本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分析禾本科植物遺傳多樣性的PCR引物、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

遺傳多樣性是每種生物固有的特性,是長期適應(yīng)和進化的產(chǎn)物。鈍葉草的遺傳多樣性就其本身而言,是非常重要的。當(dāng)某一物種的基因多樣性消失后，就不會再恢復(fù)了，而當(dāng)基因多樣性降低至一定程度后，會發(fā)生近交衰退甚至導(dǎo)致物種滅絕。我國是鈍葉草屬植物的原產(chǎn)地之一，分布范圍也很廣，目前已經(jīng)有學(xué)者研究過鈍葉草，如黃娟、老貓等。但深入到分子層面的研究依然少有見聞。

基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)一SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism)標(biāo)記的發(fā)明和應(yīng)用彌補了以上分子標(biāo)記的不足且具備了它們的優(yōu)點。此技術(shù)是由美國加里弗尼亞大學(xué)，蔬菜系Li和Quiros于2001年在蕓薹屬植物中開發(fā)提出的。SRAP標(biāo)記是根據(jù)基因外顯子中豐富的GC含量和內(nèi)含子、啟動子中豐富的TA含量的特點，利用獨特的引物設(shè)計對ORFs(Open reading frames,開放閱讀框架)進行擴增，因不同個體間的外顯子、內(nèi)含子和啟動子的不同而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記簡單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、多態(tài)性高、在基因組中分布均勻、引物非特異性、少量引物可組配多種引物對等優(yōu)點使其在多種植物中得到廣泛的應(yīng)用。引物大小和引物組合是成功進行SRAP分析的關(guān)鍵。

目前，還未有報道用于鈍葉草種質(zhì)資源研究的SRAP分子標(biāo)記引物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記引物組、方法及試劑盒。本發(fā)明提供的分析禾本科植物遺傳多樣性的分子鑒定方法，可對分析禾本科植物遺傳多樣性進行SRAP分子標(biāo)記鑒定，快速、準(zhǔn)確。

第一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記引物，包括如下a)-v)引物對的至少一對：a).引物對E1M2、b).引物對E1M10、c).引物對E2M2、d).引物對E3M4、e).引物對E4M7、f).引物對E5M3、g).引物對E5M6、h).引物對E6M3、i).引物對E7M3、j).引物對E7M4、k).引物對E8M1、m).引物對E8M4、n).引物對E8M8、o).引物對E9M2、p).引物對E9M3、q).引物對E9M6、r).引物對E10M3、s).引物對E10M4、t).引物對E10M5、u).引物對E10M6、v).引物對E10M9；

其中，M1-M10正向引物的核苷酸序列(3'-5')為：

M1 TGAGTCCAAACCGGATA

M2 TGAGTCCAAACCGGAGC

M3 TGAGTCCAAACCGGAAT

M5 TGAGTCCAAACCGGAAG

M6 TGAGTCCAAACCGGAGC

M7 TGAGTCCAAACCGGTAG

M8 TGAGTCCAAACCGGTAA

M9 TGAGTCCAAACCGGTCC

M10 TGAGTCCAAACCGGTGC；

其中，E 1-E10反向引物的核苷酸序列(3'-5')為：

E1 GACTGCGTACGAATTAAT

E3 GACTGCGTACGAATTGAC

E4 GACTGCGTACGAATTTGA

E5 GACTGCGTACGAATTAAC。

E6 GACTGCGTACGAATTGCA

E7 GACTGCGTACGAATTCGA

E8 GACTGCGTACGAATTCAA

E9 GACTGCGTACGAATTCTG

E10 GACTGCGTACGAATTAGC。

在本發(fā)明一實施例中，禾本科植物為鈍葉草或結(jié)縷草。

在本發(fā)明一實施例中，采用鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記引物所獲得的分析禾本科植物遺傳多樣性信息中，遺傳距離為0.54～0.92。

