本發(fā)明涉及生物物種鑒定和PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種用于檢測雞源成分的內(nèi)標(biāo)基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會經(jīng)濟(jì)和產(chǎn)品技術(shù)加工的發(fā)展，很多食品被非法添加各種化學(xué)原料、添加劑、激素等，甚至很多商家為謀求高額利益進(jìn)行食品摻假行為或直接以次充好，這嚴(yán)重危害了消費者的利益和身體健康，因此對食品種類的準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。

無論在國內(nèi)還是國外，雞肉都是日常消費的主要肉類，其重要性不言而喻。在歐洲，雞肉占據(jù)了主要市場，超市供應(yīng)著60％的雞肉加工品，火雞更是被普遍消費。在中國，雞肉是傳統(tǒng)的家禽肉，隨著種類繁多的國外快餐進(jìn)入中國市場，雞肉被加工成了各種產(chǎn)品。然而越來越多的商家為獲取高額利益，用激素和抗體喂養(yǎng)雞使其加速增長，飼養(yǎng)過程中在雞飼料中添加雞成分會引發(fā)“瘋雞病”，更有不法商家用便宜的雞肉摻假牛羊肉，以謀取暴力等。而雞肉污染可能引發(fā)全球性食品安全問題，利用雞的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和分子技術(shù)檢測雞肉摻假是一種有效的檢測手段。

目前，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因已被廣泛地用于鑒別食品摻假，但如何篩選出合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因顯得尤為重要。目前國內(nèi)外的肉制品摻假檢測技術(shù)多是針對線粒體上的基因設(shè)計特異引物來進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，由于線粒體基因為多拷貝基因，其檢測靈敏度高，但同時在區(qū)分由于銷售、運輸?shù)冗^程所產(chǎn)生的無意識交叉污染與有意識的非法添加時存在困擾。另外，高拷貝數(shù)線粒體DNA的濃度無法和基因組DNA的濃度相對應(yīng)，因此無法對樣品進(jìn)行精確定量分析，同時由于線粒體 基因同源性極高，難以通過普通PCR實現(xiàn)定性檢測。因此，該方法只能借助熒光定量PCR實現(xiàn)肉類摻假的篩選鑒別。若要鑒別低濃度的無意交叉污染和有意非法添加并明確摻假比例實現(xiàn)快速篩查，則要選擇染色體上的低拷貝基因作為肉類內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于檢測雞源成分的雞源通用內(nèi)標(biāo)基因Actb。

本發(fā)明另一目的在于提供以該內(nèi)標(biāo)基因Actb為靶基因建立的檢測方法。

一種用于檢測食品及飼料中雞源成分的基因，其為內(nèi)標(biāo)基因Actb，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)基因Actb在檢測雞源成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)基因Actb在食品或飼料中雞成分鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種用于PCR方法檢測上述內(nèi)標(biāo)基因Actb的特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示。

本發(fā)明提供的上述特異性引物在檢測雞源成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了含有上述特異性引物的試劑盒。

含有上述2條引物和1條探針的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述1條探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.7所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了含有2條引物和2條探針的試劑盒，所述2條引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示，所述2條探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、7所示。

本發(fā)明提供的上述試劑盒在檢測雞源成分中的應(yīng)用。

數(shù)字PCR方法通常用于對核酸的絕對定量分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR還能夠用于檢測基因的拷貝數(shù)。因此該發(fā)現(xiàn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在本發(fā)明的一個實施例中，采用數(shù)字PCR方法方法鑒定雞源內(nèi)標(biāo)基因Actb，結(jié)果與Southern blot方法檢測內(nèi)標(biāo)基因Actb拷貝數(shù)的結(jié)果一致。所用的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示，與引物配合使用的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本發(fā)明首次在染色體上篩選出雞源內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，且拷貝數(shù)為單拷貝。本發(fā)明用多個品種雞驗證內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，證明該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因穩(wěn)定不存在等位基因變異。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的選擇一般要求拷貝數(shù)低且穩(wěn)定，一般動物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因常選擇在線粒體上，這樣的內(nèi)參基因拷貝數(shù)多，不易于定量。本發(fā)明選擇染色體上的基因做為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，其拷貝數(shù)地易于定量，相比于線粒體上的基因，突變率更低。本發(fā)明采取數(shù)字PCR以及southern雜交兩種方式，進(jìn)行拷貝數(shù)的鑒定。結(jié)合Ensembl基因信息數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，確定了Actb基因的拷貝數(shù)為單拷貝，同時確定了數(shù)字PCR在驗證拷貝數(shù)上的準(zhǔn)確性，可以推廣至其他物種。

