本發(fā)明涉及釀酒酵母
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4。
背景技術(shù)：
：木糖是秸稈水解產(chǎn)物中含量最豐富的一種五碳糖，但是卻不能被傳統(tǒng)的釀酒酵母所利用。充分將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇是秸稈資源合理有效利用的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。應(yīng)用基因工程構(gòu)建重組酵母菌株，提高其木糖發(fā)酵能力在理論上完全可行，故近三十年來，國(guó)內(nèi)外已有大量的轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)手段應(yīng)用于改良釀酒酵母的報(bào)道，旨在獲得和提高釀酒酵母發(fā)酵木糖的能力。雖已取得一定的進(jìn)展，但相關(guān)轉(zhuǎn)基因酵母仍然存在以下問題：1、乙醇產(chǎn)率較低；2、乙醇及發(fā)酵抑制物的耐受性不高；3、重組菌株穩(wěn)定性不好；4、高濃度糖的耐受性不高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一、轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4（簡(jiǎn)稱釀酒酵母SF4）釀酒酵母SF4是通過寡肽鏈[-(G4S1)3-]鏈接的2個(gè)木糖利用酶即木糖還原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2構(gòu)成的融合蛋白基因；XYL1的基因序列如SEQIDNO：1，XYL2的基因序列如SEQIDNO：2，融合蛋白的基因序列如SEQIDNO：3；釀酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072），保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2016563。該融合蛋白基因被證實(shí)不僅能夠使天然不能利用木糖的釀酒酵母獲得利用木糖的能力，能以木糖作為唯一碳源轉(zhuǎn)化成為乙醇，還能夠在以單一木糖、木糖+葡萄糖或稻草等秸稈水解液的發(fā)酵中，進(jìn)行高效乙醇發(fā)酵。二、釀酒酵母SF4的獲得方法將木糖代謝途徑中關(guān)鍵酶基因木糖還原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通過寡肽-（G4S1）3-DNA序列連接，然后與木酮糖激酶基因xks1一道構(gòu)建到整合型表達(dá)載體pAUR101上，并轉(zhuǎn)化到高溫釀酒酵母SF7中。對(duì)得到的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定，蛋白表達(dá)含量測(cè)定，酶活測(cè)定，木糖唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)物含量測(cè)定，木糖葡萄糖共發(fā)酵產(chǎn)物含量測(cè)定，芒草秸稈材料稀硫酸預(yù)處理酶解后發(fā)酵產(chǎn)物含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。三、轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4的應(yīng)用秸稈是最豐富的資源之一，我國(guó)每年未被利用的農(nóng)作物秸稈資源達(dá)5億噸之多；農(nóng)作物秸稈的基本成分是半纖維素、纖維素和木質(zhì)素，這三者大約各占30%的比例；傳統(tǒng)的釀酒酵母只能利用其中的纖維素分解產(chǎn)物，這是以秸稈釀造乙醇未能產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸之一。將轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4應(yīng)用于秸稈水解產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵中；除了具備傳統(tǒng)的釀酒酵母生產(chǎn)菌株對(duì)該產(chǎn)物中纖維素分解后的6碳糖高效利用以外，還能夠高效發(fā)酵利用該產(chǎn)物中半纖維素分解后的5碳糖，大大提高對(duì)原料資源的利用率。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：1、RT-PCR結(jié)果表明：融合表達(dá)基因xyl1-（G4S1）3-xyl2的SF4菌株中xyl1基因表達(dá)比對(duì)照明顯增強(qiáng)，SF4菌株xyl2基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，xks1基因表達(dá)中SF4與對(duì)照相比無明顯差異；2、SDS-PAGE結(jié)果表明：xyl1-(G4S1)3-xyl2表達(dá)的融合蛋白有較強(qiáng)表達(dá)；3、酶活測(cè)定結(jié)果表明：XYL1酶活菌株SF4比對(duì)照提高0.3倍，XYL2酶活菌株SF4比對(duì)照提高17.3倍；4、發(fā)酵生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明：重組菌株可以在木糖唯一碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中SF4菌株生長(zhǎng)量比對(duì)照提高1.5倍；5、木糖唯一碳源發(fā)酵時(shí)，SF4利用率可達(dá)95%，但其乙醇產(chǎn)量只有4.6%，為理論產(chǎn)量的10%；葡萄糖和木糖共發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)，SF4菌株木糖利用率達(dá)到53.8%；6、芒草材料水解（稀硫酸+酶解）液的乙醇發(fā)酵中，與對(duì)照菌株相比，菌株SF4五碳糖利用率提高0.8～0.6倍；乙醇產(chǎn)量菌株SF4提高4.5倍左右。