇和水230：100的體積比進(jìn)行配置，此溶液需新鮮配置。

e)文庫(kù)定量反應(yīng)試劑。本實(shí)施例中使用Ion Library TaqMan^TM定量試劑盒，其中MasterMix和Assay試劑以10：1的比例混合備用。

f)乳液PCR反應(yīng)試劑及文庫(kù)富集試劑。本實(shí)施例中使用Ion PGM^TM Hi-Q OT2試劑盒，其中，文庫(kù)富集所用的Melt-off溶液需用1M NaOH溶液40μL和試劑盒提供的Tween溶液280μL混合備用。

g)測(cè)序反應(yīng)所用試劑。本實(shí)施例中除1M NaOH溶液外，均使用Ion PGM^TM Hi-Q^TM測(cè)序試劑盒。

將上述試劑分別按各自常規(guī)要求包裝后即制得基于Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒，用于后繼的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)100個(gè)無關(guān)漢族男性個(gè)體檢材

使用上述基于Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒，進(jìn)行了100個(gè)無關(guān)漢族成年男性志愿者個(gè)體檢材的檢測(cè)。具體的檢測(cè)過程按如下步驟進(jìn)行：

a、用試劑盒或鹽析法從100個(gè)無關(guān)漢族男性個(gè)體血樣中提取DNA，作為復(fù)合擴(kuò)增模板(鹽析法所提取DNA來自實(shí)驗(yàn)室已有DNA)；

b、以步驟a中的DNA模版，利用上述復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液和復(fù)合擴(kuò)增引物混合物將DNA模版及2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行單管內(nèi)復(fù)合擴(kuò)增，構(gòu)建各樣本文庫(kù)。體系為20μL：擴(kuò)增引物混合物10μL，復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液4μL，模版DNA1μL，加入去核酸酶水補(bǔ)足20μL；循環(huán)條件：99℃2分鐘，99℃15秒、60℃4分鐘、循環(huán)19次。

c、引物的部分消化：步驟b中的產(chǎn)物中分別加入2μL FuPa反應(yīng)液，使總體積為22μL，然后50℃10分鐘，55℃10分鐘，60℃20分鐘。

d、加接頭：在步驟c的各產(chǎn)物中分別加入轉(zhuǎn)換液4μL，以及上述稀釋好的標(biāo)簽-接頭混合物2μL，充分混合后分別加入DNA連接酶2μL，使體積達(dá)30μL，然后22℃30分鐘，72℃10分鐘。

e、文庫(kù)純化：將步驟d中得到的產(chǎn)物分別完全轉(zhuǎn)移至含有45μLXP反應(yīng)液的EP管中，室溫孵育5分鐘。然后將其置于磁力架上約2分鐘，棄上清液后分別用150μL 70％乙醇溶液潤(rùn)洗三次，最后一次洗滌完成后，分別將其從磁力架上移下，晾干，并加入50μL低濃度TE溶液充分重懸，然后靜置后吸取上清液備用。

f、文庫(kù)定量：將步驟e中的產(chǎn)物分別取5μL，稀釋100倍后，分別取9μL，加入MasterMix、Assay混合液11μL，使總體積為20μL，進(jìn)行定量。循環(huán)參數(shù)為：50℃2分鐘，95℃2分鐘；95℃15秒，60℃1分鐘，循環(huán)40次。

g、乳液PCR反應(yīng)：文庫(kù)混合物的準(zhǔn)備：步驟f中定量后的文庫(kù)按原濃度最低者進(jìn)行稀釋、混合，使混合后各文庫(kù)含量均一，取稀釋后的文庫(kù)混合物200pM，加入去核酸酶水至25μL。乳液PCR體系：Ion PGM^TMHi-Q^TM Reagent Mix 800μL,Ion PGM^TM Hi-Q^TM Enzyme Mix 50μL,Ion PGM^TM Hi-Q^TM ISPs 100μL,前述文庫(kù)25μL，加入去核酸酶水至1000μL，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中，加上1.7mLOneTouch^TM反應(yīng)用油。在儀器OneTouch2的相應(yīng)位置按操作手冊(cè)指示加入Ion OneTouch^TM反應(yīng)液和Ion OneTouch^TM油以及破乳溶液。