基于本發(fā)明確定的用于檢測食品及飼料中雞源成分的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Actb，本發(fā)明設(shè)計了用于檢測該基因的定性PCR、定量PCR和數(shù)字PCR的引物和/或探針，建立了檢測雞源成分的相應(yīng)PCR方法，這些方法費時少，特異性好，靈敏度高，操作簡單，不需要專業(yè)人員操作，結(jié)果易于觀察，非常適于基層食品監(jiān)督檢驗使用。

附圖說明

圖1為基因同源性分析。

圖2為普通家雞、火雞的Southern雜交結(jié)果，1,BamH1酶切普通家雞；2,Nhe1酶切普通家雞；3,BamH1酶切火雞4,Nhe1酶切火雞。

圖3為Actb和Gcg擴(kuò)增熱點圖。

圖4為普通家雞5個濃度梯度下的Actb/Gcg比值圖，濃度分別為100,10,1,0.1,0.01ng/ul。

圖5為Actb基因的定性PCR驗證特異性，泳道1-21:1,普通家雞；2,野雞；3,火雞；4,烏雞；5,豬；6,牛；7,羊；8,馬；9,驢；10,鴨；11,鵝；12, 狗；13,兔；14,鼠；15,魚；16,牦牛；17,水牛；18,駱駝；19,貂；20,鹿；21,陰性；M:DNA Marker DL 2000。

圖6為Actb基因的定量PCR驗證特異性，其中1是野雞，2是烏雞，3是普通家雞，4是火雞。

圖7為Actb基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，其中1為100ng/ul，2為10ng/ul，3為1ng/ul，4為0.1ng/ul，5為0.01ng/ul，6為陰性。每個濃度做三個平行。

圖8為Actb基因的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

豬(Sus scrofa),牛(Bos taurus)，羊(Ovis aries)，普通家雞(Gallus gallus)，野雞(Phasianuscolchicus)，火雞(Meleagris gallopavo)，烏雞(Gallus domesticus brisson)，鴨(Anas platyrhynchos)，鵝(Goose calicivirus),狗(Canis lupus familiaris)，兔(Oryctolagus cuniculus)，牦牛(Bos mutus)，黃魚(Pseudosciaena polyactis)為超市購買。馬(Equus caballus)，驢(Equus asinus)為北京農(nóng)貿(mào)市場購買。老鼠(Mus musculus)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與分子生物學(xué)實驗室提供。水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，駱駝(Camelus ferus)，鹿(Cervus)由天津出入境檢驗局的李宗夢博士提供。

