本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種改性超支化聚乙烯亞胺、及制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因治療將在人類(lèi)攻克癌癥及遺傳疾病等頑癥的過(guò)程中占據(jù)重要地位，并將逐步成為一種常見(jiàn)的有效手段(參見(jiàn)JeongJH,KimSW,ParkTG.Park.Moleculardesignoffunctionalpolymersforgenetherapy.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274.)?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。成功的基因治療依賴于有效的基因載體，常見(jiàn)的載體分為病毒類(lèi)載體和非病毒載體。病毒類(lèi)載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒類(lèi)載體在臨床應(yīng)用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國(guó)“氣泡嬰兒”事件，在很大程度上都是由病毒類(lèi)基因載體的不安全性造成的。非病毒載體多為高分子陽(yáng)離子聚合物，因其安全、有效、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已成為病毒類(lèi)載體最有希望的替代者(參見(jiàn)GodbeyWT,WuKK,MikosAG.Poly(ethylenimine)anditsroleingenedelivery.J.ControlRelease.1999Aug5；60(2-3):149-160.RemyJS,AbdallahB,ZantaMA,BoussifO,BehrJP,DemeneixB.Genetransferwithliposperminesandpolyethylenimines.Adv.DrugDeliver.Rev1998Mar2；30(1-3):85-95.)。陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)是非病毒類(lèi)載體中受到關(guān)注最多的一個(gè)，它已經(jīng)在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用，聚乙烯亞胺(PEI)由于其具有獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因傳遞而倍受關(guān)注(參見(jiàn)BoussifO,ZantaM.A,BehrJ.P.etal.AVersatileVectorforGeneandOligonucleotideTransferintoCellsinCultureandinVivo–Polyethylenimine.PNAS,1995；92:7297-7301)。PEI的優(yōu)點(diǎn)在于電荷密度集中，對(duì)基因物質(zhì)有強(qiáng)的復(fù)合能力，在低質(zhì)量(m/m)比即能獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。但由于其毒性高、轉(zhuǎn)染效率低、在體內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程的非特異性吸附以及沒(méi)有靶向性的缺點(diǎn)，阻礙了它的進(jìn)一步發(fā)展(參見(jiàn)LungwitzU,BreunigM,BlunkT,GopferichA.Polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems.Eur.J.Pharm.Biopharm2005；60(2):247-266.)。近來(lái)，研究者們圍繞降低毒性和提高轉(zhuǎn)染效率展開(kāi)了一系列對(duì)PEI的改性工作。例如，人們將疏水鏈段膽固醇、聚己內(nèi)酯、聚乳酸等接入PEI上得到兩親性的聚合物(參見(jiàn)LiuZH,ZhangZY,ZhouCG,JiaoYP.Hydrophobicmodificationsofcationicpolymersforgenedelivery.ProgPolymSci2010；35:1144-1162.)。這些改性在一定程度上降低了細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，但這類(lèi)聚合物制備相對(duì)比較麻煩，并且轉(zhuǎn)染效率也沒(méi)有太大提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種具有良好的生物相容性的改性超支化聚乙烯亞胺、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺，由超支化聚乙烯亞胺接枝式(I)所示的化合物得到；其中，所述-R1為-OH或R3-NH-；所述-R3為氨基酸失去端氨基形成的基團(tuán)；所述-R2為甲基或?qū)妆交?yōu)選的，所述超支化聚乙烯亞胺的分子量為1800～25000。優(yōu)選的，所述超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物的摩爾比為1：(5～200)。優(yōu)選的，所述氨基酸為堿性氨基酸。本發(fā)明還提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺的制備方法，包括：當(dāng)-R1為-OH或R3-NH-，且R3不包含氨基時(shí)，將超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物溶解在有機(jī)溶劑中，在縮合劑與活化劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到改性超支化聚乙烯亞胺；或當(dāng)-R1為R3-NH-，且R3包含氨基時(shí)，將式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，得到氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物；將所述氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物與超支化聚乙烯亞胺溶解在有機(jī)溶劑中，在縮合劑與活化劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物脫除氨基保護(hù)基團(tuán)，得到改性超支化聚乙烯亞胺；其中，所述-R1為-OH或R3-NH-；所述-R3為氨基酸失去端氨基形成的基團(tuán)；所述-R2為甲基或?qū)妆交?。本發(fā)明還提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺作為質(zhì)粒DNA載體的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述改性超支化聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為(10～1)：1。本發(fā)明還提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺作為質(zhì)粒siRNA載體的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺在體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺在體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺、其制備方法及應(yīng)用，該改性超支化聚乙烯亞胺由超支化聚乙烯亞胺接枝式(I)所示的化合物得到；其中，所述-R1為-OH或R3-NH-；所述-R3為氨基酸失去端氨基形成的基團(tuán)；所述-R2為甲基或?qū)妆交Ｅc現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將甲磺?；?qū)妆交酋；胫脸Щ垡蚁﹣啺飞?，可在不減少整體電荷量的情況下有效地降低電荷密度，使改性超支化聚乙烯亞胺具有支化結(jié)構(gòu)且電荷密度集中，克服了聚乙烯亞胺均聚物高毒性以及線型聚合物接枝聚乙烯亞胺電荷密度不夠集中的缺點(diǎn)；同時(shí)改性超支化聚乙烯亞胺對(duì)基因物質(zhì)負(fù)載能力強(qiáng)，能夠自由調(diào)節(jié)電荷密度，是具有優(yōu)良生物相容性的高效基因傳遞載體。