h、文庫(kù)富集：將步驟g中回收得到的產(chǎn)物洗滌、離心回收(回收后棄上清至100μL)后按操作指南進(jìn)行富集。此步驟需在富集所用容器中依次加入前述回收的產(chǎn)物100μL、Beads130μL、洗脫液300μL(連續(xù)3孔)以及Melt-off溶液300μL，最后在回收用擴(kuò)增管中加入中和液10μL。依次經(jīng)Beads結(jié)合，洗脫液洗滌和Melt-off溶液解離后，最終的回收產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移至中和液中。

i、使用賽默飛公司的PGM二代測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序：充分混合步驟h中得到的產(chǎn)物后，加入內(nèi)參ISP5μL，混勻，離心，從對(duì)側(cè)棄上清至剩余15μL，加入測(cè)序引物12μL，使體積達(dá)27μL，然后95℃2分鐘，37℃2分鐘孵育。在孵育完的產(chǎn)物中加入聚合酶3μL，使體積達(dá)30μL，室溫孵育5分鐘。

其間，按操作手冊(cè)安裝及潤(rùn)洗測(cè)序反應(yīng)用W1、W2及W3等配件，加入相應(yīng)試劑，初始化PGM測(cè)序系統(tǒng)，準(zhǔn)備好dNTP，以及測(cè)試好待用芯片。然后將前述30μL載入測(cè)試好的芯片中，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

測(cè)序條件：按提示選擇所用試劑盒，設(shè)置flow數(shù)為500，本實(shí)施例的原始文件收集使用Torrent_Suite Server(v4.6)，數(shù)據(jù)分析選用VariantCaller(v4.6.0.7)和CoverageAnalysis(v4.6.0.3)。后續(xù)分析使用IGV(Integrative Genomics Viewer)v 2.3.72.

所得的所有100個(gè)男性樣本及2800M標(biāo)準(zhǔn)DNA的分型的結(jié)果見表4，從表中可以看到，共劃分至18個(gè)單倍群。具體劃分方法如下：如圖1(圖1中72個(gè)SNP節(jié)點(diǎn)均在現(xiàn)有進(jìn)化樹上存在，針對(duì)中國(guó)群體選擇圖1所示的72個(gè)；另有兩個(gè)位點(diǎn)，rs172763451、rs20756401，現(xiàn)有樹中沒有，尚不知曉其所在節(jié)點(diǎn)，故構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)未包含此二位點(diǎn))所示，因?yàn)檫M(jìn)化樹是呈樹狀分布的，不同單倍群即為樹的分枝，而各SNP在樹上則分布于各自的節(jié)點(diǎn)。進(jìn)行單倍群劃分時(shí)，從樹根部往上看，若該節(jié)點(diǎn)SNP為突變型，即陽性，則可沿分枝往上；若某節(jié)點(diǎn)為陰性，則該節(jié)點(diǎn)上一個(gè)SNP所在節(jié)點(diǎn)為終點(diǎn)，其所提示單倍群為該樣本所在單倍群。因而，一個(gè)單倍群往往系由多個(gè)SNP分型決定的。

表4檢測(cè)結(jié)果

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大學(xué)

<120> 基于74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒

<130> A160821KN

<160> 144

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增SRY10831.1/SRY10831.2位點(diǎn)的上游引物

<400> 1

acacagaaac agattttcta caacagga 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增SRY10831.1/SRY10831.2位點(diǎn)的下游引物

<400> 2

gatcattcag tatctggcct cttgtat 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M168位點(diǎn)的上游引物

<400> 3

tgatgaaatc tgctttttgt tttgcag 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M168位點(diǎn)的下游引物

<400> 4

taggtctctg actgttcagt tttattcc 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M145位點(diǎn)的上游引物