實施例1雞源通用內(nèi)標(biāo)基因Actb的篩選

通過搜索GenBank中關(guān)于雞的基因信息，將目標(biāo)基因組從NCBI下載，并保存為“.FASTA”格式。針對雞的全基因組信息進(jìn)行分析，利用BLAST和DNAMAN Version 4.0軟件進(jìn)行同源性分析，篩選出Actb基因，該基因位于染色體上，是細(xì)胞骨架肌動蛋白之一。將20種肉類(分別是普通家雞(Gallus gallus),野雞(Phasianuscolchicus)，火雞(Meleagris gallopavo)，烏雞(Gallus domesticus brisson)，豬(Sus scrofa),牛(Bos taurus),羊(Ovis aries),鴨(Anas platyrhynchos),鵝(Goose calicivirus),狗(Canis lupus familiaris),兔(Oryctolagus cuniculus),牦牛(Bos mutus),黃魚(Pseudosciaena polyactis)，馬(Equus caballus),驢(Equus asinus)，老鼠(Mus musculus)，水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，駱駝(Camelus ferus)，鹿(Cervus))的Actb基因?qū)隓NAMAN Version 4.0，進(jìn)行多序列特異性分析，序列比對結(jié)果保存為“.seq”格式。選擇特異性高的片段再進(jìn)行BLAST分析，查找數(shù)據(jù)庫中序列同源性及特異性。最后通過對序列進(jìn)行整合，確定最終的特異性目標(biāo)基因β-Actin(Actb)基因可以作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。該Actb片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

實施例2雞源通用內(nèi)標(biāo)基因的驗證

1、針對實施例1篩選的內(nèi)部基因Actb，通過Primer Express 3.0設(shè)計軟件(美國生命技術(shù)公司)針對Actb基因設(shè)計PCR及定量PCR引物和探針。

表1定性PCR、定量PCR及數(shù)字PCR所用引物和探針序列

注：FAM,TAMRA,VIC和BHQ1為4種熒光基團(tuán)

2、拷貝數(shù)測定

采取數(shù)字PCR以及southern雜交兩種方式，進(jìn)行拷貝數(shù)的鑒定。結(jié)合Ensembl基因信息數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，確定了Actb基因的拷貝數(shù)為單拷貝，同時確定了數(shù)字PCR在驗證拷貝數(shù)上的準(zhǔn)確性，可以推廣至其他物種。

理想的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在相應(yīng)的物種中應(yīng)該拷貝數(shù)恒定并不存在等位基因變異。根據(jù)Actb基因利用引物Actb-1F/1R建立雞源物種特異性PCR檢測體系，用于分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的中間特異性以及等位基因變異性，以保證內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因篩選的準(zhǔn)確性。利用引物進(jìn)行定性及定量分析后發(fā)現(xiàn)，Actb基因在雞物種中不存在等位基因變異。對模板DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，利用引物Actb-1F/1R和探針Actb-1P進(jìn)行熒光定量PCR對靈敏度分析，當(dāng)DNA模板濃度最低至10pg時，依然能檢測到熒光信號，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到良好的線性方程為：y＝-3.196x+32.481，R²＝0.994。由前面拷貝數(shù)鑒定可知Actb基因在普通家雞、火雞、烏雞和野雞中均為單拷貝，由此可推測，該內(nèi)參基因Actb和定量PCR體系同樣也適合用于火雞、烏雞和野雞的定量檢測，其檢測限為8個拷貝數(shù)。

為了鑒定Actb在雞中的拷貝數(shù)，本發(fā)明設(shè)計了一對引物Actb-2F/2R擴(kuò)增一段436bp DNA片段，該片段作為探針用于Southern blot。用Nhe1和BamH1分別切割雞、火雞的DNA，然后和436bp DNA片段雜交。由圖2可知Nhe1和BamH1酶切的DNA片段中均只出現(xiàn)一條條帶，這表明Actb基因在雞和火雞中為單拷貝。

此外，利用引物Actb-1F/1R和探針Actb-2P進(jìn)行數(shù)字PCR做拷貝數(shù)分析。體系配置完成后，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至Droplet Generator Cartridge微滴生成卡的體系加樣孔中，并在反應(yīng)用油加樣孔中加入70μL的數(shù)字PCR反應(yīng)用油；加樣完成后，將微滴生成卡轉(zhuǎn)移至Droplet Generator微滴生成器中，啟動儀器；微滴生成結(jié)束后，將生成完成后的微滴體系轉(zhuǎn)移至96孔中封膜；將96孔板置于PCR儀中，PCR擴(kuò)增程序為50℃熱激活5min；95℃預(yù)變性5min；50個循環(huán)：95℃變性15s，60℃退火及延伸60s。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板取出，置于Droplet Reader微滴讀取儀中進(jìn)行微滴熒光讀??；微滴信號采集采用FAM/VIC雙通道熒光采集，熒光采集后，通過分析熱點圖確定熒光閾值限(2995)以確定陰性微滴和陽性微滴。

