本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品檢測領(lǐng)域，具體地說是涉及一種可以同時富集腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌的共增菌培養(yǎng)基SES。

背景技術(shù)：

沙門氏菌(Salmonella，SM)、大腸桿菌(Escherichia coli，EC)和志賀氏菌菌(Shigella，SH)是常見的食源性致病菌。國內(nèi)外曾多次暴發(fā)由這些致病菌引起的食物中毒事件，例如2006年美國26個州因食用被大腸桿菌O157:H7污染的菠菜暴發(fā)食源性疾病疫情導(dǎo)致199人患病3人死亡；2007年歐洲及澳大利亞因食用被志賀氏菌污染的胡蘿卜而導(dǎo)致230人患?。?012年美國多個州又因食用被沙門氏菌污染的哈密瓜而導(dǎo)致261人患病3人死亡。這三種致病菌廣泛分布于自然界，污染食品的風(fēng)險(xiǎn)具有不確定性和難控制性，因此相應(yīng)快速檢測技術(shù)的開發(fā)，對于及時有效控制疾病傳播，預(yù)防食物中毒具有重要作用。

檢測食源性致病菌，首先要選用合適的增菌液對樣品進(jìn)行16-24h的增菌培養(yǎng)，該過程不僅可以選擇性地富集待檢致病菌抑制背景微生物的生長，還可以使受損的細(xì)胞復(fù)蘇，進(jìn)而使樣品中的病原菌濃度達(dá)到檢測限，從而提高檢出率，避免漏檢和錯檢。因此，增菌培養(yǎng)是微生物檢測中必不可少的一步，現(xiàn)有的各種微生物快速檢測新技術(shù)，例如各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、基因芯片、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等方法因自身檢測能力的限制(檢測限10²～10⁴)及背景微生物的干擾都不能繞過增菌這一富集過程。并且，針對不同的待檢致病菌，樣品所用的增菌液和選擇性培養(yǎng)基也不同，這種只針對某一特定菌種富集的增菌液很大程度上限制了高通量檢測技術(shù)(例如多重PCR和基因芯片檢測技術(shù))的應(yīng)用，導(dǎo)致了高通量檢測方法難以用于實(shí)際樣品的檢測。因此，開發(fā)能選擇性富集多種目標(biāo)致病菌的共增菌培養(yǎng)基，是實(shí)現(xiàn)快速高效的共檢技術(shù)的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種共增菌培養(yǎng)基SES，其特征在于其由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、抑制劑和水組成，各組分的配比和組成如下：

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨15～25份，葡萄糖0.5～2份，NaCl 4～6份，磷酸氫二鉀3～5份，磷酸二氫鉀1～3份；

(2)抑制劑：3號膽鹽0.6～1.2份，新生霉素鈉鹽5～25份，氯化鋰0.5～2份，亞碲酸鉀0.1～0.6份；

(3)水，1000份。

優(yōu)選的一種共增菌培養(yǎng)基SES，其特征在于其由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、抑制劑和水組成，各組分的配比和組成如下：

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨20份，葡萄糖1份，NaCl 5份，磷酸氫二鉀4份，磷酸二氫鉀1.5份；

(2)抑制劑：3號膽鹽1.2份，新生霉素鈉鹽20份，氯化鋰0.5份，亞碲酸鉀0.1份；

(3)水，1000份。

其中上述所述的份數(shù)均為重量份數(shù)。

本發(fā)明的上述共增菌培養(yǎng)基SES是通過如下方法制備的：

分別稱取胰蛋白胨，葡萄糖，NaCl，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，3號膽鹽，氯化鋰，加水?dāng)嚢杈鶆颍?/p>

121℃高壓滅菌，冷卻至室溫；

在上述混合液中，無菌添加新生霉素鈉鹽，亞碲酸鉀，混勻，即制成所需的共增菌培養(yǎng)基(SES)，該培養(yǎng)基可立即使用或2～8℃保存。

制備好的共增菌培養(yǎng)基，可將檢測樣品按照1：100左右的重量或體積比例接入SES培養(yǎng)基中，36℃過夜培養(yǎng)16～24h(視樣品污染程度或菌液混濁程度)，即可用于后續(xù)進(jìn)一步檢測。