<400> 5

tgcaaagagg gtaggcttaa tagga 25

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M145位點(diǎn)的下游引物

<400> 6

acacagagtc taatttttat agcggcat 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P153位點(diǎn)的上游引物

<400> 7

ttctcactat gatccaggca atgtattt 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P153位點(diǎn)的下游引物

<400> 8

cataaattac ccagattcgg gaagtttg 28

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M174位點(diǎn)的上游引物

<400> 9

gttcttctcc gtcacagcaa aaatg 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M174位點(diǎn)的下游引物

<400> 10

cttgcaagga aaagtgtgca ataaac 26

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M15位點(diǎn)的上游引物

<400> 11

aaatcctgaa caatcgccat cac 23

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M15位點(diǎn)的下游引物

<400> 12

tctacctcat gcgcatatac aatcaaa 27

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增N1位點(diǎn)的上游引物

<400> 13

gtacatgatc tgctagcaaa gttgg 25

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增N1位點(diǎn)的下游引物

<400> 14

acactagcta taagcaaaag aaatctaacg aa 32

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P99位點(diǎn)的上游引物

<400> 15

gtggtaggtt cctttagtcc ca 22

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P99位點(diǎn)的下游引物

<400> 16

agaatagaag atgtagtcag catgtagag 29

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增p47位點(diǎn)的上游引物

<400> 17

cagaatttct acactgtcat ctgaatcc 28

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增p47位點(diǎn)的下游引物

<400> 18

ttgctgtaaa ggtattttta gatgagattg ag 32

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M55的上游引物

<400> 19

agtaccattc cacagaagaa cagaaata 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M55位點(diǎn)的下游引物

<400> 20

aaagctacta cttctgaatc ctaatggc 28

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M125位點(diǎn)的上游引物

<400> 21

cccaagcaga agtcaacttg agactat 27

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M125位點(diǎn)的下游引物

<400> 22

cccaagggat caggagttat gtga 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P143位點(diǎn)的上游引物

<400> 23

cacaagtgaa cagatcccaa cttc 24

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P143位點(diǎn)的下游引物

<400> 24

gtctttgatt ttgaggcaaa ttttcgtg 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M130位點(diǎn)的上游引物

<400> 25

gctggctatt aatgtgaagg aaggtatg 28

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M130位點(diǎn)的下游引物

<400> 26

ctctcttcag caacagtaag tcgaa 25

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M131位點(diǎn)的上游引物

<400> 27

atcacatttt atcttactaa tgccttttcc t 31

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M131位點(diǎn)的下游引物

<400> 28

aaaggtcaat ttagagcaga gaaattattc tt 32

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M217位點(diǎn)的上游引物

<400> 29

caaaatcctc tcgtacagat ctgtttc 27

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M217位點(diǎn)的下游引物

<400> 30

atttgataaa gctgctgtgg ctttc 25

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M48位點(diǎn)的上游引物

<400> 31

tttgttttat cccttccact cttagctt 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M48位點(diǎn)的下游引物

<400> 32

tccaagtttc agtgtcacat ataagtca 28

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P133位點(diǎn)的上游引物

<400> 33

caggtggtgt tacaggttag aatttatata tac 33

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P133位點(diǎn)的下游引物

<400> 34

acgagacgtg tagttaattg gagatttt 28

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M89的上游引物

<400> 35

ctggattcag ctctcttcct aaggt 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M89的下游引物