在本發(fā)明一實施例中，采用鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記引物所獲得的分析禾本科植物遺傳多樣性信息中，遺傳多態(tài)性帶數(shù)總和不低于154個。

在本發(fā)明一實施例中，所述的SRAP分子標(biāo)記引物為E9M3、E1M10兩對引物對；E9M3、E10M3兩對引物對或E9M3、E6M33兩對引物對組成的PCR引物組。

在本發(fā)明一實施例中，所述的SRAP分子標(biāo)記引物為E9M3、E9M2、E1M10組成的PCR引物組。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記方法，為用如第一方面所述引物對待鑒定的禾本科植物的基因組DNA進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測、測序；獲得SRAP條帶；再對所得SRAP條帶進行遺傳多樣性分析，獲得分析禾本科植物遺傳多樣性信息。

在本發(fā)明一實施例中，禾本科植物為鈍葉草或結(jié)縷草。

在本發(fā)明一實施例中，所述PCR體系中，DNA模板用量為50-200ng、Mg²⁺濃度為2.6mmol/L、引物總濃度為10μmol/L(上游、下游引物各0.5μmol/L)、dNTP濃度為0.22mmol/L、Taq酶用量為1U。

優(yōu)選地，多重PCR擴增反應(yīng)條件為：

在本發(fā)明一實施例中，所述對所得SRAP條帶進行遺傳多樣性分析的步驟具體包括：

以1和0記錄等位基因的有和無，獲得矩陣；

用ntsys分析軟件，計算多態(tài)位帶數(shù)、多態(tài)帶數(shù)百分率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)中的一種或多種；

對帶鑒定禾本科植物中的遺傳相似性和遺傳距離進行UPGMA法聚類分析，獲得分析禾本科植物遺傳多樣性信息。

在本發(fā)明一實施例中，所述獲得的分析禾本科植物遺傳多樣性信息中，遺傳距離為0.54～0.92。

在本發(fā)明一實施例中，所述獲得的分析禾本科植物遺傳多樣性信息中，遺傳多態(tài)性帶數(shù)總和不低于154個。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種分析禾本科植物遺傳多樣性的試劑盒，包括如第一方面所述的鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性的SRAP分子標(biāo)記引物，還包括用于PCR的緩沖液、DNA聚合酶。

第四方面，本發(fā)明還提供了一種如第一方面所述的SRAP分子標(biāo)記引物在鑒定分析禾本科植物遺傳多樣性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

通過本發(fā)明提供的技術(shù)方案可得到清晰的用于多樣性分析的譜帶，在本發(fā)明一實施例中，得到了多態(tài)性條帶共154條，多態(tài)性比率為81.48％；這一方面說明了鈍葉草屬植物同種質(zhì)資源間存在著豐富的遺傳變異，檢測方法對于能否檢測到盡可能多的遺傳變異很關(guān)鍵。同時也說明了本發(fā)明提供的技術(shù)方案在鈍葉草等草類植物遺傳多樣性研究中較高的檢出效率。

具體地，在本發(fā)明實施例中，本發(fā)明提供了一組SRAP-PCR標(biāo)記引物組，通過聚類分析把13份不同地方采集的鈍葉草屬種源的DNA劃分為4個類群，可以看出其中科特迪瓦的兩種鈍葉草優(yōu)先聚集并和馬爾代夫、斯里蘭卡、澳大利亞和哥斯達黎加的DNA材料聚為一個類群；甘肅蘭州的金心鈍葉草(2)、海南瓊中鈍葉草和海南耐鹽鈍葉草聚集為一個類群；委內(nèi)瑞拉鈍葉草和海南本地鈍葉草聚為一個類群；甘肅蘭州金心鈍葉草(1)和海南瓊中鈍葉草聚為一個類群。分析結(jié)果表明，同種之間存在遺傳分化。

