本發(fā)明屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶【5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr】是葉酸代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，其編碼基因的某些多態(tài)性可導(dǎo)致酶活性降低，引起葉酸代謝障礙，從而引發(fā)多種疾病，涉及(1)婦幼保健類：神經(jīng)管缺陷、先天性心臟病、唇腭裂、妊娠期高血壓疾病，自發(fā)性流產(chǎn)；(2)腫瘤類：肺癌、胃癌、大腸癌等；(3)高血壓、冠心病、腦梗塞、腦溢血；(4)精神類疾病等。

mthfr基因rs1801131單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(相關(guān)序列數(shù)據(jù)見圖1)系開放讀碼框第1286位堿基發(fā)生a→c的突變【a1286c，文獻(xiàn)舊稱a1298c，對(duì)應(yīng)于genbank中mrna序列nm_005957.4的1515位堿基或基因組序列ng_013351.1的16685位堿基)，導(dǎo)致多肽鏈第429位的谷氨酸變?yōu)楸彼?np_005948.3:p.glu429ala】，攜帶mthfr1286c等位基因的酶活性為野生型的68％左右，因而阻礙了葉酸代謝，引起一系列疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。檢測(cè)該位點(diǎn)基因型，可指導(dǎo)孕婦合理補(bǔ)充葉酸，預(yù)測(cè)唇腭裂、唐氏綜合癥、神經(jīng)管缺陷等新生兒出生缺陷；還可作為5-氟尿嘧啶(5-fu)化療療效和毒副作用的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)；還可提示腦卒中、冠心病和靜脈血栓的高風(fēng)險(xiǎn)性等。

目前，檢測(cè)mthfr基因rs1801131位點(diǎn)基因型的方法有pcr-rflp、sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、熒光定量pcr、焦磷酸測(cè)序、基因芯片、高分辨率熔解曲線法(hrm)等，除pcr-rflp法外，其他方法均需昂貴設(shè)備或試劑，操作相對(duì)繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)成本高，部分方法還存在結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。相反，pcr-rflp法操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，便于應(yīng)用，但文獻(xiàn)報(bào)道該位點(diǎn)大多采用限制性核酸內(nèi)切酶mboii進(jìn)行檢測(cè)，存在一定的弊端，因?yàn)槎鄳B(tài)位點(diǎn)臨近的一個(gè)mboii識(shí)別序列有可能導(dǎo)致分型錯(cuò)誤，詳見文獻(xiàn)【allenra,gatalicaz,knezeticj,hatcherl,vogeljs,dunnst.acommon1317tcpolymorphisminmthfrcanleadtoerroneous1298acgenotypingbypcr-reandtaqmanprobeassays[j].genettest,2007,11(2):167-173.】的具體分析(圖2)。

此外，也有使用fnu4hi、ajui來檢測(cè)該位點(diǎn)的【相關(guān)文獻(xiàn)分別為下述(1)、(2)】，它們均為稀有的限制性核酸內(nèi)切酶，價(jià)格昂貴，760元/20次酶切反應(yīng)(見thermoscientific公司官網(wǎng)報(bào)價(jià))；另外，pcr產(chǎn)物中不含內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)，酶切不完全時(shí)殘留的pcr產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致基因型誤判。比如在ajui酶切方法中，pcr產(chǎn)物為189bp，a等位基因酶切完全后將產(chǎn)生147bp、32bp、10bp片段，c等位基因無切割位點(diǎn)，將保持和pcr產(chǎn)物一樣大小(189bp)的片段。如果一個(gè)aa型的樣品酶切不完全，既有147、32bp條帶，又殘留189bp片段，將很可能會(huì)被誤判為ac型樣品。

(1)weisbergi,tranp,christensenb,sibanis,rozenr.asecondgeneticpolymorphisminmethylenetetrahydrofolatereductase(mthfr)associatedwithdecreasedenzymeactivity[j].molgenetmetab,1998,64(3):169-172.

