本發(fā)明涉及一種生物制劑培養(yǎng)基添加劑，具體地說是一種生物制劑培養(yǎng)基添加劑及生產(chǎn)方法和在培養(yǎng)基中的應(yīng)用，特別是涉及一種采用膽鹽為原料制備的生物制劑培養(yǎng)基添加劑及生產(chǎn)方法和在培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物制劑是以各類具有醫(yī)研價值的碳基生物為原料，利用傳統(tǒng)技術(shù)或現(xiàn)代生物技術(shù)制造，作用于人體各類生理癥狀的預(yù)防（保健）、治療和診斷的各種形態(tài)制劑。培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。

三號膽鹽（Bile Salts №3，簡稱BSNT）在細(xì)菌檢驗(yàn)工作中常用作選擇性抑菌劑和鑒定劑，是微生物培養(yǎng)、食品衛(wèi)生檢測、衛(wèi)生防疫和醫(yī)藥工業(yè)等方面常用的一種生化制劑。經(jīng)檢測它是由CA(膽酸)和DCA（去氧膽酸）與Na⁺結(jié)合形成的膽鹽產(chǎn)品，其中CA和DCA的含量分別為63.95﹪和20.01﹪。其制備工藝包括水解、酸沉、脫脂、堿溶脫色步驟（化學(xué)試劑，1997，19⑴，P15～18、P44三號膽鹽的研制，張延坤等）。三號膽鹽最早由英國Oxoid和美國Difco兩公司生產(chǎn)。上世紀(jì)八十年代進(jìn)入我國市場，每公斤的售價當(dāng)時為1500美元左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種采用膽鹽為原料制備的生物制劑培養(yǎng)基添加劑及生產(chǎn)方法和在培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

膽鹽為牛膽鹽，按專利號ZL201410413922.5所述方法生產(chǎn)，其膽鹽中膽酸含量55﹪～70﹪。本發(fā)明為添加劑主要成份。

十二烷基硫酸鈉為白色或淡黃色粉狀，是一種無毒的陰離子表面活性劑，易溶于水，與陰離子、非離子復(fù)配伍性好，具有良好的乳化、發(fā)泡、滲透、去污和分散性能。本發(fā)明在添加劑中主要用于降低膽鹽水溶液的表面張力，提高膽鹽水溶液的清亮度。

去氧膽酸鈉為白色結(jié)晶性粉末，類似膽汁氣味，有強(qiáng)烈苦味，易吸濕，易溶于水，微溶于無水醇，不溶于醚。用于配制細(xì)菌培養(yǎng)基，代替腦磷脂作膽固醇絮狀試驗(yàn)，蛋白質(zhì)分析。本發(fā)明在添加劑中協(xié)助膽鹽抑制大腸桿菌。

偏硅酸鈉為普通泡化堿與燒堿水熱反應(yīng)而制得的低分子晶體，商品有無水物、五水物和九水物，用作防腐劑、洗滌劑、粘合劑、防火劑和防水劑等。本發(fā)明偏硅酸鈉為無水物，在添加劑中協(xié)助膽鹽抑制大腸桿菌。

強(qiáng)氯凈主要成分是三氯異氰尿酸，為有機(jī)化合物，白色結(jié)晶性粉末或粒狀固體，具有強(qiáng)烈的氯氣刺激味。三氯異氰尿酸是一種極強(qiáng)的氧化劑和氯化劑，具有高效、廣譜、較為安全的消毒作用，對細(xì)菌、病毒、真菌、芽孢等都有殺滅作用，對球蟲卵囊也有一定殺滅作用。本發(fā)明在添加劑中協(xié)助膽鹽抑制大腸桿菌。

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的的，一種生物制劑培養(yǎng)基添加劑，以重量計，它由膽鹽、10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉、2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉、4﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉、0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強(qiáng)氯凈混配而成；所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪。

本發(fā)明所述膽鹽中膽酸含量優(yōu)選為60﹪～65﹪。

本發(fā)明所述十二烷基硫酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強(qiáng)氯凈優(yōu)選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。

一種如上所述生物制劑培養(yǎng)基添加劑在培養(yǎng)基中的應(yīng)用，即用于微生物SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的配制。

一種如權(quán)利要求1所述生物制劑培養(yǎng)基添加劑的生產(chǎn)方法，它包括下列步驟：

⑴以重量計，選取膽鹽，10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉，2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉，5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉，0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強(qiáng)氯凈，所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪；

⑵先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨30分鐘～90分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨90分鐘～150分鐘，即制備得目數(shù)為120目～150目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

本發(fā)明在步驟⑴中，所述膽鹽中膽酸含量優(yōu)選為60﹪～65﹪。

本發(fā)明在步驟⑴中，所述十二烷基硫酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強(qiáng)氯凈優(yōu)選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。

由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明較好的實(shí)現(xiàn)了發(fā)明目的，其配方合理，生產(chǎn)方法簡單，經(jīng)試驗(yàn)，制備的生物制劑培養(yǎng)基添加劑可有效替代進(jìn)口三號膽鹽用于配制微生物培養(yǎng)基SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：

一種生物制劑培養(yǎng)基添加劑，以重量計，它由膽鹽、10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉、2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉、5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉、0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強(qiáng)氯凈混配而成；所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪。

本發(fā)明所述膽鹽中膽酸含量優(yōu)選為60﹪～65﹪。

本發(fā)明所述十二烷基硫酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強(qiáng)氯凈優(yōu)選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。