根據(jù)泊松分布，利用公式計算出每個通道的拷貝數(shù)。具體公式如下：

公式1：N(參照基因)＝-ln[(N-X)/N]×N

公式2：N(特異基因)＝-ln[(N-Y)/N]×N

其中，N(參照基因)和N(特異基因)分別表示計算出的參照基因(即單拷貝Gcg基因)和特異基因(即本實驗Actb內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因)的拷貝數(shù)；N是總孔數(shù)，X表示參照基因?qū)?yīng)的陽性孔數(shù)，Y表示特異基因?qū)?yīng)的陽性孔數(shù)。

將雞模板濃度定到100ng/ul，依次稀釋5個濃度梯度，然后用數(shù)字PCR計算出Actb/Gcg的值，由圖3可知，Actb/Gcg的值為1:1。Actb/Gcg的比值和誤差限均由熱點圖自動生成。由圖4可知，當(dāng)模板濃度很高時，反應(yīng)結(jié)果的穩(wěn)定性依然很好，結(jié)果波動范圍小，比值和誤差限在1附近。隨著濃度降低，雖然結(jié)果波動表現(xiàn)出較大差異，誤 差限明顯變寬，但Actb/Gcg的值在仍1左右。表明Actb/Gcg值的結(jié)果不受模板濃度的影響。Southern雜交結(jié)果和數(shù)字PCR結(jié)果一致，說明數(shù)字PCR是一種高效、快速、準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)基因拷貝數(shù)的方法，可以應(yīng)用數(shù)字PCR方法鑒定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。

表2 Bio-Rad數(shù)字PCR平臺反應(yīng)體系

3、Actb基因的特異性鑒定及其等位基因變異的分析

利用設(shè)計的引物對Actb-1F/1R(見表1)對4種雞物種(普通家雞、火雞、烏雞、野雞)和16種非雞物種(豬、牛、羊、鴨、鵝、狗、兔、牦牛、馬、驢、鼠、水牛、貂、駱駝、鹿、魚)進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增并用2％的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。同時進(jìn)行定量PCR分析，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)；60℃采集信號。結(jié)果表明，所有4種雞物種均能擴(kuò)增出113bp的片段，符合所設(shè)計引物對應(yīng)的片段大小。而其它16種非雞物種均無特異性擴(kuò)增條帶(圖5)。用引物Actb-1F/1R和探針Actb-1P進(jìn)行定量PCR對該20種物種進(jìn)行檢測，4種雞物種能檢測到信號而16種非雞物種沒有檢測到信號(圖6)。這表明該基因以及對應(yīng)的引物可以用來特異性地檢測雞及雞源性產(chǎn)品。

表3定性PCR反應(yīng)體系

表4定量PCR反應(yīng)體系

4、定量PCR靈敏度驗證

為了評定熒光定量PCR的靈敏性，將家雞的基因組DNA濃度10倍稀釋7個梯度，100ng,10ng,1ng,0.1ng,10pg,1pg,0.1pg，進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增曲線如圖7，取5個點繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，當(dāng)DNA模板濃度最低至10pg時，能檢測到熒光信號。因此，該熒光定量體系的檢測限是10pg DNA，也就是8個拷貝數(shù)。同時給出了關(guān)于Cq值與基因組濃度的對數(shù)之間線性方程。 線性方程為：y＝-3.196x+32.481，R²＝0.994。y代表Cq值，x代表基因組濃度的對數(shù)值，R²代表線性相關(guān)系數(shù)。根據(jù)R²值可知雞基因組DNA的拷貝數(shù)和Ct值間具有良好的線性關(guān)系。由前面拷貝數(shù)鑒定可知Actb基因在普通家雞、火雞、烏雞和野雞中均為單拷貝，由此可推測，該基因和定量PCR體系也適合用于火雞、烏雞和野雞的定量檢測，其檢測限為8個拷貝數(shù)。