(2)machnikg,zapalam,pelce,gasecka-czaplam,kaczmarczykg,okopienb.anewandimprovedmethodbasedonpolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(pcr-rflp)forthedeterminationofa1298cmutationinthemethylenetetrahydrofolatereductase(mthfr)gene[j].annclinlabsci,2013,43(4):436-440.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明選用另一種限制性核酸內(nèi)切酶hinfi來進(jìn)行mthfr基因rs1801131位點(diǎn)的基因分型，它不僅價(jià)格極其便宜(380元/400次)，而且便于設(shè)置內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)作為酶切的內(nèi)部質(zhì)控，確保了分型的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的方法，包括如下步驟：

(1)提取待檢樣品基因組dna；

(2)針對(duì)特定的限制性核酸內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)pcr引物對(duì)，所述pcr引物對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物含有一個(gè)內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)及一個(gè)包含rs1801131多態(tài)位點(diǎn)的識(shí)別序列，所述的多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列只有在多態(tài)位點(diǎn)為其中一種堿基的情況下被所述限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別；

(3)利用步驟(2)所設(shè)計(jì)的pcr引物對(duì)對(duì)待檢樣品基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(4)利用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切；

(5)根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳圖譜確定mthfr基因rs1801131位點(diǎn)的基因型。

所述限制性核酸內(nèi)切酶為hinfi；所述的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)的堿基序列符合gantc模式，其中n＝a、t、c、g四種堿基中的任何一種；所述的多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列符合gaatm模式，其中m為多態(tài)位點(diǎn)堿基，m＝a、c兩種堿基中的任何一種，當(dāng)m為c時(shí)，該識(shí)別序列能夠被限制性核酸內(nèi)切酶hinfi識(shí)別并切割。

所述的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)與多態(tài)位點(diǎn)之間的距離以其酶切產(chǎn)物能夠被區(qū)分為準(zhǔn)。

作為其中一個(gè)方案，所述pcr引物對(duì)中的正向引物倒數(shù)第1位堿基為t，與mthfr基因的第16684位也即多態(tài)位點(diǎn)前1位堿基錯(cuò)配，使得mthfr基因第16681～16685位的堿基序列g(shù)aagm在pcr后變?yōu)間aatm，所述mthfr基因在genbank上的登錄號(hào)為ng_013351.1。

所述pcr引物對(duì)中的反向引物的靶序列位于mthfr基因第16961～16965位堿基序列g(shù)actc之后；又或者是：所述反向引物倒數(shù)第3位堿基為t，與mthfr基因的第16896位堿基錯(cuò)配，使得mthfr基因第16893～16897位堿基序列g(shù)agac在pcr后變?yōu)間agtc，可被限制性核酸內(nèi)切酶hinfi識(shí)別并切割。

作為優(yōu)選的，凡是含有錯(cuò)配堿基的引物，其5′端均附加了一段與模板無關(guān)的附加序列，旨在增加多態(tài)位點(diǎn)、內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)被酶切開和未被酶切開的片段之間的長(zhǎng)度差異，提高電泳的分辨率。所有附加序列中不應(yīng)含有hinfi酶切位點(diǎn)。

作為優(yōu)選的，所述的pcr引物對(duì)為下列任一組：

引物對(duì)1

f1：5′-ctaatacgactgactatagggagaggggaggagctgaccagtgaat-3′(seqidno.1)，

r1：5′-tcatcgttccagggcaggcaagt-3′(seqidno.2)；

引物對(duì)2

f2：5′-acatccactttgcctttctcggaggagctgaccagtgaat-3′(seqidno.3)，

r2：5′-caggaaacagctatgaccaagcccttccaggtggaggact-3′(seqidno.4)。

一種用于檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的引物對(duì)，其擴(kuò)增得到的產(chǎn)物含有一個(gè)內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)及一個(gè)包含rs1801131多態(tài)位點(diǎn)的識(shí)別序列；所述內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)能夠被所述限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別、切割；所述的多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列只有在多態(tài)位點(diǎn)為其中一種堿基的情況下被所述限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別；所述內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)與多態(tài)位點(diǎn)之間的距離以其酶切產(chǎn)物能夠被區(qū)分為準(zhǔn)。

