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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及左旋美普他酚前藥及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

美普他酚(Meptazino1)是一個(gè)副作用小的有效鎮(zhèn)痛藥，分子內(nèi)有一個(gè)手性中心，1986年以外消旋體的鹽酸鹽上市，由于療效肯定，得到市場(chǎng)認(rèn)可，1998年為英國(guó)藥典收藏。與其他阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥相比，其呼吸抑制和成癮性等副作用極低，故不屬“麻藥”管理范疇。同時(shí)，美普他酚兩個(gè)光學(xué)對(duì)映異構(gòu)體呈現(xiàn)不同的生物活性，尤其在對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制性上，左旋體活性遠(yuǎn)高于右旋體。

對(duì)公認(rèn)有效的藥物進(jìn)行前體藥物設(shè)計(jì)是創(chuàng)新藥物研究中的有效方法。前體藥物研究是以現(xiàn)有藥物為先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾優(yōu)化其藥動(dòng)及藥效學(xué)性質(zhì)。通過(guò)這種方法，不僅可以提高藥物的吸收、降低藥物的毒性及不良反應(yīng)，而且能利用現(xiàn)有緩釋技術(shù)有效延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，增強(qiáng)藥物的靶向性等。通常前藥化合物制備簡(jiǎn)單易行，還具有投資少、風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)點(diǎn)。

目前，美普他酚前藥有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

美普他酚的肝臟首過(guò)效應(yīng)嚴(yán)重，口服吸收后酚羥基迅速在肝臟處被葡萄糖醛酸化或硫酸化，從而形成水溶性代謝產(chǎn)物而在尿中排出，生物利用度不高，只有約8％。

同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)，(-)-美普他酚(左旋美普他酚)對(duì)AChE的抑制活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于(+)-美普他酚(右旋美普他酚)。

基于上述問(wèn)題和發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人對(duì)左旋美普他酚進(jìn)行了適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，使其與其它基團(tuán)經(jīng)化學(xué)鍵相連接，形成暫時(shí)的化學(xué)結(jié)合物，從而改變或修飾左旋美普他酚的物化性質(zhì)，有效阻止酚羥基結(jié)合物的形成。在本發(fā)明中，發(fā)明人提出了左旋美普他酚酯類(lèi)前藥及其制備方法，左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子在體內(nèi)經(jīng)酶促或非酶促化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成左旋美普他酚而發(fā)揮作用，左旋美普他酚酯類(lèi)前藥可有效減輕肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高左旋美普他酚的生物利用度。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述化合物為式I所示的化合物或式I所示化合物的立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、氮氧化物、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物或藥學(xué)上可接受的鹽，

其中，R為酯基團(tuán)，式I所示化合物為左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的化合物有效阻止了酚羥基結(jié)合物的形成，有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高了左旋美普他酚的生物利用度。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述化合物還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述酯基團(tuán)包括選自磷酸酯基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、氨基碳酸酯基團(tuán)的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的含有上述酯基團(tuán)的化合物(左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子)有效避免了酚羥基結(jié)合物的形成，有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高了左旋美普他酚的生物利用度。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將式II所示化合物進(jìn)行酯化反應(yīng)，以便獲得式I所示化合物，

其中，式II所示化合物為左旋美普他酚。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，左旋美普他酚進(jìn)行酯化反應(yīng)，從而獲得左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子，左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高了左旋美普他酚的生物利用度。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備化合物的方法還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，當(dāng)式I所示化合物中的R為磷酸酯基團(tuán)時(shí)，所述方法包括：將式II所示化合物與三氯氧磷、三乙胺和乙醇接觸，以便生成式III所示化合物，

