本發(fā)明涉及一株新篩選的脫硫脫氮副球菌，該脫氮副球菌能夠?qū)⒘蚧镏械牧螂x子轉(zhuǎn)化為更高價(jià)態(tài)的單質(zhì)硫以及硫酸鹽等，從而實(shí)現(xiàn)硫化物的去除。本發(fā)明的脫氮副球菌適合用于含無(wú)機(jī)硫化物的廢水、天然氣及沼氣脫硫。本發(fā)明屬于生物與環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人們?cè)谔幚砩钗鬯?、利用生物燃?xì)庖约斑M(jìn)行石化生產(chǎn)的時(shí)候，硫化氫氣體的釋放是伴生的主要問(wèn)題。由于硫化物的腐蝕性、有毒性、惡臭以及高耗氧量等諸多問(wèn)題，國(guó)家環(huán)保部規(guī)定廢氣中硫化物須達(dá)到符合商業(yè)銷(xiāo)售和安全輸送及使用規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)方可排放。因此，在工程實(shí)施的過(guò)程中，必須采取安全有效的措施控制硫化物向周邊環(huán)境中的釋放。

傳統(tǒng)的脫硫工藝常使用化學(xué)法來(lái)脫除硫化物，但由于需要不斷地消耗脫硫劑，運(yùn)行成本較高。而生物脫硫技術(shù)主要依靠能夠自我繁殖的微生物來(lái)催化脫硫，脫硫劑可以自我再生，運(yùn)行成本較低，具有廣闊的應(yīng)用前景。

生物脫硫的核心是脫硫微生物。目前文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)菌株都適用于專(zhuān)一性的脫除有機(jī)硫，但單一性的脫除硫化物(H₂S)的菌株雖有報(bào)道，但大多存在一些問(wèn)題。如一株那不勒斯硫桿菌及其在生物脫硫中的應(yīng)用(申請(qǐng)?zhí)枺?01410179292.X)，該菌在一定條件下，對(duì)還原態(tài)的硫化物、單質(zhì)硫及硫代硫酸鹽有較強(qiáng)的氧化能力，但該菌處理硫代硫酸鹽廢水的時(shí)候需要24h才能可實(shí)現(xiàn)99％的去除，相比本發(fā)明涉及的一株脫硫紅細(xì)菌要略顯不足。如一株耐堿性排硫硫桿菌及其在生物脫硫中的應(yīng)用(申請(qǐng)?zhí)枺?01110149623.1)，該菌在一定條件下，具有很強(qiáng)的脫除硫化氫的能力，但其不足之處在于該菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型為嚴(yán)格自養(yǎng)型，在工程實(shí)際應(yīng)用的時(shí)候不易快速獲得高密度菌體，且該菌的生長(zhǎng)速度也較慢，需培養(yǎng)48h。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有脫硫微生物存在的生長(zhǎng)慢、不易獲得高密度菌體、脫硫速率慢的問(wèn)題及不足，提供一株高效脫硫菌株及其在生物脫硫中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一株硫氧化細(xì)菌—脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DS-2，于2016年07月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)，保藏編號(hào)為：CGMCC No.12633。

本發(fā)明提供的脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DS-2CGMCC No.12633從成都市第二污水處理廠的好氧曝氣池污泥中篩選得到，篩選方法為：采用硫代硫酸鈉培養(yǎng)基富集馴化7天，重復(fù)3～4次，采用硫化鈉培養(yǎng)基進(jìn)行平板分離，3～4天后菌落生成，挑取單菌落接入硫化鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)4次以上獲得純菌，該菌命名為DS-2。其生理特點(diǎn)為：細(xì)胞形態(tài)為球狀，長(zhǎng)0.2～0.8μm、寬0.2～0.4μm、革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，菌落顏色為乳白色；該菌生長(zhǎng)pH為5.5～9.0，其最適pH為7.0，生長(zhǎng)溫度為20～35℃，最適溫度為30℃。該菌營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型為兼性營(yíng)養(yǎng)型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)快速生長(zhǎng)，也能利用二氧化碳為唯一碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)；在以二氧化碳為唯一碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，該菌能夠利用氧氣將硫化物氧化為單質(zhì)硫或硫酸鹽。

2HS-+O2→2S+2OH-

HS-+2O2→SO42-+H+

本發(fā)明的另一目的提供了脫氮副球菌菌株DS-2在生物脫硫中的應(yīng)用。脫硫效果驗(yàn)證顯示，該菌株在自養(yǎng)條件下6h內(nèi)實(shí)現(xiàn)了99.62％的硫化物去除，66.7％的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明還提供了在菌株篩選和培養(yǎng)過(guò)程中使用到的培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基配方為在馴化富集過(guò)程中優(yōu)化得到，配方為：(1)硫化鈉培養(yǎng)基，用于菌株篩選和脫硫效果實(shí)驗(yàn)，其配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。(2)硫代硫酸鈉培養(yǎng)基，用于菌種富集，培養(yǎng)基配方為：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。(3)有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基，用于擴(kuò)大培養(yǎng)和驗(yàn)證該菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化鈉5.0g/L，pH 7.0～7.2。