所述的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)的堿基序列符合gantc模式，n＝a、t、c、g四種堿基中的任何一種；所述的多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列符合gaatm模式，其中m為多態(tài)位點(diǎn)堿基，m＝a、c兩種堿基中的任何一種；所述的限制性核酸內(nèi)切酶為hinfi。

作為優(yōu)選的，所述pcr引物對(duì)中的正向引物倒數(shù)第1位堿基為t，與mthfr基因的第16684位堿基錯(cuò)配，使得mthfr基因第16681～16685位序列g(shù)aagm在pcr后變?yōu)間aatm，所述mthfr基因在genbank上的登錄號(hào)為ng_013351.1。

所述pcr引物對(duì)中的反向引物靶序列位于mthfr基因第16961～16965位堿基序列g(shù)actc之后；又或者是：所述反向引物倒數(shù)第3位堿基為t，與mthfr基因的第16896位堿基錯(cuò)配，使得mthfr基因第16893～16897位堿基序列g(shù)agac在pcr后變?yōu)間agtc，可被限制性核酸內(nèi)切酶hinfi識(shí)別并切割。

作為優(yōu)選的，凡是含有錯(cuò)配堿基的引物，其5′端均附加了一段與模板無關(guān)的附加序列，旨在增加多態(tài)位點(diǎn)、內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)被酶切開和未被酶切開的片段之間的長(zhǎng)度差異，提高電泳的分辨率。所有附加序列中不應(yīng)含有hinfi酶切位點(diǎn)。

作為優(yōu)選的，所述的pcr引物對(duì)為下列任一組：

引物對(duì)1

f1：5′-ctaatacgactgactatagggagaggggaggagctgaccagtgaat-3′(seqidno.1)，

r1：5′-tcatcgttccagggcaggcaagt-3′(seqidno.2)；

引物對(duì)2

f2：5′-acatccactttgcctttctcggaggagctgaccagtgaat-3′(seqidno.3)，

r2：5′-caggaaacagctatgaccaagcccttccaggtggaggact-3′(seqidno.4)。

一種用于檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的試劑盒，其包括以上所述的用于檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的引物對(duì)及對(duì)應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明在基于pcr-rflp的方法檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的過程中，采用了一種不同于現(xiàn)有報(bào)道的限制性核酸內(nèi)切酶hinfi，避免了最常用的mboⅱ酶切檢測(cè)時(shí)多態(tài)位點(diǎn)下游15nt處tcttc序列的干擾【因?yàn)閠cttc的反向互補(bǔ)序列為gaaga，野生型等位基因a所在的序列也為gaag兩者都可被mboⅱ識(shí)別，且切割位點(diǎn)幾乎重疊】，也避免了使用其他較昂貴的內(nèi)切酶，同時(shí)還引入了特有的“內(nèi)部質(zhì)控”機(jī)制，即在pcr產(chǎn)物中引入內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)，可根據(jù)酶切圖譜識(shí)別酶切不完全的情形，并且在酶切不完全的情況下，依靠特征條帶可以準(zhǔn)確判斷基因型，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，總之，本發(fā)明檢測(cè)成本相對(duì)較低，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)便，適于試劑盒規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說明

圖1：genbankdbsnp數(shù)據(jù)庫中rs1801131多態(tài)位點(diǎn)及前后相關(guān)序列，m為多態(tài)位點(diǎn)堿基，m＝a或c。

圖2：文獻(xiàn)分析認(rèn)為使用限制性核酸內(nèi)切酶mboⅱ鑒定rs1801131位點(diǎn)基因型，臨近序列會(huì)干擾結(jié)果判斷，故結(jié)果的準(zhǔn)確性無法保證。