其中，所述接觸是在二氯甲烷中進(jìn)行的，式III所示化合物是磷酸酯左旋美普他酚前藥分子。三氯氧磷是磷酸酯基團(tuán)引入化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的磷酸酯左旋美普他酚前藥分子，屏蔽了酚羥基，具有肝臟首過(guò)效應(yīng)低，生物利用度高的特點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，當(dāng)式I所示化合物中的R為磷酸酯基團(tuán)時(shí)，所述方法進(jìn)一步包括：向第一無(wú)水二氯甲烷中加入三氯氧磷，并冷卻至0～5℃，以便獲得溶液A；向第二無(wú)水二氯甲烷中加入式II所示化合物和三乙胺，并混合均勻，以便獲得溶液B；將溶液B滴加至溶液A，然后于0℃反應(yīng)1小時(shí)，以便獲得溶液C；向溶液C中加入乙醇，并自然升溫至室溫，然后于攪拌狀態(tài)下反應(yīng)0.5小時(shí)，以便獲得溶液D；將溶液D依次進(jìn)行濃縮、純化，以便得到式III所示化合物，其中，第一無(wú)水二氯甲烷、三氯氧磷、第二無(wú)水二氯甲烷、式II所示化合物、三乙胺和乙醇的用量比例為3ml:1.1mmol:1ml:0.9mmol:4.3mmol:2ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)上述方法將磷酸酯基團(tuán)引入左旋美他酚，得到的磷酸酯左旋美普他酚前藥分子在人體內(nèi)可被廣泛存在的磷酸酯酶迅速水解為原藥左旋美普他酚而發(fā)揮作用，從而達(dá)到提高生物利用度。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病或者急慢性疼痛。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述急慢性疼痛包括創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼或神經(jīng)性疼痛。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默病和帕金森氏癥。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子用于制備藥物，所述藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病或者一系列疼痛疾病，包括各類(lèi)急慢性疼痛，如創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼及神經(jīng)性疼痛等，療效顯著。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1-圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，用于機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)試的疼痛反應(yīng)記錄表；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，不同劑量、不同時(shí)間點(diǎn)下，左旋美普他酚抗痛覺(jué)超敏效果對(duì)比結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

化合物

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述化合物為式I所示的化合物或式I所示化合物的立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、氮氧化物、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物或藥學(xué)上可接受的鹽，

其中，R為酯基團(tuán)，式I所示化合物為左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的化合物的溶解度與左旋美普他酚沒(méi)有顯著差別，并且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和酶代謝活性，其在體內(nèi)經(jīng)酶促化學(xué)反應(yīng)，可轉(zhuǎn)變成左旋美普他酚而發(fā)揮作用，從而本發(fā)明所提出的化合物有效阻止了酚羥基結(jié)合物的形成，有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高了左旋美普他酚的生物利用度。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述酯基團(tuán)包括選自磷酸酯基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、氨基碳酸酯基團(tuán)的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的含有上述酯基團(tuán)的化合物(左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子)有效避免了酚羥基結(jié)合物的形成，有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高了左旋美普他酚的生物利用度。

制備化合物的方法

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將式II所示化合物進(jìn)行酯化反應(yīng)，以便獲得式I所示化合物，

其中，式II所示化合物為左旋美普他酚。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，左旋美普他酚進(jìn)行酯化反應(yīng)，從而獲得左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子，左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子具備較好的水溶性，化學(xué)穩(wěn)定性和酶代謝活性，與原藥左旋美普他酚相比，可有效屏蔽母體分子酚羥基，有效減輕了肝臟首過(guò)效應(yīng)，可有效提高生物利用度。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以通過(guò)將式II所示化合物與選自三氯氧磷或其衍生物進(jìn)行接觸而實(shí)現(xiàn)酯化反應(yīng)。三氯氧磷或其衍生物與左旋美普他酚進(jìn)行酯化反應(yīng)，從而獲得磷酸脂左旋美普他酚前藥分子。

下面以制備磷酸酯左旋美普他酚前藥分子為例，詳細(xì)描述制備本發(fā)明的左旋美普他酚前藥分子的方法：

制備磷酸酯左旋美普他酚前藥分子的方法(式III所示化合物)

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)式I所示化合物中的R為磷酸酯基團(tuán)時(shí)，方法包括：將式II所示化合物與三氯氧磷、三乙胺和乙醇接觸，以便生成式III所示化合物，

