一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地,本發(fā)明涉及一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有乳化橄欖油5%(w/v),果糖0.25--2%(w/v),酵母浸粉0.05--0.4%(w/v),Na+0.015-0.12mol/L,VB20.005-0.04%(w/v),pH7.4-7.7,將發(fā)酵種子液接種于該培養(yǎng)基,250mL的三角瓶裝液量為75mL,接種量5%,于25℃,轉(zhuǎn)速120r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短;條件溫和,易于控制;提供的用于蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基,具有脂肪酶產(chǎn)率高,脂肪酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地,本發(fā)明涉及一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜜蜂球囊菌是寄生于蜜蜂幼蟲的一種真菌,可以引起蜜蜂白堊病。蜜蜂白堊病不僅使蜜蜂數(shù)量減少,而且蜂蜜產(chǎn)量也下降,近幾年,有證據(jù)表明這種病的發(fā)生概率有增加的趨勢(shì)。蜜蜂球囊菌也是影響我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的潛在病害之一,對(duì)我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展影響巨大。本發(fā)明就是希望從脂肪酶上分析蜜蜂球囊菌,提高脂肪酶的產(chǎn)量,對(duì)推動(dòng)蜜蜂白堊病的防治研究具有指導(dǎo)性意義,為以后蜜蜂球囊菌的致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。
[0003]脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是廣泛存在于各類動(dòng)物、植物和微生物中的一種酶,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用,具有顯著的生理意義和生產(chǎn)應(yīng)用的潛能。微生物來源的脂肪酶含量最為豐富。由于微生物種類多、繁殖快,易發(fā)生遺傳變異,產(chǎn)生的脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶作用更廣的PH值、反應(yīng)溫度范圍以及底物專一性;而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶,適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和樣品提純,因此,微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源,是生物技術(shù)和有機(jī)化學(xué)應(yīng)用中使用最為廣泛的酶類之一。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。
[0005]本發(fā)明首先提供了一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的原料含有乳化橄欖油5% (w/v),果糖0.25—2% (w/v),酵母浸粉0.05— 0.4% (w/v), Na+0.015-0.12 mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v),pH7.4—7.7。
[0006]本發(fā)明優(yōu)選的一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基含有乳化橄欖油5% (w/v),果糖 2% (w/v),酵母浸粉 0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L, VB2 0.02 % (w/v),pH7.4。
[0007]其次,本發(fā)明還提供了一種蜂球囊菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法,所述方法包含以下步驟:
(a)將蜂球囊菌(鄭志陽(yáng),李江紅,梁勤,陳大福.蜜蜂球囊菌分泌多種胞外酶侵染蜜蜂幼蟲.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào),2011,40(3),9月30日)接種于種子培養(yǎng)基,制得發(fā)酵種子液;
(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于上述發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基中,250mL的三角瓶裝液量為75mL,接種量5%,于25°C,轉(zhuǎn)速120 r/min下培養(yǎng)。
[0008]所述種子培養(yǎng)基PDA的原料含有:按培養(yǎng)基重量計(jì),馬鈴薯20%,蔗糖2%。
[0009]采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基,菌齡3d,發(fā)酵周期96h,發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果蜂球囊菌產(chǎn)脂肪酶為14U/mL以上。
[0010]本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短;條件溫和,易于控制;提供的用于蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基,具有脂肪酶產(chǎn)率高,脂肪酶活力高,脂肪酶活性穩(wěn)定以及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
[0013]實(shí)施例1
單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)種子培養(yǎng)基配制:馬鈴薯去皮,切塊,稱取200g,沸水煮30min,6層紗布過濾,稱取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000mL, pH自然。高壓滅菌121。。,20min。
[0014](2)發(fā)酵種子液的制備:將蜂球囊菌接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上,于30°C下培養(yǎng)3d,待其產(chǎn)孢子,即活化;將活化后的菌株用接種針將蜂球囊菌菌塊(0.5X0.5cm)接種至種子培養(yǎng)基,25°C,轉(zhuǎn)速120 r/min下培養(yǎng)48h即為發(fā)酵種子液。
[0015](3)酶液的制備:取步驟(2)中的發(fā)酵種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基,25°C,轉(zhuǎn)速120 r/min下培養(yǎng)72h,所得發(fā)酵液在4°C下,8000 r/min離心,lOmin,得上清液即為粗酶液,4°C
保存,待用。
[0016](4)脂肪酶酶活測(cè)定:酶活測(cè)定方法采用對(duì)硝基苯酚法。酶活定義為:在PH
8.0、50 °C條下,每分鐘水解p-NPP釋放I ii mo I對(duì)硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個(gè)脂肪酶活力單位(U)。
[0017]方法:溶液A: 150 mg p-NPP溶于50 mL異丙醇;溶液B:500 mL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯膠。