<400> 36

agctgtgtga agtcttggca gaata 25

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P141的上游引物

<400> 37

aaaatgacag tcttgacctc taaacatt 28

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P141的下游引物

<400> 38

gtcaacaaag gagtgtgact gtgta 25

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P151位點(diǎn)的上游引物

<400> 39

tcttttgtgc ctatttttct atgtaggg 28

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P151的下游引物

<400> 40

taagacaagc tgcaaaattg agtgag 26

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F1329位點(diǎn)的上游引物

<400> 41

ccaagatata aactgcttgt gcgat 25

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F1329位點(diǎn)的下游引物

<400> 42

gacattgagt gtgagctgca ataatg 26

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M201位點(diǎn)的上游引物

<400> 43

tgtcaaattg tgacactgca atagttac 28

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M201位點(diǎn)的下游引物

<400> 44

ctatcagctt catccaacac taagtacc 28

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M578位點(diǎn)的上游引物

<400> 45

agagtagttc atattgaaac cttgtggt 28

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M578下游位點(diǎn)的引物

<400> 46

agggagatat ctattagaga taggatggag t 31

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M69和M82位點(diǎn)的上游引物

<400> 47

gcttcaggag gctgtttaca ctc 23

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M69和M82位點(diǎn)的下游引物

<400> 48

actgaagaaa caaacctacc tgga 24

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M522位點(diǎn)的上游引物

<400> 49

gccttagatg aggatgtcct tcg 23

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M522位點(diǎn)的下游引物

<400> 50

ggaggaagta cagtgcagaa aatcac 26

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M170位點(diǎn)的上游引物

<400> 51

tttcatgttt gttcaaataa ttgcagctct 30

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M170位點(diǎn)的下游引物

<400> 52

accacacaaa aacaggtcct catttta 27

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M304位點(diǎn)的上游引物

<400> 53

aaaccacttc ctaattattc agactcaaga 30

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M304位點(diǎn)的下游引物

<400> 54

actttcaaaa cgtcttatac caaaatatca cc 32

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P209位點(diǎn)的上游引物

<400> 55

ggagtttgct tatgaagcca agga 24

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P209位點(diǎn)的下游引物

<400> 56

cacttattta agcattggtt ggtcacg 27

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M267位點(diǎn)的上游引物

<400> 57

cctgtgtttc catttctctt ttcctcat 28

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M267位點(diǎn)的下游引物

<400> 58

tcagctagat tgtgttcttc cacac 25

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M172位點(diǎn)的上游引物

<400> 59

ctgcctctca gtatcaacag gtaaaaa 27

<210> 60

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M172位點(diǎn)的下游引物

<400> 60

ccatgttggt ttggaacagt ttatcc 26

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M9位點(diǎn)的上游引物

<400> 61

caaggaattc gctgcagcat ataa 24

<210> 62

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M9位點(diǎn)的下游引物

<400> 62

aatgcataat gaagtaagcg ctacct 26

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P326位點(diǎn)的上游引物

<400> 63

gaggtcaaaa tttttagggt ccctca 26

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P326位點(diǎn)的下游引物

<400> 64

cctgtgtaag cacaaagtag gttct 25

<210> 65

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M526位點(diǎn)的上游引物

<400> 65

atcaaggaaa tttgtgtttt ccaaactgta aa 32

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M526位點(diǎn)的下游引物

<400> 66

tactttggga ggctgctgtt g 21

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P193位點(diǎn)的上游引物

<400> 67

gaaaaggtaa acaccatttc caccaat 27

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P193位點(diǎn)的下游引物

<400> 68

tagctttgtg ttttcagtag cacct 25

<210> 69

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M214位點(diǎn)的上游引物

<400> 69

tcaaaaacta ctggttactt tcgttcgt 28

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M214位點(diǎn)的下游引物

<400> 70

tgtcctatag gcccaggtac gc 22

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M231位點(diǎn)的上游引物

<400> 71

tggaaaatgt gggctcgttt taattat 27

<210> 72

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M231位點(diǎn)的下游引物

<400> 72

acagcaagtt tattcgttgt gtttga 26

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增TAT位點(diǎn)的上游引物

<400> 73

atatggactc tgagtgtaga cttgtga 27