本發(fā)明提供了上述菌株的16SrDNA鑒定結(jié)果。經(jīng)過(guò)16SrDNA鑒定及BLAST比對(duì)，DS-2與脫氮副球菌的同源性達(dá)到了99％，因此鑒定該菌株為脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)。本發(fā)明提供的脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DS-2的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示：

CGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTTGGTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATGCGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCAAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGAT GAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTCAAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGGCCCGGAGACGGGTCTTTCACTTCGGTGACCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACACTCTTAGTTGCCAGCATTTGGTTGGGCACTCTAAGAGAACTGCCGATGATAAGTCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCAGCAAT

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明涉及的脫氮副球菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型為兼性營(yíng)養(yǎng)型，在異養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)菌體的快速繁殖，在自養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)高效脫硫。利用有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)獲得高密度菌體，用于實(shí)現(xiàn)生物脫硫工程的快速啟動(dòng)。

(2)本發(fā)明涉及的脫氮副球菌的脫硫速率較快，自養(yǎng)條件下6h去除率可達(dá)到99.62％，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率為66.7％；

(3)本發(fā)明涉及的脫氮副球菌能夠耐受較高濃度的硫化物，自養(yǎng)條件下耐受的硫(S^2-)濃度高達(dá)1000mg/L；

(4)符合生物安全法規(guī)，該微生物菌株從被高硫化物長(zhǎng)期脅迫的選擇環(huán)境中篩選得到，不會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境和生態(tài)平衡造成危害。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的脫氮副球菌在掃描電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。

圖2為本發(fā)明的脫氮副球菌DS-2在自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線，其中：(a)自養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線，(b)異養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。

圖3為本發(fā)明的脫氮副球菌DS-2在脫硫效果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各因素的變化情況，其中：(a)硫化物去除率的變化，(b)單質(zhì)硫濃度的變化。

圖4為本發(fā)明的脫氮副球菌DS-2脫硫形成的單質(zhì)硫在掃描電鏡(SEM)下的形態(tài)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施方案方便于更好的理解本發(fā)明，但并非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基配方為：

(1)硫化鈉培養(yǎng)基，配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

(2)硫代硫酸鈉培養(yǎng)基，配方為：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

(3)有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化鈉5.0g/L，pH 7.0～7.2。

實(shí)施例1：菌株篩選

取成都市第二污水處理廠好氧曝氣池污泥適量，按20％的接種量加入含5L硫代硫酸鈉培養(yǎng)基的反應(yīng)器中，在pH＝7.0，0.5L/min，30℃的條件下富集培養(yǎng)7天，采用硫化鈉培養(yǎng)基進(jìn)行平板分離，3～4天后菌落生成，挑取單菌落接入平板中培養(yǎng)，重復(fù)劃線分離4次以上獲得純菌。

實(shí)施例2：菌株鑒定

將菌株按照相同的接種量接種于硫代硫酸鈉培養(yǎng)基中，置于不同溫度的搖床中(20℃、25℃、30℃、40℃)培養(yǎng)30h，確定該菌株生長(zhǎng)溫度為20℃～35℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃左右；采取初始pH別為5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0在最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)30h，確定該菌生長(zhǎng)pH為5.5～9.0，最適生長(zhǎng)pH為7.0。

將分離純化的菌株在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察，結(jié)果如圖1所示；該菌為球狀、長(zhǎng)0.2～0.8μm、寬0.2～0.4μm，無(wú)鞭毛；革蘭氏染色鑒定該菌為陽(yáng)性。

采用細(xì)菌全基因組快速抽提試劑盒，提取純菌株的全基因組，通過(guò)選用細(xì)菌16SrDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST比對(duì)，鑒定該菌株為脫氮副球菌，命名為Paracoccus denitrificans DS-2，即為本發(fā)明的保藏菌株脫氮副球菌CGMCC No.12633(Paracoccus denitrificans，)DS-2。

對(duì)脫氮副球菌DS-2進(jìn)行生長(zhǎng)曲線研究，分別選用硫代硫酸鈉培養(yǎng)基進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)和有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，結(jié)果如附圖2(a)、(b)所示：(a)脫氮副球菌DS-2可以在硫代硫酸鈉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)30h后菌液OD值達(dá)到0.22；(b)脫氮副球菌DS-2在能夠在有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)30h后，菌液OD值達(dá)到1.089，遠(yuǎn)高于在無(wú)機(jī)環(huán)境中培養(yǎng)的結(jié)果。這說(shuō)明該菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型為兼性營(yíng)養(yǎng)型；在工程應(yīng)用中可以使用有機(jī)碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基快速獲得高密度菌體。