[0018]取2個(gè)試管(分別是對(duì)照管和樣品管),各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL(緩慢混合,該溶液至少可穩(wěn)定2 h)。50 °C水浴中預(yù)熱5 min,然后在對(duì)照管中加入已滅活的酶液0.05 mL,樣品管中加入酶液0.05 mL,立即混勻計(jì)時(shí)。在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min時(shí)馬上測(cè)定410 nm下酶水解產(chǎn)生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活計(jì)算公式:A= CtA1 - A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)
A——樣品酶活(u/mL) A1——樣品的吸光度值(OD410值)A0——空白對(duì)照的吸光度值
(OD410值校準(zhǔn)為0) K-p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率
C0-p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距N-稀釋倍數(shù)V1-反應(yīng)液的體積(3 mL)
V2——酶液的體積(0.05 mL) t——反應(yīng)時(shí)間(10 min)
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:
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[0019](6)不同碳源、氮源、金屬離子、維生素對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響
(a)碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響,在含有乳化橄欖油50.0 g / L,K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl20.lg/ L, NaCl 0.5 g / L,Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (NH4)2SO4 l.0g/ L,的培養(yǎng)基中分別添加10.0 g / L葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、木糖醇、甘露醇、a-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、甲殼素、糊精、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、檸檬酸,以不加任何碳源為對(duì)照。0.1MPa,滅菌20min (下同)。各接入10%的種子發(fā)酵液,在25°C、120r/min的搖床中培養(yǎng)4d測(cè)酶活,結(jié)果見表1。
[0020](b)氮源對(duì)酶產(chǎn)量的影響,在含有乳化橄欖油50.0 g / L,K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L,,葡萄糖 10.0 g / L 的培養(yǎng)基中分別添加1.0 g / L的胰蛋白胨、酵母浸粉、甘氨酸、過硫酸銨、蛋白胨、尿素、酸水解酪蛋白、NH4N03、NaN03、(NH4) 2S04、KN03、(NH4) 2HP04,以不加任何氮源為對(duì)照。滅菌,各接入10%的種子發(fā)酵液,在25°C、120r/min的搖床中培養(yǎng)4d檢測(cè)酶活性,結(jié)果見表2。
[0021](C)金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響,在含有乳化橄欖油50.0 g / L、(MM)2SO4 1.0 g / L,葡萄糖10.0 g / L的培養(yǎng)基分別添加0.02496mol/L (以6 (a)中含有的金屬離子按其濃度換算得來)KCUMgCl2 ? 6H20、NaCl、ZnCl2、CuCl2 ? 2H20、MnCl2 ? 4H20、CaCl2'FeCl2 ? 4H20、FeCl3 *6H20、BaCl2*2H20、,以不加任何金屬離子為對(duì)照。滅菌,各接入10%的種子發(fā)酵液,在25°C、120r/min的搖床中培養(yǎng)4d檢測(cè)酶活性,結(jié)果見表3。
[0022](d)維生素對(duì)酶產(chǎn) 量的影響,在含有乳化橄欖油50.0 g / L,K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L,葡萄糖10.0 g / L的培養(yǎng)基中分別添加0.01%葉酸、煙酸、硫胺素VB1' VB4、核黃素VB2、吡哆醇類VB6、抗壞血酸V。、VE,以不加任何維生素為對(duì)照。滅菌,各接入10%的種子發(fā)酵液,在25°C、120r/min的搖床中培養(yǎng)4d檢測(cè)酶活性,結(jié)果見表4。
[0023](e) pH值對(duì)酶產(chǎn)量的影響,在含有乳化橄欖油50.0 g / L,K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L,葡萄糖10.0 g / L 的培養(yǎng)基中分別用 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié) pH 值為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,滅菌。各接入10%的種子發(fā)酵液,在25°C、120r/min的搖床中培養(yǎng)4d檢測(cè)酶活性,結(jié)果見表5。
[0024]表1不同碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響
序+?-mm+平均_活 u:/n?L)
ICK丨6.10906
【權(quán)利要求】
1.一種蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基的原料含有乳化橄欖油 5% (w/v),果糖 0.25—2% (w/v),酵母浸粉 0.05— 0.4% (w/v), Na+ 0.015-0.12mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v),pH7.4—7.7。
2.一種如權(quán)利要求1所述蜂球囊菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基含有乳化橄欖油5% (w/v),果糖2% (w/v),酵母浸粉0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L,VB2 0.02 % (w/v), pH7.4。
3.—種蜂球囊菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法,其特征在于,所述方法包含以下步驟: (a)將蜂球囊菌接種于種子培養(yǎng)基,制得發(fā)酵種子液; (b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于權(quán)利要求1或者2所述的發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基中,250mL的三角瓶裝液量為75mL,接種量為5%,于25°C、轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)。
4.如權(quán)利3所述蜂球囊菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法,其特征在于,所述種子培養(yǎng)基為PDA,其原料含有:按培養(yǎng)基重量計(jì),馬鈴薯20%,蔗糖2%。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103484440SQ201310283999
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月8日
【發(fā)明者】邱君志, 李小霞, 郭慶豐, 何肖云, 張以盼, 曹麗萍, 涂潔, 孟麗雪, 董冬, 陳大福 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)