本發(fā)明實施例通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對鈍葉草屬植物的遺傳多樣性進行研究，結(jié)果顯示2、5、12聚為一類，10和13聚為一類等，表示其親緣關(guān)系較近，SRAP分子標(biāo)記聚類分析給草種確定身份提供了新的信息，這些都體現(xiàn)出SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在鈍葉草屬植物遺傳多樣性研究中的優(yōu)越性和有效性，本發(fā)明的結(jié)論為SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在禾本科植物進一步研究中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的部分基因組DNA質(zhì)量檢測結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實施例提供的稀釋后基因組DNA質(zhì)量的檢測結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實施例提供的部分引物篩選結(jié)果；

圖4為本發(fā)明實施例提供的引物E9/M3擴增圖譜；

圖5為本發(fā)明實施例提供的13分鈍葉草材料的聚類分析圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明采用的Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶和用于凝膠檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker均購自北京天根有限公司。

本發(fā)明實施例以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所收集的13份鈍葉草為試驗材料(見表1)。

表1鈍葉草實驗材料

一、基因組DNA的提取

采用改良CTAB法，步驟如下：

(1)取新鮮幼嫩葉片，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加入1mL預(yù)冷的CTAB-free緩沖液，冰浴10min。7 000r/min離心5min，棄上清；

(2)加入1mL65℃預(yù)熱的3×CTAB提取緩沖液，混勻，65℃水浴30min，其間不斷輕輕混勻，4℃，1 000r/min離心5min；

(3)取上清，加入酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，輕輕顛倒混勻，4℃，12 000r/min離心10min；

(4)取上清，加入氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕顛倒混勻，4℃，12 000r/min離心10min；

(5)取上清，加入等體積異丙醇，輕輕混勻，置于-20℃沉淀30min；

(6)棄上清，4℃，7 000r/min離心5min；

(7)70％乙醇洗滌2次；

(8)風(fēng)干后加入100μL TE溶解沉淀，加入1μL 10mg/mL RNase A酶，37℃水浴30min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、基因組DNA質(zhì)量檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測

制備1.0％(每10毫升0.5×TBE加入0.1克的瓊脂糖)的瓊脂糖凝膠，分別取5μL DNA和1μL上樣緩沖液混合，用0.5×TBE緩沖液于140V電泳30min，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測，拍照。

核酸蛋白分析儀檢測

取1μL DNA原液，核酸蛋白分析儀測A260/A280及DNA濃度。

DNA的工作濃度：100ng/μl(用時用母液稀釋成工作液)。

SRAP分析

1、引物篩選

SRAP引物設(shè)計參考Li與Quiros的方法，合成10條正向引物和9條反向引物(見表2),共組合成90對引物，以3個鈍葉草(耐鹽鈍葉草、澳大利亞鈍葉草、科特迪瓦鈍葉草)的DNA作為模板進行引物篩選，每對引物重復(fù)擴增1次。篩選出了3個DNA模板間有差異條帶、擴增穩(wěn)定、帶型清晰的引物，再用這3個DNA模板對上述篩選出的引物進行進一步篩選，每對引物擴增1次，篩選出具有多態(tài)性的引物。

表2引物及其序列(以及在序列表中的編號)

2、SRAP反應(yīng)體系

鈍葉草屬種源DNA模板SRAP-PCR總體積10μl(見表3)。

表3 SRAP反應(yīng)體系

3、SRAP的擴增程序

94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸30s，共5個循環(huán)；然后，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸7min；4℃停止反應(yīng)。

4、SRAP擴增產(chǎn)物的檢測

擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為：上樣5μLPCR反應(yīng)液，0.5×TBE緩沖液，1.5％(每10毫升0.5×TBE加入0.15克的瓊脂糖)的瓊脂糖凝膠(其中含有Gold View核酸染料)，140V的電泳電壓電泳約40分鐘。電泳完畢后在凝膠成像系統(tǒng)上觀測、照相。