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增TAT位點(diǎn)的下游引物

<400> 74

acaagaagaa cttcagcatt gggtat 26

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M178位點(diǎn)的上游引物

<400> 75

actccgaaag tctgcatgga ttag 24

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M178位點(diǎn)的下游引物

<400> 76

agtactgaat gcagcaatac tgtct 25

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M175位點(diǎn)的上游引物

<400> 77

gatttaaact ctctgaatca ggcacatg 28

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M175位點(diǎn)的下游引物

<400> 78

cttgattgac tgtaatccat gtactttgtc 30

<210> 79

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增L466的下游引物

<400> 79

aattgccata tgagagtcat cataggtg 28

<210> 80

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增L466位點(diǎn)的下游引物

<400> 80

ctctttcacc atagtaaaga cttggatg 28

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M119位點(diǎn)的上游引物

<400> 81

aaaaatgtta tgggttattc caattcagca 30

<210> 82

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M119位點(diǎn)的下游引物

<400> 82

ccaaggtaaa tgactcaccc taagga 26

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P203.1位點(diǎn)的上游引物

<400> 83

agttgttaac ctgtgctcaa atcct 25

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P203.1位點(diǎn)的下游引物

<400> 84

cgaatgtgct gtattgtgct gtatt 25

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F140位點(diǎn)的上游引物

<400> 85

ggatcatgaa tctgcagcga aca 23

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F140位點(diǎn)的下游引物

<400> 86

caggacaatg aaacattgag agatgttg 28

<210> 87

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F78位點(diǎn)的上游引物

<400> 87

gacatacaca caggcataga aaagaaag 28

<210> 88

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F78位點(diǎn)的下游引物

<400> 88

cactttttca agtgatgttt taggcact 28

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P31位點(diǎn)的上游引物

<400> 89

gggaacaggt aggtggtatt tgg 23

<210> 90

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P31位點(diǎn)的下游引物

<400> 90

ctgatacacg agaatcgctt ggg 23

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M95位點(diǎn)的上游引物

<400> 91

ccagcaatag tgttgcacct tct 23

<210> 92

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M95位點(diǎn)的下游引物

<400> 92

ccacattttg gtagtgcacc tgtt 24

<210> 93

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M88位點(diǎn)的上游引物

<400> 93

gctatggcct aggtgctttt cttat 25

<210> 94

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M88位點(diǎn)的下游引物

<400> 94

tatggtcttc catgtgatgg tcagta 26

<210> 95

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M176位點(diǎn)的上游引物

<400> 95

cattcttgag tgtgtggctt tcgta 25

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M176位點(diǎn)的下游引物

<400> 96

atgcacagag agaaataccc gaatt 25

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M122位點(diǎn)的上游引物

<400> 97

aggcgatgct gatatgctag ttc 23

<210> 98

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M122位點(diǎn)的下游引物

<400> 98

caaacttggt aaactctact tagttgcc 28

<210> 99

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M324位點(diǎn)的上游引物

<400> 99

cagaaacact gtcaatctga tttgatct 28

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M324位點(diǎn)的下游引物

<400> 100

tgtcatgata ttcacatttc tgaaatgctc 30

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P197位點(diǎn)的上游引物

<400> 101

ggccagcgaa atgatgacta attg 24

<210> 102

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P197位點(diǎn)的下游引物

<400> 102

tgaatccact agagaaagct acatagga 28

<210> 103

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P200位點(diǎn)的上游引物

<400> 103

cccattctat ctgttcctct ctcatgta 28

<210> 104

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P200位點(diǎn)的下游引物

<400> 104

cttgactgtt gaatggagat acatcttg 28

<210> 105

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增L467(KL2)位點(diǎn)的上游引物

<400> 105

accatctgtc ctcatccatt taaagg 26

<210> 106

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增L467(KL2)的下游引物

<400> 106

tgtgctccat gaaaaacatc gtaac 25

<210> 107

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增JST002611位點(diǎn)的上游引物

<400> 107

ccaacatact cgccaatcca atg 23

<210> 108

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增JST002611位點(diǎn)的下游引物

<400> 108

cagataccca gcagtattag ctgtg 25

<210> 109

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F11位點(diǎn)的上游引物

<400> 109

tacggtgcaa agtagcttga gatttta 27

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F11位點(diǎn)的下游引物

