本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的鑒定方法，尤其涉及應(yīng)用PNA-FISH法鑒定金黃色葡萄球菌的方法及試劑盒和PNA探針。
背景技術(shù)：
化妝品的微生物污染是影響化妝品質(zhì)量和危害人體健康的重要因素?；撔约?xì)菌污染可引起皮膚和眼部的感染，當(dāng)人體抵抗力低時(shí)，某些非病原菌或條件致病菌也會(huì)引起感染。微生物的有毒代謝產(chǎn)物可使人中毒。即使污染的微生物被殺滅，其殘存的菌酶也會(huì)引起產(chǎn)品變質(zhì)，變質(zhì)時(shí)分解的某些組分可對皮膚產(chǎn)生刺激作用。此外，由于化妝品停留在人體皮膚、毛發(fā)、粘膜、眉眼部和口唇等部位時(shí)間較長，所含微生物特別是致病菌，可從與人體接觸的部位進(jìn)人體內(nèi)，引起感染，有時(shí)甚至是致命性的?！痘瘖y品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)中規(guī)定每克或每毫升產(chǎn)品中不得檢出金黃色葡萄球菌，從而避免消費(fèi)者因使用化妝品而造成皮膚化膿性感染等傷害。
肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等人設(shè)計(jì)的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結(jié)構(gòu)單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結(jié)合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或RNA-DNA互補(bǔ)鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補(bǔ)不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA親和性，在無錯(cuò)配的情況下其結(jié)合具有高穩(wěn)定性，且雜交速度快，具有良好的細(xì)胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時(shí)PNA探針結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)(FISH)，與傳統(tǒng)生化鑒定比較，PNA-FISH法可節(jié)約大量時(shí)間，若不計(jì)增菌時(shí)間，一般耗時(shí)不超過4個(gè)小時(shí)。與PCR等方法比較，PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種金黃色葡萄球菌的肽核酸原位熒光雜交鑒定PNA探針，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供采用上述的PNA探針的鑒定方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供采用上述的PNA探針的試劑盒。本發(fā)明設(shè)計(jì)了具金黃色葡萄球菌特異性的PNA探針，并結(jié)合FISH檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
一種金黃色葡萄球菌的肽核酸原位熒光雜交鑒定PNA探針，該P(yáng)NA探針的核苷酸序列如下：GGATCCGCGCTGCAT T-FAM。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
一種金黃色葡萄球菌的肽核酸原位熒光雜交鑒定方法，該方法包括以下的步驟：
1)離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，PBS調(diào)整細(xì)菌濃度至OD600＝1.0，取10μl菌液于98％酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80％的酒精中浸泡15min，風(fēng)干；
2)取25μl含500pmole/ml權(quán)利要求1所述的PNA探針的雜交緩沖液滴加于玻片上，55℃作用1.5h，雜交后玻片于55℃預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次10分鐘，取2-5μl菌液涂片，風(fēng)干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。
作為優(yōu)選，所述的PNA探針的雜交緩沖液pH7.5含有以下的組分：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸鈉，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HC。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
一種金黃色葡萄球菌的肽核酸原位熒光雜交鑒定試劑盒，該試劑盒包括含有所述的PNA探針的雜交緩沖液。
PNA探針的雜交緩沖液pH7.5含有以下的組分：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸鈉，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HC。
本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，由于PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時(shí)結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。PNA-FISH法具有快速特點(diǎn)，一般整個(gè)鑒定過程耗時(shí)不超過4個(gè)小時(shí)；PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
具體實(shí)施方式
1.PNA探針的設(shè)計(jì)
在NCBI網(wǎng)站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)獲得了若干金黃色葡萄球菌和葡萄球菌屬的16S rRNA序列，用MegAlign軟件(version 5.0；DNASTAR,Madison,WI)的ClustalV算法進(jìn)行排序。在排序后的在變異區(qū)域設(shè)計(jì)了金黃色葡萄球菌特異性探針SA-16S-1。探針序列見表1。
為了驗(yàn)證探針的靈敏度和特異性，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和ProbeCheck(http://www.microbial-ecology.net/probecheck)對探針進(jìn)行了驗(yàn)證。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計(jì)的探針具有很高的特異性。只有極少數(shù)非目標(biāo)葡萄球菌與探針SA-16S-1有重合區(qū)域，如Staphylococcus equorum，Staphylococcus phage，但以上非目標(biāo)細(xì)菌極罕見，因此一般不會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。又將PNA探針與大亞基(23S/28S)數(shù)據(jù)庫匹配檢測，發(fā)現(xiàn)沒有序列與之匹配，不會(huì)發(fā)生混淆。
經(jīng)過BLAST和ProbeCheck驗(yàn)證，所設(shè)計(jì)的探針SA-16S-1理論上具有很高的靈敏度和特異性。與陽性對照探針BacUin一起被用于后續(xù)檢測。
表1 PNA探針序列
a BacUin為陽性對照探針；引用自Perry-O'Keefe,H.,Stender,H.,Broomer,A.,Oliveira,K.,Coull,J.,Hyldig-Nielsen,J.J.,2001.Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection,identification and enumeration of specific micro-organisms.J Appl Microbiol 90(2):180-189.探針合成和標(biāo)記由韓國Panagene完成.
2.固相PNA熒光原位雜交
離心(2000g，5min)收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至OD600＝0.5-2.0,取10μl菌液于98％酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80％的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；25μl含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液(pH7.5，10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸鈉，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小時(shí)，雜交后玻片于55℃預(yù)熱的洗滌緩沖液(pH10，5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)TritonX-100)中洗滌2次，每次10分鐘，取2～5μl菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。
試驗(yàn)例1PNA-FISH敏感度驗(yàn)證
選取了12株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)方法如上所述。每次試驗(yàn)(包括以下實(shí)例2和3)都同步進(jìn)行陽性對照和陰性對照試驗(yàn)，陽性對照試驗(yàn)，用探針BacUin替代其他探針，而陰性對照試驗(yàn)中，用空白替代其他探針。
結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)的金黃色葡萄球菌菌株都與陽性對照探針BacUin和探針SA-16S-1呈雜交陽性(見表2)。上述結(jié)果和預(yù)設(shè)結(jié)果一致，探針SA-16S-1能檢測到自己的目標(biāo)菌株，有較高的敏感度。
表2 PNA探針靈敏度驗(yàn)證
a無菌株描述.
試驗(yàn)例2PNA-FISH特異性驗(yàn)證
選取14株具有代表性的革蘭氏陰性細(xì)菌和陽性細(xì)菌菌株，分別為2株鼠傷寒沙門氏菌；表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、宋氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、糞腸球菌各1株。試驗(yàn)方法如上所述。結(jié)果顯示只有陽性對照探針BacUin與所有細(xì)菌都能結(jié)合，而探針SA-16S-1不能與這些非目標(biāo)菌株結(jié)合(表3)。與預(yù)期結(jié)果一致，SA-16S-1有很好的特異性。
表3 PNA探針特異性驗(yàn)證
a無菌株描述。