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的改性超支化聚乙烯亞胺的核磁共振氫譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的改性超支化聚乙烯亞胺細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種改性超支化聚乙烯亞胺，由超支化聚乙烯亞胺接枝式(I)所示的化合物得到；其中，所述-R1為-OH或R3-NH-；所述-R3為氨基酸失去端氨基形成的基團(tuán)；所述-R2為甲基或?qū)妆交?。按照本發(fā)明，所述超支化聚乙烯亞胺的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為1800～25000；所述氨基酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氨基酸即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為堿性氨基酸，更優(yōu)選為精氨酸或賴氨酸；所述超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物的摩爾比優(yōu)選為1：(5～200)，更優(yōu)選為1：(5～180)。本發(fā)明將甲磺?；?qū)妆交酋；胫脸Щ垡蚁﹣啺飞?，可在不減少整體電荷量的情況下有效地降低電荷密度，使改性超支化聚乙烯亞胺具有支化結(jié)構(gòu)且電荷密度集中，克服了聚乙烯亞胺均聚物高毒性以及線型聚合物接枝聚乙烯亞胺電荷密度不夠集中的缺點(diǎn)；同時(shí)改性超支化聚乙烯亞胺對(duì)基因物質(zhì)負(fù)載能力強(qiáng)，能夠自由調(diào)節(jié)電荷密度，是具有優(yōu)良生物相容性的高效基因傳遞載體。本發(fā)明還提供了一種上述改性聚乙烯亞胺的制備方法，包括：當(dāng)-R1為-OH或R3-NH-，且R3不包含氨基時(shí)，將超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物溶解在有機(jī)溶劑中，在縮合劑與活化劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到改性超支化聚乙烯亞胺。其中，所述超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物均同上所述，在此不再贅述。將超支化聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物溶解在有機(jī)溶劑中，其中所述有機(jī)溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的有機(jī)溶劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。然后在縮合劑與活性劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到改性超支化聚乙烯亞胺；其中，所述縮合劑與活性劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的縮合劑與活化劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中所述縮合劑與活性劑優(yōu)選為EDC與NHS組合或DCC與NHS組合；所述縮合劑與活性劑的摩爾量?jī)?yōu)選為式(I)所示的化合物摩爾數(shù)的1～3倍，更優(yōu)選為1.5～2.5倍，再優(yōu)選為1.5～2倍，最優(yōu)選為1.5倍；所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20℃～30℃，更優(yōu)選為25℃；所述反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為15～30h，更優(yōu)選為20～26h，再優(yōu)選為24h。當(dāng)-R1為R3-NH-，且R3包含氨基時(shí)，將式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，得到氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物；將所述氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物與超支化聚乙烯亞胺溶解在有機(jī)溶劑中，在縮合劑與活化劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物脫除氨基保護(hù)基團(tuán)，得到改性超支化聚乙烯亞胺。其中，所述聚乙烯亞胺與式(I)所示的化合物均同上所述，在此不再贅述。將式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，得到氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物；所述氨基保護(hù)基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氨基保護(hù)基團(tuán)即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為叔丁氧羰基保護(hù)基團(tuán)(Boc)或N-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)(Fmoc)。將所述氨基保護(hù)的式(I)所示的化合物與超支化聚乙烯亞胺溶解在有機(jī)溶劑中，在縮合劑與活化劑存在及無(wú)水無(wú)氧的條件下反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；其中，所述有機(jī)溶劑、縮合劑與活化劑及反應(yīng)條件均同上所述，在此不再贅述。將所述中間產(chǎn)物脫除氨基保護(hù)基團(tuán)，得到改性超支化聚乙烯亞胺。所述脫除氨基保護(hù)基的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制。本發(fā)明提供的改性超支化聚乙烯亞胺制備方法簡(jiǎn)單。本發(fā)明還提供了一種上述改性超支化聚乙烯亞胺作為質(zhì)粒DNA載體的應(yīng)用。其中，所述改性超支化聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；其作為質(zhì)粒DNA載體可適用于目前各種細(xì)胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細(xì)胞系；所述作為載體時(shí)轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)細(xì)胞培養(yǎng)；所述細(xì)胞培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選將細(xì)胞置于胎牛血清的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為10％；所述培養(yǎng)條件優(yōu)選為37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2)體外轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％；轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，將改性聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA混合物以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(改性聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA混合物的體積應(yīng)不超過(guò)培養(yǎng)液體積的1/10)至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。3)體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定：a)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)：用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號(hào)。陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，而陰性細(xì)胞則無(wú)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。b)熒光素酶活性檢測(cè)：取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。c)β-半乳糖苷酶染色：細(xì)胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal,5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。陽(yáng)性細(xì)胞呈深藍(lán)色，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。4)細(xì)胞毒性測(cè)試：采用噻唑藍(lán)比色法比較評(píng)價(jià)基因載體材料的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔分別加入20μl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％噻唑藍(lán)的磷酸鹽緩沖液。混合物在37℃繼續(xù)作用4小時(shí)，加入200μl二甲基亞砜溶解噻唑藍(lán)甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標(biāo)儀測(cè)試每孔的吸收，測(cè)試波長(zhǎng)選用492nm。細(xì)胞存活率按下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100Asample是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，Acontrol是不與改性聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA混合物作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。本發(fā)明還提供了一種上述改性超支化聚乙烯亞胺作為質(zhì)粒siRNA載體的應(yīng)用。其中，所述改性超支化聚乙烯亞胺與質(zhì)粒siRNA的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；其作為質(zhì)粒siRNA載體可適用于目前各種細(xì)胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細(xì)胞系；所述作為載體時(shí)轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)用常規(guī)方法合成siRNA：所述的siRNA為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的siRNA即可，并無(wú)特殊的限制，在本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選以沉默熒光素酶的LucsiRNA為例，其序列為5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。2)細(xì)胞的培養(yǎng)：細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。3)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，加入改性聚乙烯亞胺與siRNA混合物以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(改性聚乙烯亞胺與質(zhì)粒siRNA混合物的體積應(yīng)不超過(guò)培養(yǎng)液體積的1/10)至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。4)體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明還提供了一種上述改性聚乙烯亞胺在體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應(yīng)用。其中，所述改性超支化聚乙烯亞胺與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)∶1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；所述體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購(gòu)買(mǎi)重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長(zhǎng)大至10mm時(shí)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒(改性聚乙烯亞胺與轉(zhuǎn)染基因混合物)在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液(復(fù)合物顆粒的體積所占總體積的比例應(yīng)低于10％)中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。4)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明還提供了一種上述改性聚乙烯亞胺在體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應(yīng)用。其中，所述改性超支化聚乙烯亞胺與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)∶1，更優(yōu)選為(5～1)∶1，再優(yōu)選為(3～2)∶1，最優(yōu)選為2.5:1；所述體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購(gòu)買(mǎi)重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長(zhǎng)大至7mm時(shí)進(jìn)行體內(nèi)siRNA的轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因物質(zhì)選用沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的VEGFsiRNA，通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。4)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的測(cè)定從第一次給藥開(kāi)始測(cè)量瘤徑大小，實(shí)驗(yàn)共14天。本發(fā)明提供的改性聚乙烯亞胺是一種新型高效的聚陽(yáng)離子基因載體，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對(duì)HeLa細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為商業(yè)化PEI25K的10～20倍，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在80％以上；其基因沉默效率高，對(duì)恒定表達(dá)熒光素酶的Huh7細(xì)胞的最高基因沉默效率為85％，該聚合物相對(duì)于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細(xì)胞毒性，由此可見(jiàn)本發(fā)明提供的改性聚乙烯亞胺是一種新型高效的聚陽(yáng)離子基因載體，對(duì)于DNA、siRNA都具有高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種改性超支化聚乙烯亞胺、及制備方法及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中所用的試劑均為市售。實(shí)施例1將超支化聚乙烯亞胺、對(duì)甲苯磺?；?Tos)和叔丁氧羰基(Boc)雙保護(hù)的精氨酸((Boc)Arg(Tos)-OH)溶解在DMF中，在縮合劑、活化劑EDC、NHS(縮合劑與活化劑的摩爾數(shù)為(Boc)Arg(Tos)-OH摩爾數(shù)的1.5倍)的存在下，在無(wú)水無(wú)氧條件下25℃反應(yīng)24h得到超支化聚乙烯亞胺接枝的(Boc)Arg(Tos)聚合物(PEI-(Boc)Arg(Tos))。