附圖說明圖1是pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2和pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2載體鑒定，1：pYPGE15，2：pYPGE15XYL1，3：pYPGE15XYL2，4：pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2，5：ddH2O，6:pYPGE15，7：pYPGE15XYL1，8：pYPGE15XYL2，9：pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2，10：ddH2O，M：2kplus；圖2是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2菌落PCR鑒定；圖3是pAUR101-XYL1、pAUR101-XYL2、pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2載體質(zhì)粒酶切檢測(cè)，1：pAUR101-XYL1，2：pAUR101-XYL1SacI和ApaI雙酶切，3：pAUR101-XYL2，4：pAUR101-XYL2SacI和ApaI雙酶切，5：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，6：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2SacI和SalI雙酶切，7：Trans2KPlusDNAMarker；圖4是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1菌落PCR和雙酶切鑒定，A中，1-3：XKS1a/W3F，4、8：ddH2O；B中，xyl2a/W2F；圖5是SF7酵母轉(zhuǎn)化子鑒定，A中，1-2：SF-CK，3：pAUR101，4：SF7，5：SF1，6：ddH2O；B中，1-2：SF71，3：pA101-XYL1，4-5：SF72，6：pA101-XYL2，7-8：SF73，9：pA101-XKS1，10：SF7，11：ddH2O；圖6是SF7酵母轉(zhuǎn)化子鑒定，A中，1-2：SF4，3：pA-XYL1-(G4S1)3-XYL2XKS1，4：SF7，5：ddH2O；B中，1-4：SF5，5：pA1-XYL2XYL1XKS1，6：SF7，7：ddH2O；圖7是XYL1、XYL2和XKS1基因表達(dá)RT-PCR分析；圖8是XYL1、XYL2和XKS1共表達(dá)鑒定；圖9是XYL1、XYL2和XKS1整合型表達(dá)鑒定；圖10是轉(zhuǎn)基因酵母與對(duì)照菌株在20g/L木糖唯一碳源發(fā)酵37℃時(shí)生長(zhǎng)曲線；圖11是20g/L木糖唯一碳源限氧發(fā)酵木糖含量測(cè)定。釀酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072），保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2016563。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明：一、釀酒酵母SF4的應(yīng)用步驟SF4→甘油管保存菌種→YPD培養(yǎng)基（2%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.03g腺嘌呤、固體添加2%瓊脂）斜面活化→YPD培養(yǎng)基液體三角瓶種子→按照0.1～0.5%量接入秸稈水解液或木糖溶液中→靜止發(fā)酵48～72小時(shí)→發(fā)酵液80～100℃蒸餾→冷卻得到乙醇。二、重組菌株構(gòu)建、驗(yàn)證的方法與技術(shù)路線序列表顯示的是SF4中包含有xyl1-(G4S1)3-xyl2基因的核苷酸序列（序列5）。1、SF4的構(gòu)建及其功能的驗(yàn)證1）pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2載體構(gòu)建由于構(gòu)建此融合蛋白需要在兩個(gè)蛋白質(zhì)中間加入一段（G4S1）1作為連接肽（序列4），因此設(shè)計(jì)了如下引物：FP1-1Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列6）；FP1-1Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTTGTC-3’（序列7）；FP2-1Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’（序列8）；FP2-1Ri：5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列9）；FP1-1上游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物引入KpnI酶切位點(diǎn)；FP2-1上游和下游引物均引入KpnI酶切位點(diǎn)。