圖3：mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)前后各500個(gè)堿基的序列(參考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ng_013351.1，第16685位堿基為多態(tài)位點(diǎn)堿基，此序列顯示野生型等位基因的堿基a)

圖4：mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因分型引物f1、r1與模板對(duì)應(yīng)關(guān)系圖(模板序列參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ng_013351.1)，其中snp位于第16685位；上游引物相關(guān)序列與基因組序列同向，下游引物相關(guān)序列與基因組序列反向互補(bǔ)。按5′→3′的方向，f1倒數(shù)第1位堿基t與模板錯(cuò)配，使得原序列g(shù)aagm在pcr后變?yōu)間aatm，以達(dá)到用hinfi甄別多態(tài)位點(diǎn)的目的。pcr產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)的下游含有固有的hinfi識(shí)別序列g(shù)actc【對(duì)應(yīng)于mthfr基因的第16961～16965位堿基】。另f1的5′端附加了一段與模板無關(guān)的附加序列，旨在增加多態(tài)位點(diǎn)被酶切開和未被酶切開的片段之間的長(zhǎng)度差異，提高電泳的分辨率。該附加序列中不應(yīng)含有hinfi酶切位點(diǎn)。本實(shí)施例中所采用的附加序列為：

ctaatacctatagggaga(seqidno.5)，來源于t7-啟動(dòng)子

ctaatacactatagggaga(seqidno.6)【其中一個(gè)堿基由g修改為c，消除了一個(gè)潛在的hinfi識(shí)別位點(diǎn)】。

圖5：mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因分型引物f2、r2與模板對(duì)應(yīng)關(guān)系圖(模板序列參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ng_013351.1)，其中snp位于第16685位；上游引物相關(guān)序列與基因組序列同向，下游引物相關(guān)序列與基因組序列反向互補(bǔ)。按5′→3′的方向，f2倒數(shù)第1位堿基t與模板錯(cuò)配，該錯(cuò)配使得原序列g(shù)aagm在pcr后變?yōu)間aatm，以達(dá)到用hinfi甄別多態(tài)位點(diǎn)的目的。r2倒數(shù)第3位堿基a的錯(cuò)配將在pcr產(chǎn)物中形成一個(gè)hinfi識(shí)別序列g(shù)agtc作為內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)。f2、r2均為帶有5′端附加序列的長(zhǎng)鏈錯(cuò)配引物，旨在增加被酶切開和未被酶切開的片段之間的電泳區(qū)分度。f25′端附加序列為通用測(cè)序引物t7(17base)：acatccactttgcctttctc(seqidno.7)；r25′端附加序列為通用測(cè)序引物m13r：caggaaacagctatgacc(seqidno.8)。

圖6：引物對(duì)1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖【用凝膠成像系統(tǒng)看膠，m：dl2000dna分子量標(biāo)記；1-10：402bppcr產(chǎn)物】。

圖7：引物對(duì)1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖【用紫外透射儀看膠，m：dna分子量標(biāo)記dnamarkerⅰ，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；1-13:402bppcr產(chǎn)物】；

圖8：引物對(duì)1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物經(jīng)hinfi酶切用于鑒定mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的電泳圖譜【所有樣品基本酶切完全。m：dna分子量標(biāo)記lowladder，廣州東盛生物科技有限公司；p：pcr產(chǎn)物(402bp)；1、4、7、9、10：雜合子ac；2、3、5、8、12：野生型純合子aa；6、11：突變型純合子cc】。

圖9：引物對(duì)1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物經(jīng)hinfi酶切用于鑒定mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的電泳圖譜【所有樣品均有不同程度的酶切不完全現(xiàn)象。m：dna分子量標(biāo)記lowladder，廣州東盛生物科技有限公司；p：pcr產(chǎn)物(402bp)；1、3、4、6、7、8、9：野生型純合子aa；2、5：雜合子ac；10：突變型純合子cc】。