其中，所述接觸是在二氯甲烷中進(jìn)行的，式III所示化合物是磷酸酯左旋美普他酚前藥分子。三氯氧磷是磷酸酯基團(tuán)引入化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的磷酸酯左旋美普他酚前藥分子，屏蔽了酚羥基，具有肝臟首過(guò)效應(yīng)低，生物利用度高的特點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)式I所示化合物中的R為磷酸酯基團(tuán)時(shí)，方法進(jìn)一步包括：向第一無(wú)水二氯甲烷中加入三氯氧磷，并冷卻至0～5℃，以便獲得溶液A；向第二無(wú)水二氯甲烷中加入式II所示化合物和三乙胺，并混合均勻，以便獲得溶液B；將溶液B滴加至溶液A，然后于0℃反應(yīng)1小時(shí)，以便獲得溶液C；向溶液C中加入乙醇，并自然升溫至室溫，然后于攪拌狀態(tài)下反應(yīng)0.5小時(shí)，以便獲得溶液D；將溶液D依次進(jìn)行濃縮、純化，以便得到式III所示化合物，其中，第一無(wú)水二氯甲烷、三氯氧磷、第二無(wú)水二氯甲烷、式II所示化合物、三乙胺和乙醇的用量比例為3ml:1.1mmol:1ml:0.9mmol:4.3mmol:2ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)上述方法將磷酸酯基團(tuán)引入左旋美他酚，可以改善藥物的透膜能力，增加藥物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，降低藥物表面消除率；通過(guò)上述方法制備的磷酸酯左旋美普他酚前藥分子在人體內(nèi)可被廣泛存在的磷酸酯酶迅速水解為原藥左旋美普他酚而發(fā)揮作用，可有效提高生物利用度。

化合物在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病或者急慢性疼痛。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述急慢性疼痛包括創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼或神經(jīng)性疼痛。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默病和帕金森氏癥。

需要說(shuō)明的是，左旋美普他酚對(duì)乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制活性，并且呼吸抑制和成癮性等副作用極低，鎮(zhèn)痛效果顯著。本發(fā)明所提出的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子與左旋美譜他酚具有相同的藥效，但其生物利用度卻顯著提高，因此本發(fā)明所提出的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子用于制備藥物，所述藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病或者一系列疼痛疾病，包括各類(lèi)急慢性疼痛，如創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼及神經(jīng)性疼痛等，在服用相同劑量的前提下，療效顯著提高。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種用于治療神經(jīng)退行性疾病或者一系列疼痛疾病的藥物組合物，其包含左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子或藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分。由此，利用該藥物組合物能夠有效地治療神經(jīng)退行性疾病或者一系列疼痛疾病，包括各類(lèi)急慢性疼痛，如創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼及神經(jīng)性疼痛等。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，包含本發(fā)明的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子的藥物組合物還可以包括藥物上可接受的載體，且藥物組合物的劑型和給藥方式不受特別限制。對(duì)于口服給藥，該藥物上可接受的載體可以包括粘合劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑，賦形劑，增溶劑，分散劑，穩(wěn)定劑，懸浮劑，著色劑和芳香劑。對(duì)于注射制劑，藥物上可接受的載體可以包括緩沖劑，防腐劑，止痛劑，增溶劑，等滲壓劑(isotonic agent)和穩(wěn)定劑。對(duì)于局部給藥的制劑，藥物上可接受的載體可以包括堿，賦形劑，潤(rùn)滑劑和防腐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以與上述的藥物上可接受的載體結(jié)合被制備成各種劑型。例如，對(duì)于口服給藥，藥物組合物可以被制備成小片，片劑，膠囊，酏劑，混懸液，糖漿或薄片。對(duì)于注射制劑，藥物組合物可以被制備成例如一次劑量的劑型的安瓿或例如多劑量容器的單元型劑型。藥物組合物還可以被制備成溶液，懸浮液，藥片，藥丸，膠囊和長(zhǎng)效制劑。

其中，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，適合藥物配方的載體中賦形劑和稀釋液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯，羥苯丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。

根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物中還可以包括填充劑，抗凝血?jiǎng)?，?rùn)滑劑，保濕劑，芳香劑和防腐劑。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子和以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物組合物能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，呼吸抑制和成癮性副作用低，因而，本發(fā)明的以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物以及包含該左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子的藥物組合物可以在治療神經(jīng)退行性疾病或者一系列疼痛疾病，包括各類(lèi)急慢性疼痛，如創(chuàng)傷、術(shù)后、產(chǎn)科和癌癥疼痛，偏頭疼及神經(jīng)性疼痛等時(shí)被給藥。