本發(fā)明以腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌3種菌為目標(biāo)菌，研制出可以同時富集這3種菌的選擇性培養(yǎng)基，填補(bǔ)了目前共增菌選擇性培養(yǎng)基在此方面的空白，構(gòu)建了樣品處理與后續(xù)多菌種同時檢測之間的橋梁。

與特異性的選擇性增菌液相比，本發(fā)明的共增菌培養(yǎng)基可同時富集腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌3種菌，有望于高通量檢測技術(shù)聯(lián)用，達(dá)到同時檢測多種致病菌的目的；與廣譜性增菌液相比，本發(fā)明的選擇性增菌液在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了抑菌劑，更好地抑制了非目的菌的生長(單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌、楊酸桿菌等經(jīng)測試均不生長)，避免了雜菌的干擾；同時，該培養(yǎng)基對冷損傷的菌株有一定的修復(fù)能力，可以避免亞致死狀態(tài)下目標(biāo)菌的漏檢。

總的來說，本發(fā)明共增菌培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是：

1、可以進(jìn)行多種致病菌的共培養(yǎng)。

2、理論上不受檢測靈敏度限制。

3、節(jié)省待檢樣本數(shù)量，并省時省力。

4、檢測樣本廣泛。

附圖說明

圖1為SES與商業(yè)化增菌液分別對3種目標(biāo)菌的增菌效果比較。

其中3種商業(yè)化增菌液分別為：沙門氏菌RV(1-A)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、大腸桿菌O157:H7mEC+n(1-B)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)和志賀氏菌GN(1-C)(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。

圖2為3種目標(biāo)菌按不同比例接入SES后，SES對3種菌的富集效果。腸炎沙門氏菌(簡稱SM)、大腸桿菌O157:H7(簡稱EC)和福氏志賀氏菌(簡稱SH)的復(fù)合接菌比例分別為：1:1:1(2-A)、1:10:100(2-B)、10:100:1(2-C)和100:1:10(2-D)。

圖3 SES對冷凍豬肉中的目標(biāo)菌修復(fù)能力測定。

圖4多重PCR檢測樣品中的腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌。泳道M：DNA Ladder；泳道1：待檢樣品；泳道2：空白對照。其中620bp、429bp、252bp對應(yīng)的分別是福氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)例部分結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

原料來源：

胰蛋白胨(美國Oxford)，葡萄糖(國藥集團(tuán))，NaCl(上海凌峰)，磷酸氫二鉀(國藥集團(tuán))，磷酸二氫鉀(國藥集團(tuán))，3號膽鹽(廣東環(huán)凱)，新生霉素鈉鹽(美國Sigma)，氯化鋰(美國Sigma)，亞碲酸鉀(美國Sigma)；

3種目標(biāo)菌的商業(yè)化選擇性增菌液和選擇性平皿分別為：沙門氏菌RV(1-A)和BS(廣東環(huán)凱)；大腸桿菌O157:H7mEC(1-B)和CT-SMAC(廣東環(huán)凱)；志賀氏菌GN(1-C)和志賀氏菌選擇性平皿(廣東環(huán)凱)；

三種目標(biāo)菌：腸炎沙門氏菌菌株編號ATCC 13076；大腸桿菌O157:H7菌株編號NCTC12900；福氏志賀氏菌菌株編號CMCC 51572，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

實(shí)施例一：SES單增菌效果鑒定

SES培養(yǎng)基的制備：(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨20份，葡萄糖1份，NaCl 5份，磷酸氫二鉀4份，磷酸二氫鉀1.5份；(2)抑制劑：3號膽鹽1.2份，新生霉素鈉鹽20份，氯化鋰0.5份，亞碲酸鉀0.1份；(3)蒸餾水，1000份。分別稱取胰蛋白胨，葡萄糖，NaCl，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，3號膽鹽，氯化鋰，加水?dāng)嚢杈鶆颍?21℃高壓滅菌，冷卻至室溫，在上述混合液中，無菌添加新生霉素鈉鹽，亞碲酸鉀，混勻，即制成所需的共增菌培養(yǎng)基(SES)。

SES單增菌培養(yǎng)：取腸炎沙門氏菌(RV)、大腸桿菌(mEC)O157:H7和福氏志賀氏菌(GN)過夜培養(yǎng)的新鮮菌液分別接于100ml SES和各自的商業(yè)化增菌液中(沙門氏菌為RV，大腸桿菌O157:H7為mEC，志賀氏菌為GN)，菌液的初始接菌量均為10CFU/ml左右，36℃180rpm/min培養(yǎng)24h，每4h取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