圖10：mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)3種基因型樣品使用引物對(duì)1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物測(cè)序峰圖，從左至右依次為野生型純合子aa、雜合子ac、突變型純合子cc，加框的堿基為多態(tài)位點(diǎn)堿基。

圖11：使用引物對(duì)2通過pcr-rflp鑒定mthfr基因rs1801131位點(diǎn)基因型的電泳圖譜，左邊為本色圖，右邊為反色圖【3種基因型樣品均酶切不完全，有pcr產(chǎn)物或中間產(chǎn)物殘留。m：dna分子量標(biāo)記marker1，廣州東盛生物科技有限公司；p：pcr產(chǎn)物(289bp)；1：突變型純合子cc；2：雜合子ac；3：野生型純合子aa】。

圖12：使用引物對(duì)2檢出的3種基因型樣品的測(cè)序峰圖，從上至下依次為野生型純合子aa、突變型純合子cc、雜合子ac(多態(tài)位點(diǎn)如箭頭所指)。每張圖的右半部分用下劃線顯示的序列g(shù)agtc為錯(cuò)配引物引入的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)前一位的堿基t(加了下劃線的)，系上游引物的錯(cuò)配堿基引入。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1

本實(shí)施例設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物3′端使用了一個(gè)錯(cuò)配堿基，pcr擴(kuò)增后形成多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列g(shù)aatm【m＝a、c堿基。突變型等位基因c的相應(yīng)序列為gaatc，能被限制性核酸內(nèi)切酶hinfi識(shí)別；野生型等位基因a的相應(yīng)序列為gaata，不能被hinfi識(shí)別】，下游引物為常規(guī)引物，可與mthfr基因的第17018～17040位堿基序列反向互補(bǔ)。pcr產(chǎn)物包含一個(gè)固有的hinfi識(shí)別序列g(shù)actc用作酶切內(nèi)對(duì)照。具體方案如下：

1.基因組dna提取

采用口腔拭子基因組dna提取試劑盒，按說明書的操作步驟提取基因組dna。dna來源不限于此，任何體細(xì)胞來源的dna均可。

2.引物設(shè)計(jì)

調(diào)取mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)前后各500bp的序列【見圖1、圖3】，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)該位點(diǎn)的特異性分型引物。其中，上游引物的3′端需毗鄰多態(tài)位點(diǎn)，且倒數(shù)第1位堿基為t，這樣方可通過pcr擴(kuò)增引進(jìn)一個(gè)識(shí)別序列g(shù)aatm，其中t由錯(cuò)配堿基引入，突變型等位基因的相應(yīng)序列為gaatc，能為hinfi識(shí)別，野生等位基因a的相應(yīng)序列為gaata，不能為hinfi識(shí)別，故可用hinfi甄別多態(tài)位點(diǎn)。上游引物5′端附加一段與模板無關(guān)的序列，旨在增加多態(tài)位點(diǎn)被酶切開和未被酶切開的片段之間的長(zhǎng)度差異，提高電泳的分辨率。

根據(jù)上述思路，設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物：

f1：5′-ctaatacgactactatagggagaggggaggagctgaccagtgaa-3′(seqidno.1)，

r1：5′-tcatcgttccagggcaggcaagt-3′(seqidno.2)

其中f1的5′端附加了一段序列ctaatacactatagggaga(seqidno.5)，它來源于t7-啟動(dòng)子ctaatacactatagggaga(seqidno.6)，其中一個(gè)堿基由g修改為c，消除了一個(gè)潛在的hinfi識(shí)別位點(diǎn)。

該對(duì)引物的具體位置及與模板的對(duì)應(yīng)關(guān)系見圖4(為方便起見，圖中正向引物相關(guān)序列與模板序列方向一致，反向引物相關(guān)序列與模板序列反向互補(bǔ))。