以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，采用FP1-1引物，用KODPlus高保真酶擴(kuò)增XYL1基因（序列1），Tm=56℃，延伸1.5min，回收此PCR產(chǎn)物，同時(shí)提取載體pYPGE15質(zhì)粒，將擴(kuò)增片段和載體分別用EcoRI和KpnI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶并回收，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，采用P15a和P15s引物檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化子pYPGE15XYL1（FP1-1）。XYL2基因（序列2）克隆以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，采用FP2-1引物，用KODPlus高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Tm=53℃，延伸1.5min，回收此擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)提取pYPGE15XYL1（FP1-1）轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，將基因和該轉(zhuǎn)化子用KpnI單酶切2h，再將單酶切的轉(zhuǎn)化子去磷酸化以防止其自連，瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶并回收，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，采用P15a和P15s引物檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化子pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2(見圖1)。2）pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構(gòu)建此融合蛋白需要在兩個(gè)蛋白質(zhì)中間加入（G4S1）3片段作為連接肽，連接肽引物如下：FP1-3Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列10）FP1-3Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAGAACCACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTGTC-3’（序列11）FP2-3Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGACTGCAACCCATCCTTAG-3’（序列12）FP2-3Ri:5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列13）此載體與pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2的構(gòu)建方法一樣，但基因XYL1和基因XYL2的克隆分別采用FP1-3和FP2-3引物（見圖2）。3）pAUR101-XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構(gòu)建首先采用pYPGE15-132s/XYL2a引物從pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構(gòu)建載體上克隆PGK-XYL1-(G4S1)3-XYL2-CYC1（2757bp）片段（序列5），上游引入SalI，回收KODPlusPCR產(chǎn)物，同時(shí)提取空載體pAUR101質(zhì)粒，將基因片段和載體分別用SacI和SalI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳后用切口刀片切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，再用DNA回收試劑盒回收目的片段，加入DNA連接酶后16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α；采用pA-F和pA-R引物檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化子，如圖2所示，目的片段大小3089bp；同時(shí)，用SacI和ApaI雙酶切分別雙酶切pAUR101-XYL1和pAUR101-XYL2，用SacI和SalI雙酶切pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，如圖3所示，結(jié)果與預(yù)期大小一致。4）pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得提取載體pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2和pAUR101-XKS1質(zhì)粒，同時(shí)用Sse8387I和SphI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳后用切口刀片切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，再用DNA回收試劑盒回收目的片段，加入DNA連接酶后16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α；采用xyl2a/W2F和XKS1a/W3F引物檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化子結(jié)果如圖4A所示，目的片段大小分別為1780bp和2796bp，與預(yù)期的結(jié)果一致。