5、雞肉加工品檢測

為驗證本發(fā)明所確定的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因以及建立的定量PCR檢測技術(shù)在實際樣品檢測過程中的準(zhǔn)確性，本研究對市售14種雞肉加工品和6種混合肉制品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有4種食品及2種飼料存在收集不到熒光信號的現(xiàn)象，這與KOKA雞肉沙爹口味方便面、合味道雞肉味杯面、張君雅小妹妹炭燒雞汁點心面、墨西哥辣雞點心面配方中顯示不含雞源性成分以及雞飼料中不含雞源性成分實際情況相符，表明本研究建立的熒光定量PCR方法可以用于實際樣品的檢測。

表5雞肉加工品和混合肉檢測結(jié)果

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 用于檢測雞源成分的內(nèi)標(biāo)基因及其應(yīng)用

<130> KHP161117577.3

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 雞Actb

<400> 1

aacaactggt cagatgcagt gtgatggtac acaacccaca cgcagccctg tggcgctccg 60

ctacctaatt cctttatcag gccttggcca aggcactcca gagtctgagc aggcttaagg 120

cacagcccta cacacagcac cctccccctc ccaccccaac tcacagccag cacttaatct 180

cattactcac atggctgagt ggctgccacc ctgcccagag cgaggccata aggctccacc 240

actaagacaa agcagtttcc atcttctgta gtagtttagc tcagcctcct ccacccactc 300

agcattaaga ggtgtgctaa gagcagccta gggctccagc ctaccttgat tttcattgtg 360

ctaggtgcca gggctgtgat ctccttctgc atcctgtcag caatgccagg gtacattgtg 420

gtaccaccag acagcactgt gttggcatac agatccttac ggatatccac atcacacttc 480

atgatggagt tgaaggtagt ttcatggata ccacaggact ccatacctgc aagcaaaaag 540

cagtgtcaag tcagtaaatg gttcagggac aaggaagaca gaggacctac tgctatggga 600

aaacaagaga atcaaacacc ccatagtggg aaacaacaca gacaaaggca tggctgacag 660

gctcagcctc ctgttctact gacctaggta cctcaatcat cctcaaactg aggaagaaaa 720

aagactgcag tggaatggga cagacctgct aagggccagc aatattgtgg ccagtctcta 780

agtcgctcta ggcagaaggg gcatggaatc tcctcaaagg agtcagactt acccaagaaa 840

gatggctgga agagggcctc ggggcacctg aacctctcat tgccaatggt gatgacctga 900

ccatcaggga gttcatagct cttctctagg gaagagctag aggcagctgt ggccatctcc 960

tgctcgaaat ccagtgcgac gtagcacagc ttctccttga tgtcacgcac aatttctctc 1020

tcggctgtgg tggtgaagct gtagcctctc tctgtcagga tcttcatgag gtagtccgtc 1080

aggtcacggc cagccagatc cagacggagg atggcatggg ggagggcgta gccttcatag 1140

atgggcacag tgtgggtaac accatcacca gagtccatca caataccagt ggtacgacca 1200

gaggcataca gggacagcac agcctggatg gctacataca tggctggggt gttgaaggtc 1260

tcaaacatga tctagaaaga taaaaaaagc actgagtcaa gcagaataaa ccaaggttct 1320

cactgcacac ctacatcggt ccatgcatgt ggtttacatt tgtccctaga taagaggctt 1380

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacctaggt acctcaatca tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctagagtga cttagagact gg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagacctgct aagggccagc aata 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaatttcca agcgtcattc tga 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcttcctcg tccattcact aacc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagacctgct aagggccagc aata 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaatttcca agcgtcattc tga 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttcttcctcg tccattcact aacc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgagagaca tgctgaaggc acct 24