該對(duì)引物擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物大小為402bp。

完全酶切后，3種基因型樣品的條帶如下：

野生型純合子aa：324.5、77.5

雜合子ac：324.5、280、77.5、44.5

突變型純合子cc：280、77.5、44.5

根據(jù)324.5bp、280bp兩個(gè)片段的組合情況就可區(qū)分3種基因型。

如果酶切不完全，將會(huì)殘留pcr產(chǎn)物或其它中間條帶，通過與pcr產(chǎn)物、marker對(duì)照，本系統(tǒng)可以輕易識(shí)別，并且可以根據(jù)圖譜中的特征條帶324.5bp、280bp來判定基因型。

3.目的片段的pcr擴(kuò)增及鑒定

pcr反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)條件：

pcr產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

4.pcr產(chǎn)物的酶切分型

本實(shí)施例使用的限制性核酸內(nèi)切酶為thermoscientific的快速限制性核酸內(nèi)切酶hinfi。

酶切體系總體積為30μl，具體配方如下：

其中pcr產(chǎn)物的量可以視pcr產(chǎn)物的濃度加以調(diào)整，通常為10～26μl，相應(yīng)的ddh2o隨之加以改變。

酶切在37℃水浴鍋中進(jìn)行，時(shí)間為15min～30min；然后于65℃水浴保溫20min以滅活內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物行3％瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察電泳圖譜以確定基因型。

5.測(cè)序驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性

選取上述pcr-rflp法檢出的3種基因型樣品各1例，將相應(yīng)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行sanger法測(cè)序，結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的分型引物，可以對(duì)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。

6.實(shí)際檢測(cè)案例

提取受檢者基因組dna，利用引物對(duì)f1、r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用限制性核酸內(nèi)切酶hinfi對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切。

圖6、7為pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，條帶非常單一，說明引物的特異性非常高；

圖8為pcr產(chǎn)物完全酶切電泳圖譜，可非常清晰直觀地判斷基因型；

圖9所有樣品均有不同程度的酶切不完全現(xiàn)象，本方案可清楚加以識(shí)別，且不影響基因型判斷。

圖10為本方案檢出的3種基因型樣品的測(cè)序峰圖，測(cè)序結(jié)果完全吻合。

實(shí)施例2

本實(shí)施例既使用錯(cuò)配的上游引物通過pcr擴(kuò)增形成多態(tài)位點(diǎn)識(shí)別序列g(shù)aatm【m＝a、c堿基。突變型等位基因c的相應(yīng)序列為gaatc，能被限制性核酸內(nèi)切酶hinfi識(shí)別；野生型等位基因a的相應(yīng)序列為gaata，不能被hinfi識(shí)別】，又通過錯(cuò)配的下游引物通過pcr擴(kuò)增形成一個(gè)hinfi識(shí)別序列用作酶切內(nèi)對(duì)照。具體方案如下：

1.基因組dna提取

采用口腔拭子基因組dna提取試劑盒，按說明書的操作步驟提取基因組dna。dna來源不限于此，任何體細(xì)胞來源的dna均可。

2.引物設(shè)計(jì)

調(diào)取mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)前后各500bp的序列(見圖1、圖3)，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)該位點(diǎn)的特異性分型引物。其中，上游引物的3′端需毗鄰多態(tài)位點(diǎn)，且倒數(shù)第1位堿基為t，這樣方可通過pcr擴(kuò)增引進(jìn)一個(gè)識(shí)別序列g(shù)aatm，其中t由錯(cuò)配引物引入，突變型等位基因的相應(yīng)序列為gaatc，能為hinfi識(shí)別，野生等位基因a的多態(tài)位點(diǎn)相應(yīng)序列為gaata，不能為hinfi識(shí)別，故可用hinfi甄別多態(tài)位點(diǎn)。下游引物倒數(shù)第3位采用錯(cuò)配堿基a將基因組模板序列g(shù)agc變?yōu)閜cr產(chǎn)物中的序列g(shù)agc，從而成為可被hinfi識(shí)別的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)，為了增加多態(tài)位點(diǎn)、內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)被酶切開和未被酶切開的相關(guān)片段之間的電泳辨識(shí)度，上、下游引物均應(yīng)為長(zhǎng)鏈引物，根據(jù)上述思路，設(shè)計(jì)了如下1對(duì)引物：

f2：5′-acatccactttgcctttctcggaggagctgaccagtgaa-3′(seqidno.3)，r2：5′-caggaaacagctatgaccaagcccttccaggtggaggct-3′(seqidno.4)。