在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“給藥”指將預(yù)定量的物質(zhì)通過(guò)某種適合的方式引入病人。本發(fā)明的以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物可以通過(guò)任何常見(jiàn)的途徑被給藥，只要它可以到達(dá)預(yù)期的組織。給藥的各種方式是可以預(yù)期的，包括腹膜，靜脈，肌肉，皮下，皮層，口服，局部，鼻腔，肺部和直腸，但是本發(fā)明不限于這些已舉例的給藥方式。然而，由于口服給藥時(shí)，口服給藥的組合物的活性成分應(yīng)該被包被或被配制以防止其在胃部被降解。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細(xì)胞的特定器械來(lái)給藥。

本發(fā)明的藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過(guò)多個(gè)相關(guān)因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類(lèi)型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴(yán)重程度以及作為活性成分的藥物類(lèi)型。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，日劑量可分為適宜形式的1劑、2劑或多劑，以在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)以1次、2次或多次給藥，只要達(dá)到治療有效量即可。

術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指化合物足以顯著改善某些與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的量，也即為給定病癥和給藥方案提供治療效果的量。例如，在治療神經(jīng)退行性疾病或者陣痛中，減少、預(yù)防、延緩、抑制或阻滯疾病或病癥的任何癥狀的藥物或化合物應(yīng)當(dāng)是治療有效的。治療有效量的藥物或化合物不需要治愈疾病或病癥，但將為疾病或病癥提供治療，使得個(gè)體的疾病或病癥的發(fā)作被延緩、阻止或預(yù)防，或者疾病或病癥的癥狀得以緩解，或者疾病或病癥的期限被改變，或者例如疾病或病癥變得不嚴(yán)重，或者加速康復(fù)。

術(shù)語(yǔ)“治療”用于指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良作用而言可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋哺乳動(dòng)物、特別是人的疾病(主要指神經(jīng)退行性疾病或者疼痛)的治療，包括：(a)在容易患病但是尚未確診得病的個(gè)體中預(yù)防疾病(例如預(yù)防神經(jīng)退行性疾病)或病癥發(fā)生；(b)抑制疾病，例如阻滯疾病發(fā)展；或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關(guān)的癥狀。本文使用的“治療”涵蓋將藥物或化合物給予個(gè)體以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個(gè)體的疾病的任何用藥，包括但不限于將含本文所述的以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物給予有需要的個(gè)體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物或藥物組合物可與常規(guī)治療方法和/或療法相結(jié)合使用，或者可與常規(guī)治療方法和/或療法分開(kāi)使用。當(dāng)本發(fā)明的以左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子為活性成分的藥物或藥物組合物在采用與其它藥物的聯(lián)合療法中給藥時(shí)，它們可序貫地或同時(shí)地給予個(gè)體?；蛘?，本發(fā)明的藥物組合物可包含本發(fā)明的左旋美普他酚酯類(lèi)前藥分子、藥學(xué)上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的賦形劑以及本領(lǐng)域已知的其它治療藥或預(yù)防藥的組合。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備磷酸酯左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10091)

其中，式III所示化合物即為磷酸酯左旋美普他酚前藥分子，也稱(chēng)為化合物“XW10091”。

(1)向3mL無(wú)水二氯甲烷(DCM)中加入0.2g(1.1mmol)三氯氧磷(POCl₃)，用冰水浴冷卻至0-5℃；

(2)向1mL無(wú)水二氯甲烷中加入0.2g(0.9mmol)左旋美普他酚固體

和0.4g(4.3mmol)三乙胺，混合均勻后，滴加至步驟(1)所得的三氯氧磷的二氯甲烷溶液中，0℃反應(yīng)1小時(shí)；

(3)向步驟(2)所得溶液中加入2mL乙醇(EtOH)，自然升溫至室溫，

攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)；

(4)將步驟(3)所得溶液依次經(jīng)過(guò)濃縮，中性制備分離純化得到160mg磷酸酯左旋美普他酚前藥分子，收率為51％。

磷酸酯左旋美普他酚前藥分子¹H NMR及MS(ESI)分析數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝7.32(t,J＝7.8Hz,1H),7.18-7.14(m,2H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),4.17-4.10(m,4H),2.78(d,J＝14.0Hz,1H),2.64-2.37(m,3H),2.30(s,3H),2.03-1.98(m,1H),1.75-1.49(m,6H),1.48-1.34(m,1H),1.24(t,J＝7.4Hz,6H),0.51(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):370.2[M+1]⁺。