然后用三氟乙酸脫去Boc基團(tuán)得到終產(chǎn)物PEI-Arg(Tos)即改性超支化聚乙烯亞胺。利用核磁共振對(duì)實(shí)施例1中得到的改性超支化聚乙烯亞胺進(jìn)行分析，得到其核磁共振譜圖(氫譜)，如圖1所示。實(shí)施例1中得到的對(duì)甲苯磺?；Ｗo(hù)的精氨酸(Arg(Tos))對(duì)于超支化聚乙烯亞胺(PEI)的接枝率列于表1。表1實(shí)施例1中改性聚乙烯亞胺原料的摩爾比與產(chǎn)物分子量的對(duì)應(yīng)關(guān)系載體材料編號(hào)PEI的分子量PEI與Arg(Tos)的摩爾比P1.8Arg(Tos)-118001:5P1.8Arg(Tos)-218001:10P1.8Arg(Tos)-318001:15P25Arg(Tos)-4250001:60P25Arg(Tos)-5250001:120P25Arg(Tos)-6250001:180實(shí)施例2利用PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)pGL3(熒光素酶質(zhì)粒)、pEGFPN1(綠色熒光蛋白質(zhì)粒)、pCMV-lacZ(β-半乳糖苷酶質(zhì)粒)對(duì)HeLa細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染1)HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，在含有10％小牛血清的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒(PEI-Arg(Tos)與質(zhì)粒的水溶液，按照質(zhì)量比2.5/1直接混合)以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。3)體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。表2給出了熒光素酶質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，其中P1.8代表數(shù)均分子量為1800的超支化聚乙烯亞胺，P25代表數(shù)均分子量為25000的超支化聚乙烯亞胺。綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號(hào)。陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，而陰性細(xì)胞則無(wú)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。表3給出了綠色熒光蛋白質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal，5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。陽(yáng)性細(xì)胞呈深藍(lán)色，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。表4給出了β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。表2PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率表3PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)綠色熒光蛋白質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率表4PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率實(shí)施例3利用PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)沉默熒光素酶的LucsiRNA在HeLa細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染1)HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞，在含有10％小牛血清的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。3)體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。表5給出了熒光素酶沉默效率。表5PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)沉默熒光素酶的LucsiRNA體外轉(zhuǎn)染效率實(shí)施例4PEI-Arg(Tos)在體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購(gòu)買(mǎi)重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長(zhǎng)大至10mm時(shí)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。4)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。表6給出了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)熒光素酶質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。表6PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率實(shí)施例5PEI-Arg(Tos)在體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購(gòu)買(mǎi)重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長(zhǎng)大至7mm時(shí)進(jìn)行體內(nèi)siRNA的轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因物質(zhì)選用沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的VEGFsiRNA，通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。4)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的測(cè)定從第一次給藥開(kāi)始測(cè)量瘤徑大小，實(shí)驗(yàn)共14天。表7給出了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)VEGFsiRNA的復(fù)合物對(duì)腫瘤抑制14天后的瘤徑。表7PEI-Arg(Tos)介導(dǎo)VEGFsiRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的瘤徑大小由實(shí)施例2～實(shí)施例5可知本發(fā)明提供的改性超支化聚乙烯亞胺是一種新型高效的陽(yáng)離子基因載體，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對(duì)HeLa和CHO細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為商業(yè)化PEI25K的15倍和20倍，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在80％以上；其基因沉默效率高，對(duì)恒定表達(dá)熒光素酶的Huh7以及CT26細(xì)胞的最高基因沉默效率均可達(dá)到80％以上，該聚合物相對(duì)于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細(xì)胞毒性，有廣泛的應(yīng)用前景。圖2為本發(fā)明提供的改性超支化聚乙烯亞胺P1.8Arg(Tos)-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在用MTT的方法檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，與市售PEI25K和脂質(zhì)體2000(Lip2K)相比，PEI-Arg(Tos)表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3