一種如上所述生物制劑培養(yǎng)基添加劑的生產(chǎn)方法，它包括下列步驟：

⑴以重量計，選取膽鹽，10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉，2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉，5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉，0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強(qiáng)氯凈，所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪；

⑵先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨30分鐘～90分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨90分鐘～150分鐘，即制備得目數(shù)為120目～150目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

本發(fā)明在步驟⑴中，所述膽鹽中膽酸含量優(yōu)選為60﹪～65﹪。

本發(fā)明在步驟⑴中，所述十二烷基硫酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優(yōu)選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強(qiáng)氯凈優(yōu)選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。

一種如上所述生物制劑培養(yǎng)基添加劑在培養(yǎng)基中的應(yīng)用，即用于微生物SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的配制。

本實(shí)施例制備的所述生物制劑培養(yǎng)基添加劑用于配制SS瓊脂培養(yǎng)基。

本實(shí)施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產(chǎn)的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量60.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉520g（13﹪），去氧膽酸鈉165g（4.125﹪），偏硅酸鈉(無水)170g（4.25﹪），強(qiáng)氯凈25g（0.625﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨120分鐘，即制備得目數(shù)為140目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

在配制SS瓊脂培養(yǎng)基（2010年版國標(biāo)）時，取乳糖10克、檸檬酸鈉10克，牛肉膏粉5克、蛋白胨5克、無水硫代硫酸鈉8.5克、檸檬酸鐵1克、瓊脂粉12克、生物制劑培養(yǎng)基添加劑8.5克、煌綠0.00033克、中性紅0.025克。溶于1000ml蒸餾水中,煮沸至全部溶解，冷卻至55℃左右倒平皿約三毫米厚，置37℃恒溫箱中，2～3小時后取出平皿接種各種細(xì)菌。24小時后，觀察結(jié)果得知金黃色葡萄球菌（ATCC6538）受到抑制；大腸埃希氏菌（ATCC25922）部分受到抑制，菌落少，菌落直徑最大不超過2㎜；鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）菌落中心大部分有黑心，菌落直徑≥1.8㎜；福氏志賀氏菌（CMCC51572）菌落透明，菌落直徑2㎜左右。由實(shí)驗(yàn)可知，加入生物制劑培養(yǎng)基添加劑的SS瓊脂培養(yǎng)基可用于檢測待檢物，如體檢時檢測糞便，各種食品、肉、禽等，對致病菌的檢出率在70﹪以上。

本生物制劑培養(yǎng)基添加劑中的膽鹽是十分重要的成分，對大腸桿菌起抑制作用，對致病菌起促進(jìn)生長的作用。此外，在配制SS瓊脂培養(yǎng)基時，膽鹽、十二烷基硫酸鈉、強(qiáng)氯凈、偏硅酸鈉和去氧膽酸鈉能協(xié)同抑制大腸桿菌的生長，比單獨(dú)使用一種試劑要好，特別是強(qiáng)氯凈含氯，對大腸桿菌特別敏感，同時，偏硅酸鈉和去氧膽酸還有促進(jìn)致病菌生長的作用。本發(fā)明的生物制劑培養(yǎng)基添加劑可有效替代進(jìn)口三號膽鹽用于SS瓊脂培養(yǎng)基的配制。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產(chǎn)的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量65.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉550g（13.75﹪），去氧膽酸鈉180g（4.5﹪），偏硅酸鈉(無水)180g（4.5﹪），強(qiáng)氯凈20g（0.5﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨120分鐘，即制備得目數(shù)為140目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

余同實(shí)施例1。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產(chǎn)的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量52.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉480g（12﹪），去氧膽酸鈉100g（2.5﹪），偏硅酸鈉(無水)188g（4.7﹪），強(qiáng)氯凈16g（0.4﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨120分鐘，即制備得目數(shù)為140目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

在配制麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（2010年版國標(biāo)）時，取蛋白胨7g、酵母浸出粉3g 、乳糖10g、氯化鈉5g、三號膽鹽1.5g、中性紅0.03g、結(jié)晶紫0.002g，溶于1000ml蒸餾水，煮沸全部溶解后，調(diào)pH7.4±0.2，冷至55℃左右，倒平板，平板置37℃恒溫箱。2～3小時后取出平皿接種細(xì)菌。24小時后，觀察結(jié)果得知金黃色葡萄球菌（ATCC6538）受到完全抑制；大腸埃希氏菌（ATCC25922）部分受到抑制，菌落少，菌落直徑最大不超過2㎜，菌落周圍有沉淀環(huán)；福氏志賀氏菌（CMCC51572）菌落透明，菌落直徑≥2.0㎜；痢疾志賀氏菌（CMCC51105）菌落透明，菌落直徑≥2.0㎜。由實(shí)驗(yàn)可知，加入生物制劑培養(yǎng)基添加劑的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基可用于檢測待檢物，如體檢時檢測糞便，各種食品、肉、禽等，對致病菌的檢出率在75﹪以上。

聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織（WHO）早在上世紀(jì)八十年代便極力推薦使用麥康凱瓊脂，國家衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)也于2010年載入。本發(fā)明的生物制劑培養(yǎng)基添加劑可有效替代進(jìn)口三號膽鹽用于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的配制。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產(chǎn)的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量55.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉560g（14﹪），去氧膽酸鈉160g（4.0﹪），偏硅酸鈉(無水)170g（4.25﹪），強(qiáng)氯凈18g（0.45﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強(qiáng)氯凈，繼續(xù)球磨120分鐘，即制備得目數(shù)為140目的生物制劑培養(yǎng)基添加劑。

余同實(shí)施例3。