實(shí)施例2制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10093)

向4mL無(wú)水二氯甲烷中加入0.16g(1.0mmol)三氯氧磷，用冰水浴冷卻至0-5℃。向1mL無(wú)水二氯甲烷中加入0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和三乙胺0.4g(4.3mmol)，混合均勻后，滴加至三氯氧磷的二氯甲烷溶液中，0℃反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，加入2mL水自然升溫至室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，濃縮，制備純化得到0.2g淡黃色油狀物，收率75％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.47(t,J＝8.2Hz,1H),7.37-7.23(m,2H),7.23-7.10(m,1H),3.85(d,J＝14.4Hz,1H),3.61(d,J＝14.4Hz,1H),3.23(t,J＝6.0Hz,2H),2.89(s,3H),2.49(dd,J＝6.0,14.4Hz,1H),2.02-1.83(m,3H),1.82-1.50(m,4H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):314.4[M+1]⁺。

實(shí)施例3制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10187)

該化合物XW10187即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚乙基碳酸酯。

0.3g(1.3mmol)左旋美普他酚和195.0mg(1.9mmol)三乙胺溶解在6mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加167.0mg(1.5mmol)氯甲酸乙酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌16小時(shí)并加入10mL二氯甲烷稀釋。稀釋過(guò)的反應(yīng)液依次用10mL水和10mL鹽水洗。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1–1/1)得到280.0mg油狀物。將該油狀物溶解于2mL鹽酸乙酸乙酯溶液中(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，有淡黃色固體析出，過(guò)濾、干燥得到150.0mg淡黃色固體化合物，為產(chǎn)物的鹽酸鹽形式，收率34％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.55(t,J＝8.0Hz,1H),7.41(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(s,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,1H),4.33(q,J＝7.0Hz,2H),3.85(d,J＝14.4Hz,1H),3.62(d,J＝14.0Hz,1H),3.22(t,J＝5.8Hz,2H),2.86(s,3H),2.45(dd,J＝4.8,14.8Hz,1H),2.04-1.49(m,7H),1.34(t,J＝7.2Hz,3H),0.57(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):306.3[M+1]⁺。

實(shí)施例4制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10190)

該化合物XW10190即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚異丙基碳酸酯。

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和95.4mg(0.9mmol)三乙胺溶解在2mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加115.5mg(0.9mmol)氯甲酸異丙酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌16小時(shí)并加入10mL二氯甲烷稀釋。稀釋過(guò)的反應(yīng)液依次用10mL水和10mL鹽水洗。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–3/1)得到280.0mg油狀物。將該油狀物溶解于2mL鹽酸乙酸乙酯中(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，有固體析出，過(guò)濾、干燥得到150.0mg白色固體，為產(chǎn)物的鹽酸鹽形式，收率57％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.56(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),5.02-4.96(m,1H),3.86(d,J＝14.4Hz,1H),3.63(d,J＝14.0Hz,1H),3.23(t,J＝5.2Hz,2H),2.87(s,3H),2.46(dd,J＝6.0,14.8Hz,1H),1.91-1.76(m,4H),1.73-1.49(m,3H),1.36(d,J＝6.0Hz,6H),0.59(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):320.2[M+1]⁺。

實(shí)施例5制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10195)

該化合物XW10195即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚環(huán)己基碳酸酯。

步驟一：

3.6g(12.0mmol)三光氣溶于20mL甲苯中，形成均相溶液。將該溶液冷卻至0℃，緩慢滴加1.2g(15.0mmol)吡啶，形成黃色漿狀物。保持反應(yīng)溫度為0℃攪拌0.5小時(shí)后，向反應(yīng)中滴加環(huán)己醇溶液(1.0g(10.0mmol)溶解在10mL甲苯中)。滴加完成后，反應(yīng)變?yōu)榘咨珴{狀物，攪拌1小時(shí)后，向反應(yīng)中加入30mL水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷(2x 30mL)萃取。收集合并有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到1.1g淡黃色液體(粗品)，收率69％。產(chǎn)物為氯甲酸環(huán)己基酯，不需純化直接用于下一步反應(yīng)。