同時(shí)提取pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1質(zhì)粒，采用XKS1a/W3F引物質(zhì)粒PCR，結(jié)果如圖4B所示，目的片段大小1848bp（序列3），與預(yù)期的結(jié)果一致。5、酵母轉(zhuǎn)化及鑒定將構(gòu)建好的整合型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化高溫釀酒酵母SF7，用AbA篩選到陽性轉(zhuǎn)化子后再提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。5.1、中間載體轉(zhuǎn)化子鑒定（載體引物pAF/pAR）采用載體引物pAF/pAR對(duì)空載體菌株SF7-CK基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖5A所示，目的片段大小436bp，與預(yù)期的結(jié)果一致。采用載體引物pAF/pAR分別對(duì)中間載體SF1、SF2、SF3菌株基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖5B所示，目的片段大小分別為1978bp、2084bp、2834bp，與預(yù)期的結(jié)果一致。5.2、終載體轉(zhuǎn)化子鑒定（基因-載體交叉引物）分別采用RHP13F/pAR、W2F/pAR、XKS1a/W4F對(duì)終載體菌株SF4基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖6A所示，目的片段大小分別為1649bp、2418bp、1427bp，結(jié)果與預(yù)期的一致。分別采用XYL1a/W1F、W2F/pAR、XKS1a/W4F，結(jié)果如圖6B所示，目的片段大小分別為849bp、1572bp、1427bp，結(jié)果與預(yù)期的一致。6、RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)采用液氮研磨法破碎酵母細(xì)胞壁后，再利用Tranzol試劑提取酵母總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以酵母內(nèi)源組成型表達(dá)的Actin基因作為內(nèi)參基因，分別對(duì)XYL1、XYL2、XKS1進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果與分析：如圖7所示，SF4菌株中XYL1基因表達(dá)比對(duì)照明顯增強(qiáng)，而SF5則無變化，SF4、SF5號(hào)菌株XYL2基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，XKS1基因表達(dá)中SF4號(hào)比對(duì)照稍弱，SF5號(hào)比對(duì)照稍強(qiáng)，分析可能原因是SF4號(hào)菌株中加入融合蛋白，導(dǎo)致XKS1基因表達(dá)量降低，上述結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果（SDS-PAGE）一致。7、SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白提取酵母總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/mL的蛋白樣品。制備12%分離膠，5%濃縮膠，總蛋白上樣量20μg。結(jié)果與分析：如圖8和圖9所示，與對(duì)照菌株SF7-CK相比，單個(gè)基因及多基因串聯(lián)表達(dá)（XYL1、XYL2、XKS1）的載體菌株的蛋白表達(dá)量均沒有明顯變化，而融合表達(dá)載體菌株XYL1-(G4S1)3-XYL2有較強(qiáng)的蛋白表達(dá)。分析可能原因是整合性表達(dá)拷貝數(shù)太低，導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)的蛋白表達(dá)量較弱。8、XR（木糖還原酶）和XDH（木酮糖氧化酶）酶活測(cè)定8.1、XR酶活測(cè)定XR酶活測(cè)定結(jié)果表明，重組菌株SF4的XR酶活達(dá)到0.0078U/mg，比對(duì)照SF-CK（0.006U/mg）提高了0.3倍。8.2XDH酶活測(cè)定XDH酶活測(cè)定結(jié)果表明，重組菌株SF4的XDH酶活達(dá)到0.11U/mg，比對(duì)照菌株（SF-CK，XDH酶活為0.006U/mg）提高了17.3倍。9、YPX限氧發(fā)酵9.1、生長(zhǎng)曲線以20g/L木糖為唯一碳源限氧發(fā)酵時(shí)，菌株在60h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期(圖10)，120h進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值趨于穩(wěn)定，其中對(duì)照菌株SF-CKOD值為0.96，SF4號(hào)菌株為2.4，比對(duì)照提高1.5倍。9.2、20g/L木糖唯一碳源限氧發(fā)酵過程中木糖含量（圖11）發(fā)酵144h后，對(duì)照菌株木糖殘留濃度為17.4g/L，木糖利用率僅為13%，SF4木糖殘留濃度僅為0.8g/L，木糖利用率為96%，比對(duì)照提高6.4倍。10、YPX-YPDX厭氧發(fā)酵以45g/L木糖為唯一碳源以及45g/L木糖和45g/L葡萄糖共發(fā)酵，在37℃厭氧條件下發(fā)酵5天，蒸餾出乙醇后，采用比色法測(cè)定殘留五碳糖，重鉻酸鉀法測(cè)定乙醇含量。