實(shí)施例3：脫硫瓶試

將200ml硫化鈉培養(yǎng)基溶液(800mg/L S^2-)在紫外下滅菌30分鐘，無(wú)菌條件下裝入已滅菌的500ml三角瓶中，然后加入50ml培養(yǎng)30h的脫氮副球菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于搖床中振蕩(30℃、200r/min)，測(cè)定初始硫化物濃度為582mg/L S^2-；所述硫化鈉培養(yǎng)基配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每隔30分鐘取樣測(cè)定硫化物濃度、單質(zhì)硫濃度，結(jié)果取平均值。在6小時(shí)后，其測(cè)定計(jì)算結(jié)果如附圖3所示：實(shí)驗(yàn)組硫化鈉溶液中添加該脫硫菌后，其硫化物濃度比對(duì)照明顯降低，單質(zhì)硫產(chǎn)率明顯要高，其中硫化物去除率達(dá)到99.62％，單質(zhì)硫累積產(chǎn)量最高時(shí)能夠達(dá)到388.35mg/L，相應(yīng)的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率為66.7％。而對(duì)照組中硫化物的去除是由于搖瓶振蕩促進(jìn)了硫化物的逸出，但從單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率可以看出，硫化物的去除只是單純的物理性移除，并不是生物轉(zhuǎn)化去除。

實(shí)施例4：脫硫罐試

將5L硫化鈉培養(yǎng)基溶液(初始濃度為1000mg/L S^2-)裝入已滅菌的8L的反應(yīng)器中(反應(yīng)器中添加有軟性填料，用以微生物掛膜)，然后加入500ml培養(yǎng)30h的脫氮副球菌菌液，用空氣泵曝氣，曝氣速率為0.4L/min，保持環(huán)境溫度為28℃～30℃，在此條件下掛膜馴化7天，使微生物能夠在填料上附著，然后進(jìn)行去除硫化物的驗(yàn)證試驗(yàn)；在實(shí)現(xiàn)菌體在反應(yīng)器中掛膜成功后，往反應(yīng)器中添加1000ml通過(guò)紫外滅菌的硫化鈉培養(yǎng)基溶液；所述硫化鈉培養(yǎng)基配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每隔30分鐘取樣測(cè)定硫化物濃度、單質(zhì)硫濃度，取其平均值。在4h后，其測(cè)定計(jì)算結(jié)果如下表1所示。

表1脫氮副球菌脫硫效果

在實(shí)驗(yàn)組實(shí)現(xiàn)掛膜后的反應(yīng)器中，加入硫化鈉溶液4h后，硫化物濃度比對(duì)照組去除率明顯要高，單質(zhì)硫產(chǎn)率明顯要高，其中硫化物去除率可達(dá)到99.45％，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率達(dá)到59.39％。與實(shí)例3相比，成功掛膜的反應(yīng)器中，該菌株對(duì)硫化物的去除速率更快，效率更高，可實(shí)施用于脫硫應(yīng)用。對(duì)照組中硫化物的去除是由于空氣吹脫導(dǎo)致硫化物的逸出，但從單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率可以看出，硫化物的去除只是單純的物理性移除，并不是生物轉(zhuǎn)化去除。

實(shí)施例5：生物硫顆粒觀察

對(duì)脫氮副球菌DS-2處理后廢水中的單質(zhì)硫聚合形成的生物硫顆粒進(jìn)行了掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果如附圖4所示：廢水中的生物硫顆粒形態(tài)大小不一，呈不規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)，顆粒表面有光滑。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所

<120>一株脫硫脫氮副球菌及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>1290

<212>DNA

<213>脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）

<400>1

cggcggacgg gtgagtaacg cgtgggaata tgccctttgg tacggaatag tcctgggaaa 60

ctgggggtaa taccgtatgc gcccttcggg ggaaagattt atcgccaaag gattagcccg 120

cgttggatta ggtagttggt ggggtaatgg cctaccaagc cgacgatcca tagctggttt 180

gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 240

gtggggaatc ttagacaatg ggggcaaccc tgatctagcc atgccgcgtg agtgatgaag 300

gccctagggt tgtaaagctc tttcagctgg gaagataatg acggtaccag cagaagaagc 360

cccggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gggctagcgt tgttcggaat 420

tactgggcgt aaagcgcacg taggcggacc ggaaagttgg gggtgaaatc ccggggctca 480

accccggaac tgccttcaaa actatcggtc tggagttcga gagaggtgag tggaattccg 540

agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cggctcactg 600

gctcgatact gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 660

agtccacgcc gtaaacgatg aatgccagtc gtcgggcagc atgctgttcg gtgacacacc 720

taacggatta agcattccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg 780

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt 840

accaaccctt gacatcccag gaccggcccg gagacgggtc tttcacttcg gtgacctgga 900

gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttcggtta agtccggcaa 960

cgagcgcaac ccacactctt agttgccagc atttggttgg gcactctaag agaactgccg 1020

atgataagtc ggaggaaggt gtggatgacg tcaagtcctc atggccctta cgggttgggc 1080

tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg ggttaatccc caaaagccat ctcagttcgg 1140

attggggtct gcaactcgac cccatgaagt tggaatcgct agtaatcgcg gaacagcatg 1200

ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttgggt 1260

ctacccgacg gccgtgcgct aaccagcaat 1290