步驟二：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和173.5mg(1.7mmol)三乙胺溶解在2mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴冷卻至0℃，滴加209.1mg(1.3mmol)氯甲酸環(huán)己基酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)并加入10mL二氯甲烷稀釋。稀釋過(guò)的反應(yīng)液用水(2x5mL)洗。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–3/1)得到240.0mg粘稠油狀物。將該油狀物溶解于0℃的2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，濃縮后得到200.0mg白色固體，為產(chǎn)物的鹽酸鹽形式，收率68％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.30(t,J＝8.0Hz,1H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.12(s,1H),7.01(dd,J＝1.6,8.0Hz,1H),4.75-4.67(m,1H),2.84(d,J＝14.0Hz,1H),2.58-2.45(m,3H),2.38(s,3H),2.11(dd,J＝8.0,14.4Hz,1H),2.02-1.98(m,2H),1.82-1.49(m,9H),1.44-1.22(m,6H),0.59(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):360.4[M+1]⁺。

實(shí)施例6制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10198)

該化合物XW10198即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚芐基碳酸酯。

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和104.1mg(1.0mmol)三乙胺溶解在4mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴冷卻至0℃，滴加175.5mg(1.0mmol)氯甲酸芐酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)后濃縮得到半固體，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–1/1)得到220.0mg淡黃色油狀物。將該油狀物溶解于2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，濃縮后得到泡狀固體，向該固體中加入2mL甲基叔丁基醚打漿4小時(shí)，形成類(lèi)白色漿狀物，過(guò)濾干燥得到190.0mg類(lèi)白色固體，為產(chǎn)物鹽酸鹽形式，收率55％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.61-7.45(m,6H),7.42(d,J＝7.2Hz,1H),7.29(s,1H),7.19(d,J＝7.6Hz,1H),5.34(s,2H),3.84(d,J＝14.0Hz,1H),3.62(d,J＝14.0Hz,1H),3.22(t,J＝5.6Hz,2H),2.86(s,3H),2.45(d,J＝12.8Hz,1H),1.92-1.75(m,4H),1.65-1.57(m,3H),0.58(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(ESI):368.8[M+1]⁺。

實(shí)施例7制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10199)

該化合物XW10199即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚異丁基碳酸酯。

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和104.1mg(1.0mmol)三乙胺溶解在4mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加128.8mg(0.9mmol)氯甲酸異丁酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)，加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)♂屵^(guò)的反應(yīng)液用水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–1/1)得到110.0mg油狀物。將該油狀物溶解于2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，用油泵濃縮后得到泡狀固體，向該固體中加入1mL甲基叔丁基醚打漿，過(guò)濾干燥得到70.0mg白色固體，為產(chǎn)物鹽酸鹽形式，收率22％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.57(t,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝6.8Hz,1H),7.32(s,1H),7.21(d,J＝8.0Hz,1H),4.12(d,J＝6.4Hz,2H),3.92-3.80(m,1H),3.64(d,J＝14.0Hz,1H),3.24(br.s.,2H),2.90(s,3H),2.49(d,J＝12.0Hz,1H),2.08-2.01(m,1H),1.98-1.75(m,4H),1.67-1.60(m,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,6H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):334.3[M+1]⁺。

實(shí)施例8制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10200)