10.1、發(fā)酵后殘留木糖含量1）45g/L木糖唯一碳源厭氧發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK木糖殘留濃度為39.0g/L，SF4號(hào)菌株為2.2g/L，SF4殘留的五碳糖含量與對(duì)照菌株SF-CK相比有顯著性提高。2）45g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK木糖殘留量為36.8g/L，SF4號(hào)菌株為20.8g/L。重組菌株SF4與對(duì)照菌株SF-CK相比均有顯著性的提高。10.2、木糖利用率1）45g/L木糖唯一碳源發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK木糖利用率為13.3%，重組菌株SF4為95.1%，比對(duì)照菌株提高了6.2倍。2）45g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK木糖利用率為18.3%，重組菌株SF4為53.8%，比對(duì)照提高1.9倍。11、乙醇產(chǎn)率11.1、45g/L木糖唯一碳源發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK乙醇產(chǎn)率為1.2%，重組菌株SF4為4.6%，比對(duì)照菌株提高2.8倍。11.245g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對(duì)照菌株SF-CK乙醇產(chǎn)率為15.6%,重組菌株SF4為21.8%，比對(duì)照提高0.4倍。三、轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的發(fā)酵、培養(yǎng)和檢測(cè)1、YPX-YPDX發(fā)酵實(shí)驗(yàn)1）45g/LYPX-YPDX培養(yǎng)基的配制A、45g/LYPX:18mL2%YP（2%Yeastextract，1%Tryptone），加5MHcl調(diào)節(jié)pH至4.8，過濾滅菌的2mL45g/100mLxylose。B、45g/LYPDX:16mL2%YP（2%Yeastextract，1%Tryptone）加5MHCl調(diào)節(jié)pH至4.8，過濾滅菌的2mL45g/100mLxylose和2mL45g/100mLglucose。2）接種于發(fā)酵收集適量YPD培養(yǎng)的酵母，蒸餾水洗滌三次接種至上述培養(yǎng)基中，初始OD600=15（稀釋50倍后為0.3），37℃,100r,發(fā)酵4d。2、芒草秸稈分解（稀硫酸預(yù)處理-酶解）液的乙醇發(fā)酵1）預(yù)處理A、稱取已烘干至恒重的芒草秸稈粉末1.00g于15mL離心管中，平行三份。（本實(shí)驗(yàn)18份）。B、向離心管中加入1%硫酸（v/v）8.0mL，充分搖勻后放入高壓鍋中滅菌，120℃反應(yīng)20min。冷卻后取出，再放入50℃搖床，150r搖2h。C、取出冷卻至室溫，3000g離心5min，取上清100uL于1.5mL離心管（直接稀釋10倍），4℃保存。2）中和-滅菌A、向15mL離心管中加入8%氫氧化鈉（v/v），調(diào)節(jié)pH至4.8，混勻（預(yù)實(shí)驗(yàn)確定NaOH用量，大約1mL）。B、將混合液轉(zhuǎn)入已稱重的50mL三角瓶，用pH4.8的磷酸緩沖液潤(rùn)洗至總重量增加19.0g。C、將三角瓶放入高壓滅菌鍋中，120℃反應(yīng)20min，冷卻后取出。3）酶解A.在超凈工作臺(tái)中向三角瓶中加入1.0mL，40g/L的纖維素復(fù)合酶溶液（終濃度2g/L，滅菌磷酸Buffer配制），放入搖床，150r，50℃酶解48h。B.酶解完成后取出，取上清150uL，3000g離心5min，取上清100uL,（直接稀釋10倍），4℃保存。4）發(fā)酵A、將YPD培養(yǎng)36h的3種酵母菌株分別接種，接種量為OD600=15.0，37℃發(fā)酵4d。B、取發(fā)酵液1mL，3000g離心5min，取上清100uL，稀釋10倍，4℃保存。5）蒸餾發(fā)酵完成后，加入30mL單蒸水，蒸餾，取蒸餾液10mL，比色法測(cè)定乙醇含量。3、發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定發(fā)酵過程中的葡萄糖采用硫酸-蒽酮法測(cè)定，木糖采用苔黑酚法測(cè)定，乙醇采用重鉻酸鉀法測(cè)定。1）葡萄糖含量測(cè)定分別取1.00mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0，4.0，6.0，8.0mL，10.0mL定容至100mL，再分別取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃試管中，加入2.0mL硫酸蒽酮試劑（0.2g蒽酮溶于100mL濃硫酸）快速搖勻，沸水中加熱5min,自來水冷卻至室溫，620nm比色。1mL的蒸餾水作空白樣品。2）木糖含量測(cè)定取1.00mg/mL木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL于100mL容量瓶中，加水定容，再分別取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃試管中，先加入134μLA試劑（A=6g苔黑酚溶于100mL無水乙醇中），再加入2mLB試劑（B=0.1gFeCl3溶于100mL37%濃鹽酸中），混勻后，沸水中加熱20min，自來水冷卻至室溫，660nm比色，1mL的蒸餾水作空白樣品。