SES單增菌效果鑒定：根據(jù)各時間段的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長曲線(圖1)，比較不同增菌液中目標(biāo)菌的生長能力可以看出，SES與三種商業(yè)化增菌液對目標(biāo)菌的最終富集濃度無顯著差異(p<0.05),兩者進(jìn)入對數(shù)期的時間也相近，甚至腸炎沙門氏菌在SES中要比商業(yè)化的RV更早于進(jìn)入快速增殖期，表明SES可以滿足上述3種目標(biāo)菌的富集培養(yǎng)。

實(shí)施例二：SES復(fù)合增菌效果鑒定

SES培養(yǎng)基的制備：參照實(shí)施例一。

SES復(fù)合增菌培養(yǎng)：將腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌3種目的菌分別按不同的濃度比例接入到SES中，上述3種菌的復(fù)合接菌比例分別為：1:1:1、1:10:100、10:100:1和100:1:10。36℃180rpm/min培養(yǎng)24h，每4h取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。各目標(biāo)菌的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基分別選用各自的選擇性平皿：腸炎沙門氏菌為BS、大腸桿菌O157:H7為CT-SMAC、福氏志賀氏菌為志賀氏菌選擇性平皿。

SES復(fù)合增菌效果鑒定：根據(jù)各時間段的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長曲線(圖2)，比較不同濃度比例的目標(biāo)菌在SES中的生長能力可以看出，3種目標(biāo)菌同時在SES中富集時，均可以正常生長，即便某種目標(biāo)菌的接菌比例較低時，其最終生長濃度也可以達(dá)到10⁷的數(shù)量級，可以滿足致病菌鑒定檢測限(一般為10³～10⁵的數(shù)量級)的需求。

實(shí)施例三：SES結(jié)合多重PCR檢測冷凍豬肉中的3種食源性致病菌

SES培養(yǎng)基的制備：參照實(shí)施例一。

待檢樣品的處理：取市售生豬肉10g，豬肉經(jīng)酒精浸泡消毒風(fēng)干后，分別接種腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和福氏志賀氏菌，終濃度均為10CFU/g左右，風(fēng)干至菌液完全吸收，置均質(zhì)袋中于-20℃保存7天。

SES增菌培養(yǎng)與效果鑒定：將人工污染的豬肉樣品10g置于90mlSES中，36℃靜置培養(yǎng)24h，從12h開始每4h取增菌液進(jìn)行上述3種目標(biāo)菌的活菌計(jì)數(shù)，鑒定SES的增菌效果(圖3)。3種目標(biāo)菌在豬肉中經(jīng)-20℃冷凍7天后，仍可被SES富集，富集終濃度最低可達(dá)到10⁷的數(shù)量級，可以滿足致病菌鑒定檢測限(一般為10³～10⁵的數(shù)量級)的需求，表明SES可用于豬肉中上述3種致病菌的檢測，并對冷損傷的菌株有一定修復(fù)能力。

多重PCR檢測模板的準(zhǔn)備：取1ml上述24h SES增菌液，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京全式金)進(jìn)行增菌液總DNA的提取，提取的DNA可置于-20℃保存。

多重PCR檢測：參照文獻(xiàn)合成沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和志賀氏菌的多重PCR引物(上海生工)，引物信息分別為：

AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA與

GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG(沙門氏菌，產(chǎn)物429bp)、

GCGAAAACTGTGGAATTGGG與TGATGCTCCATCACTTCCTG(大腸桿菌O157:H7，產(chǎn)物252bp)、

GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC與

GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC(志賀氏菌，產(chǎn)物620bp)。PCR擴(kuò)增體系為50μl，包含2×Taq PCR MasterMix 25μL(北京全式金)，上下游引物0.2M(沙門氏菌)、0.2M(大腸桿菌)和0.05M(志賀氏菌)，DNA模板3μL，加dd H₂O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件如下：94℃4min，94℃45s，60℃1.5min，72℃1min，擴(kuò)增30循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示SES可聯(lián)合多重PCR用于多種菌的快速高效檢測(圖4)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。