引物f2、r2除了在3′端均含一個(gè)錯(cuò)配堿基外，5′端各自附加了一段與模板基本無關(guān)的序列。

上述引物的具體位置及與模板的對(duì)應(yīng)關(guān)系見圖5(為方便起見，圖中正向引物的相關(guān)序列與模板序列方向一致，反向引物的相關(guān)序列與模板序列反向互補(bǔ))。

上述引物的pcr產(chǎn)物大小均為289bp。

完全酶切后，3種基因型樣品的條帶如下：

野生型純合子aa:250.5、38.5

雜合子ac：250.5、212

突變型純合子cc：212、38.5

根據(jù)250.5bp、212bp兩個(gè)片段的組合情況就可區(qū)分3種基因型。

如果酶切不完全，將會(huì)殘留pcr產(chǎn)物或其它中間條帶，通過與pcr產(chǎn)物、marker對(duì)照，本系統(tǒng)可以輕易識(shí)別，并且可以根據(jù)圖譜中的特征條帶250.5bp、212bp來判定基因型。

3.目的片段的pcr擴(kuò)增及鑒定

pcr反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)條件：

pcr產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

4.pcr產(chǎn)物的酶切分型

本實(shí)施例使用的限制性核酸內(nèi)切酶為thermoscientific的快速限制性核酸內(nèi)切酶hinfi。

酶切體系總體積為30μl，具體配方如下：

其中pcr產(chǎn)物的量可以視pcr產(chǎn)物的濃度加以調(diào)整，通常為10～26μl，相應(yīng)的ddh2o隨之加以改變。

酶切在37℃水浴鍋中進(jìn)行，時(shí)間為15min～30min；然后于65℃水浴保溫20min以滅活內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物行3％瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察電泳圖譜以確定基因型。

5.測(cè)序驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性

選取上述pcr-rflp法檢出的3種基因型樣品各1例，將相應(yīng)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行sanger法測(cè)序，結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的分型引物，可以對(duì)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。

6.實(shí)際檢測(cè)案例

提取受檢者基因組dna，利用引物對(duì)(f2、r2)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用限制性核酸內(nèi)切酶hinfi對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切。

圖11為使用引物對(duì)(f2、r2)通過pcr-rflp鑒定mthfr基因rs1801131位點(diǎn)酶切圖譜，盡管有殘留的pcr產(chǎn)物或酶切中間產(chǎn)物，但并不妨礙基因型的判斷，在反色圖中尤為清晰。

圖12為使用引物對(duì)(f2、r2)檢出的3種基因型樣品的測(cè)序峰圖，測(cè)序結(jié)果完全吻合。從上至下依次為野生型純合子aa、突變型純合子cc、雜合子ac(多態(tài)位點(diǎn)如箭頭所指)。每張圖的右半部分用下劃線顯示的序列g(shù)agtc為錯(cuò)配堿基引入的內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)前一位的堿基t(加了下劃線的)，系上游引物的錯(cuò)配堿基引入。

以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。

sequencelisting

<110>廣東藥科大學(xué)

<120>一種檢測(cè)mthfr基因rs1801131多態(tài)位點(diǎn)基因型的方法及試劑盒

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctaatacgactgactatagggagaggggaggagctgaccagtgaat46

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcatcgttccagggcaggcaagt23

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acatccactttgcctttctcggaggagctgaccagtgaat40

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caggaaacagctatgaccaagcccttccaggtggaggact40

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctaatacgactgactatagggaga24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctaatacgactcactatagggaga24

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

acatccactttgcctttctc20

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

caggaaacagctatgacc18