3）乙醇產(chǎn)率的測(cè)定取1mL乙醇樣品，向其中加入2mL5%K2Cr2O7后混勻，沸水浴10min后自來水冷卻至室溫，再加入7mL單蒸水至總體積為10mL，600nm比色，1mL蒸餾水做空白樣品。定義乙醇的產(chǎn)率為發(fā)酵后產(chǎn)生乙醇的質(zhì)量和發(fā)酵底物中葡萄糖（木糖）的質(zhì)量的比值。四、應(yīng)用1、轉(zhuǎn)基因酵母菌株以芒草材料的發(fā)酵從本實(shí)驗(yàn)大量芒草材料中挑取一對(duì)纖維素和木質(zhì)素含量相近，半纖維素含量差異較大兩種材料，分別命名高材料（H）和低材料（L），用1%稀硫酸預(yù)處理后加入纖維素酶酶解48h,再接種酵母，37℃厭氧發(fā)酵5天，比色法測(cè)定木糖含量，重鉻酸鉀法測(cè)定乙醇濃度。1.1、芒草材料原樣成分本研究根據(jù)芒草材料原樣成分分析結(jié)果，選取了一對(duì)芒草材料，如表1所示，這一對(duì)材料的總纖維素和總木質(zhì)素含量近似相同，但是半纖維素含量差異較大，稀硫酸預(yù)處理酶解后五碳糖（主要是木糖）含量差異也較大。表1芒草材料原樣成分分析品名編號(hào)總半纖維素總纖維素總木質(zhì)素低材料（L）芒602629.1825.20高材料（H）南荻13034.3628.4725.661.2、芒草材料發(fā)酵后殘留五碳糖無論高材料是還是低材料，重組菌株SF4發(fā)酵后五碳糖含量殘留最少，分別只有1.7mg/mL和1.8mg/mL，而對(duì)照菌株則分別為5.4mg/mL和7.1mg/mL。1.3、芒草材料發(fā)酵后的五碳糖利用率重組菌株SF4五碳糖利用率高低材料分別為87%和85%，分別比對(duì)照提高0.8倍和0.6倍。1.4、芒草材料發(fā)酵后的乙醇產(chǎn)率重組菌株SF4最終乙醇產(chǎn)率高低材料分別為8.8%和8.0%，分別比對(duì)照菌株提高4.5倍和0.6倍。1.5、小結(jié)與分析：由以上結(jié)果可知，菌株SF4可以利用預(yù)處理酶解后的芒草材料發(fā)酵生成乙醇，五碳糖利用率最高可達(dá)87%。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉(zhuǎn)基因工程釀酒酵母SF4<140><141><160>13<210>1<211>975<212>DNA-基因xyl1的核苷酸序列<400>Atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaactattaaatcaattgctgataaacatggtaaatccccagctcaagttttattaagatgggctactcaaagaaatattgctgttattccaaaatcaaacaatccagaaagattagctcaaaacttgtctgttgttgactttgacttgactaaggatgatttggacaatattgctaaattggacattggtttgagattcaatgatccatgggactgggacaacattccaatctttgtttaa；<210>2<211>1095<212>DNA-基因xyl2的核苷酸序列<400>Atgactgcaaacccatccttagttcttaacaaagttgacgatatttcctttgaagaatacgaagctccaaaactcgaatcaccaagagatgtcattgttgaagttaagaaaactggtatctgtggatcagatatccattactatgcccatggttcaattggtccatttattttaagaaaaccaatggttttaggtcacgaatcagcaggtgttgtttctgctgtcggaagtgaagttaccaacttgaaggttggtgatagagttgccattgaacctggtgtaccttcaagatttagtgatgagaccaaatctggtcattatcatttgtgcccacatatgtcttttgccgccaccccaccagttaacccagatgaaccaaatcctcaaggtactttatgtaaatactacagagtcccatgtgactttttattcaaattaccagatcatgtttctttggagttgggtgctatggttgaaccattaactgttggtgtccacggttgtaaattggctgatttgaaatttggtgaagacgttgttgtttttggtgccggtccagttggtttgttgaccgctgccgttgctagaacaattggtgctaaaagagtcatggttgttgatatttttgacaacaaattgaagatggcaaaagatatgggtgctgccactcatattttcaactcaaaaaccggtggtgattatcaagatttgatcaagagttttgatggtgttcaaccttcagttgttttggaatgtagtggtgctcaaccatgtatctatatgggtgttaaaatcttgaaagctggtggtagatttgttcaaattggtaatgccggtggtgatgtcaatttcccaattgctgatttctcaaccagagaattggcattatatggttctttcagatatggttacggtgactaccaaacttcaattgatattttagacagaaactacgtcaatggtaaagacaaagcaccaattaatttcgaattgttgattactcacagattcaagtttaaagatgccatcaaagcctatgatttggtcagagcaggaaatggtgctgtcaaatgtttgattgacggtccagaatag；<210>3<211>1803<212>DNA-基因xks1的核苷酸序列<400>atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttcct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