5、數(shù)據(jù)處理

每個SRAP條帶，以1和0記錄等位基因的有和無，獲得矩陣，用ntsys分析軟件，計算多態(tài)位帶數(shù)、多態(tài)帶數(shù)百分率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)，并對各種的遺傳相似性和遺傳距離進行UPGMA法聚類分析。

三、結(jié)果與分析

基因組DNA質(zhì)量的檢測

基因組DNA電泳檢測結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，基因組DNA條帶明亮，譜帶整齊，無其他雜帶，說明提取的DNA量較多，DNA完整無降解。取1μL DNA原液，核酸蛋白分析儀測A260/A280及DNA濃度。J結(jié)果顯示，A260/A280值在1.8～2.0之間,表示DNA的濃度高且無雜質(zhì)。

然后加適量蒸餾水，將其稀釋至100ng/μl，再次檢測結(jié)果(如圖2，圖2為稀釋后基因組DNA質(zhì)量的檢測結(jié)果)所示(λDNA為100ng/μl)，13份材料的基因組總DNA譜帶整齊均一，亮度一致，符合試驗要求，最后置于冰箱-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

引物的篩選

以3個鈍葉草的DNA作為模板對100對引物進行篩選，結(jié)果顯示(圖3，圖3為部分引物篩選結(jié)果)，有21對引物都擴增出清晰的條帶，占引物組合的21％，擴增產(chǎn)物大小為50～1500bp不等，另外的79對引物部分也有擴增出任何產(chǎn)物，但是產(chǎn)物不清晰或部分模板沒有產(chǎn)物。

表4 21對SRAP引物組合篩選情況

注：√為有差異條帶、帶型清晰的引物組合。

多態(tài)性分析

13對SRAP引物擴增得到154個片段，由此看出，SRAP標(biāo)記揭示鈍葉草屬的多樣性效率是比較高的。引物的E9/M3擴增圖譜見圖4，圖4為引物E9/M3擴增圖譜。

從多態(tài)性帶數(shù)、多態(tài)性帶百分比(表5)來看，鈍葉草草種內(nèi)遺傳變異比較小。多態(tài)性帶百分比對遺傳多樣性只是一個粗略的估計，并不能代表在各條帶在頻率上的均勻度。

表5多態(tài)性條帶統(tǒng)計

聚類分析

根據(jù)SRAP引物擴增得到的154條多態(tài)性條帶，對13種鈍葉草DNA模板進行遺傳多樣性分析。對鈍葉草屬植物的種內(nèi)遺傳相似性、遺傳距離分析及聚類后發(fā)現(xiàn)，鈍葉草屬不同種源的遺傳差異較大；如馬爾代夫鈍葉草與耐鹽鈍葉草。結(jié)果表明，13個DNA模板的相似系數(shù)變幅在0.54到0.92之間。在相似系數(shù)為0.69時，可將13份DNA模板分為4個類群(圖5)，把DNA按表格(1)序列分別編為1～13號，可以看出其中科特迪瓦的兩種鈍葉草優(yōu)先聚集并和馬爾代夫、斯里蘭卡、澳大利亞和哥斯達黎加的DNA材料聚為一個類群；甘肅蘭州的金心鈍葉草(2)、海南瓊中鈍葉草和海南耐鹽鈍葉草聚集為一個類群；委內(nèi)瑞拉鈍葉草和海南本地鈍葉草聚為一個類群；甘肅蘭州金心鈍葉草(1)和海南瓊中鈍葉草聚為一個類群。見圖(5)上述結(jié)果表明，同種之間存在遺傳分化；生態(tài)地理條件對其遺傳分化無較大影響。圖5中，虛線處為0.69，品種編號見表1。

本發(fā)明實施例表明，鈍葉草屬植物在形態(tài)上存在著豐富的遺傳變異，研究通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對13種鈍葉草的DNA進行分析，結(jié)果21對引物擴增出154條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率(PPB)為81.48％，遺傳相似性變異范圍較大，為0.54～0.92，這些結(jié)果從分子標(biāo)記的角度說明了鈍葉草屬植物種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異。