<400> 110

actgtactat cacacaattt tgtcagc 27

<210> 111

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P201位點(diǎn)的上游引物

<400> 111

aatatttact gagcatgatg tgctgtg 27

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增P201位點(diǎn)的下游引物

<400> 112

cactaacccc aaatcccaag gtag 24

<210> 113

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M133和M134位點(diǎn)的上游引物

<400> 113

tgtggagaga tacttttgat cccc 24

<210> 114

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M133和M134位點(diǎn)的下游引物

<400> 114

ggctttctga agcaaatacc agctt 25

<210> 115

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M117位點(diǎn)的上游引物

<400> 115

tcactaaaga gcttattaga tgatagaaaa aca 33

<210> 116

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M117位點(diǎn)的下游引物

<400> 116

accagcaaaa cttttcctat agaagca 27

<210> 117

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F444位點(diǎn)的上游引物

<400> 117

gtcacatgtc ttttggatac aaaccttc 28

<210> 118

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F444位點(diǎn)的下游引物

<400> 118

ggcattcgct cttaataaaa catgct 26

<210> 119

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F629位點(diǎn)上游引物

<400> 119

acctgctcca cttgtacata ctactc 26

<210> 120

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F629位點(diǎn)的下游引物

<400> 120

aaaaatctgt ttgctggtgc acaa 24

<210> 121

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F46位點(diǎn)的上游引物

<400> 121

attaggattt cagtataccc cttggga 27

<210> 122

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增F46位點(diǎn)的下游引物

<400> 122

ctccttttca ctgcaatgac cgt 23

<210> 123

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M45位點(diǎn)的上游引物

<400> 123

tctaggagag aggatatcaa aaattggc 28

<210> 124

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M45位點(diǎn)的下游引物

<400> 124

tacaactctc ctactctgat gagca 25

<210> 125

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M242位點(diǎn)的上游引物

<400> 125

ctacggcata gaaagtttgt gcaaaa 26

<210> 126

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M242位點(diǎn)的下游引物

<400> 126

tatttcgctt taagggcttt cagca 25

<210> 127

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M346位點(diǎn)的上游引物

<400> 127

ggaagagtaa atctgtccct ctatcct 27

<210> 128

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M346位點(diǎn)的下游引物

<400> 128

tgtaggagga tattcttcca ctcactc 27

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M3位點(diǎn)的上游引物

<400> 129

taagggcatc tttcatttta ggtacca 27

<210> 130

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M3位點(diǎn)的下游引物

<400> 130

gacacatctg aacactagtg gatttgc 27

<210> 131

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M207位點(diǎn)的上游引物

<400> 131

aggaaaaatc agaagtatcc ctgaagaa 28

<210> 132

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M207位點(diǎn)的下游引物

<400> 132

tcacttcaac ctcttgttgg aagattatt 29

<210> 133

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M173位點(diǎn)的上游引物

<400> 133

cacagtactc actttaggtt tgccata 27

<210> 134

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M173位點(diǎn)的下游引物

<400> 134

tttcccagat cctgaaaaca aaacact 27

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M17位點(diǎn)的下游引物

<400> 135

gccttgtctt gaagtggtat tggg 24

<210> 136

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M17位點(diǎn)的下游引物

<400> 136

catctgaaac ccacatacaa cagtc 25

<210> 137

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M343位點(diǎn)的上游引物

<400> 137

accctagcct tttaaatatg caaatgc 27

<210> 138

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M343位點(diǎn)的下游引物

<400> 138

acctttaata tgcaaatgcc agcgtta 27

<210> 139

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M124位點(diǎn)的上游引物

<400> 139

tgatcaactt ctttccctca acatagtt 28

<210> 140

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增M124位點(diǎn)的下游引物

<400> 140

ggcaacacca gaatctaaca aagcaa 26

<210> 141

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增rs17276345位點(diǎn)的上游引物

<400> 141

attattacca tcacctggca ctgaga 26

<210> 142

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增rs17276345的下游引物

<400> 142

ggaaaagggt ggaacaagac atttag 26

<210> 143

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增rs2075640位點(diǎn)的上游引物

<400> 143

ggttagttca gctgagcact cttc 24

<210> 144

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增rs2075640位點(diǎn)的下游引物

<400> 144

gcatttcctc ggtcagagaa gg 22