鈍葉草屬植物豐富的遺傳變異為植物的優(yōu)良品系的選育、開發(fā)和利用提供了空間，避免了因遺傳基礎(chǔ)狹窄而導(dǎo)致的給育種工作限制。因此，本發(fā)明提供的引物以及SRAP標(biāo)記方法選育優(yōu)良的鈍葉草屬植物新品種，在資源研究的開發(fā)利用上有著重大意義。

此外，采用單一SRAP引物對檢測鈍葉草屬植物的遺傳變異，由于鑒定引物不同，DNA樣品不同，每次實驗都需要配置不同的體系進行PCR，在配置PCR體系過程中非常麻煩，很容易加錯樣品。

為降低工作量，減少人為失誤，本發(fā)明人還對各引物的多重PCR體系進行了摸索。包括如下步驟：

采用表5所示出篩選出的引物對，對a-v對引物對進行組合。具體地，發(fā)明人先任選對2對引物組進行多重PCR，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，選擇和單獨采用每對引物進行擴增時相比，多重PCR擴增結(jié)果所得條帶總數(shù)不低于單獨擴增所得條帶總數(shù)的90％，多態(tài)性不低于80％的引物組進入下一輪篩選；每輪都多加一對，依次類推。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對采用2對引物進行多重PCR時，成功獲得3組PCR引物組(分別為表6中的E9M3、E1M10；E9M3、E10M3和E9M3、E6M33個組合；大部分引物組由于非特異性擴增導(dǎo)致多重PCR時，相比單獨每對引物擴增的條帶之和低于95％，多態(tài)性之和低于90％)。其中，采用3對引物進行多重PCR時，有1個組合的擴增結(jié)果較佳(相比單獨每對引物擴增的條帶之和不低于95％，多態(tài)性之和不低于90％))；引物組合篩選情況如下表6所示；多態(tài)性結(jié)果如表7所示。

表6多重PCR(三對引物)引物組合篩選情況

注：√為有差異條帶、帶型清晰的引物組合。

表7多態(tài)性條帶統(tǒng)計分析

由表6及表7可知，本發(fā)明提供的多重PCR組合E1M10、E9M2、E9M3引物組，可用于鈍葉草屬植物遺傳變異的多重PCR鑒定，采用本發(fā)明提供的PCR引物組(E1M10、E9M2、E9M3)可一次性鑒定出表1所示13個待測鈍葉草14條多態(tài)性條帶，擴增總數(shù)可達18條。

本發(fā)明采用的優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系(20μL)：DNA模板用量為100ng、Mg²⁺濃度為2.5mmol/L、引物總濃度為0.6μmol/L(每條引物等量添加)、dNTP濃度為0.25mmol/L、Taq酶用量為1U。

反應(yīng)程序為：

綜上可知，本發(fā)明可采用多對SRAP引物對鑒定鈍葉草屬植物，并提供了優(yōu)化的多重PCR擴增體系，不僅提高了檢測準(zhǔn)確度，而且降低了工作量，減少人為加樣過程中引入的失誤。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟76悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所

<120> 分析禾本科植物遺傳多樣性的PCR引物、方法及試劑盒

<130> 2016

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagtccaaa ccggata 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgagtccaaa ccggagc 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgagtccaaa ccggaat 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagtccaaa ccggaag 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgagtccaaa ccggagc 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgagtccaaa ccggtag 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgagtccaaa ccggtaa 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgagtccaaa ccggtcc 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgagtccaaa ccggtgc 17

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgagtccaaa ccggt 15

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gactgcgtac gaattaat 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactgcgtac gaattgac 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gactgcgtac gaatttga 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gactgcgtac gaattaac 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gactgcgtac gaattgca 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gactgcgtac gaattcga 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gactgcgtac gaattcaa 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gactgcgtac gaattctg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactgcgtac gaattagc 18