該化合物XW10200即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-4-氧雜四氫吡喃基碳酸酯。

步驟一：

3.5g(11.8mmol)三光氣溶于20mL甲苯中，形成均相溶液。將該溶液冷卻至0℃，緩慢滴加1.2g(15.0mmol)吡啶，形成黃色漿狀物。保持反應(yīng)溫度為0℃攪拌0.5小時(shí)后，向反應(yīng)中滴加四氫吡喃-4-醇溶液(1.0g(9.8mmol)溶解在10mL甲苯中)。滴加完成后，反應(yīng)變?yōu)榘咨珴{狀物，攪拌1小時(shí)后，向反應(yīng)中加入30mL水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(2x 30mL)萃取。收集合并有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到1.2g無(wú)色液體(粗品)，收率75％。產(chǎn)物氯甲酸-4-氧雜四氫吡喃酯不純化，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟二：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和173.5mg(1.7mmol)三乙胺溶解在4mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加211.6mg(1.3mmol)氯甲酸-4-氧雜四氫吡喃酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)，加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)♂屵^(guò)的反應(yīng)液用水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–3/1)得到180.0mg淡黃色油狀物。將該油狀物溶解于0℃的2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，用油泵濃縮后得到泡狀固體，向該固體中加入2mL甲基叔丁基醚打漿4小時(shí)，過(guò)濾干燥得到180.0mg類(lèi)白色固體，為產(chǎn)物鹽酸鹽形式，收率53％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.56(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(d,J＝7.6Hz,1H),7.32(s,1H),7.21(d,J＝8.0Hz,1H),5.03-4.97(m,1H),4.01-3.81(m,3H),3.70-3.58(m,3H),3.27-3.16(m,2H),2.88(s,3H),2.48-2.41(m,1H),2.15-2.01(m,2H),2.00-1.73(m,6H),1.72-1.50(m,3H),0.58(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):362.3[M+1]⁺。

實(shí)施例9制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10202)

該化合物XW10202即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-((1R,2S,5R)-2-異丙基-5-甲基)環(huán)己基碳酸酯。

步驟一：

2.3g(7.7mmol)三光氣溶于20mL甲苯中，形成均相溶液。將該溶液冷卻至0℃，緩慢滴加759.3g(9.6mmol)吡啶，形成黃色漿狀物。保持反應(yīng)溫度為0℃攪拌0.5小時(shí)后，向反應(yīng)中滴加L-薄荷醇溶液(1.0g(6.4mmol)溶解在10mL甲苯中)。滴加完成后，反應(yīng)變?yōu)榘咨珴{狀物，攪拌1小時(shí)后，向反應(yīng)中加入30mL水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(2x 30mL)萃取。收集合并有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到1.1g無(wú)色液體(粗品)，收率84％。粗產(chǎn)物氯甲酸L-薄荷酯不純化，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟二：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和173.5mg(1.7mmol)三乙胺溶解在4mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加281.2mg(1.3mmol)氯甲酸L-薄荷酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)，加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)♂屵^(guò)的反應(yīng)液用水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝20/1–3/1)得到190.0mg無(wú)色油狀物。將該油狀物溶解于0℃的2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，用油泵濃縮后得到泡狀固體，向該固體中加入2mL甲基叔丁基醚打漿4小時(shí)，過(guò)濾干燥得到190.0mg白色固體，為產(chǎn)物鹽酸鹽形式，收率49％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.54-7.45(m,1H),7.42-7.33(m,1H),7.15-7.02(m,2H),4.65-4.55(m,1H),3.77(br.s.,1H),3.57(d,J＝14.0Hz,1H),3.34-3.11(m,2H),2.90(s,3H),2.31(d,J＝10.0Hz,1H),2.12(d,J＝6.0Hz,1H),2.00-1.32(m,13H),1.15-1.01(m,2H),0.88(t,J＝6.2Hz,6H),0.78(d,J＝6.4Hz,3H),0.54(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(ESI):416.4[M+1]⁺。

實(shí)施例10制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10208)

該化合物XW10208即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚(4-甲基)芐基碳酸酯。

步驟一：

2.9g(9.8mmol)三光氣溶于20mL甲苯中，形成均相溶液。將該溶液冷卻至0℃，緩慢滴加971.2g(12.3mmol)吡啶，形成黃色漿狀物。保持反應(yīng)溫度為0℃攪拌0.5小時(shí)后，向反應(yīng)中滴加4-甲基芐醇溶液(1.0g(6.4mmol)溶解在10mL甲苯中)。滴加完成后，反應(yīng)變?yōu)榘咨珴{狀物，攪拌1小時(shí)后，向反應(yīng)中加入30mL水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(2x 30mL)萃取。收集合并有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到1.3g無(wú)色液體(粗品)，收率87％。粗產(chǎn)物氯甲酸4-甲基芐酯不純化，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟二：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和104.1mg(1.0mmol)三乙胺溶解在4mL二氯甲烷中，形成均相溶液。用冰水浴將溶液冷卻至0℃，滴加174.1mg(0.9mmol)氯甲酸4-甲基芐酯。反應(yīng)液自然升溫至25℃后攪拌3小時(shí)，加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)♂屵^(guò)的反應(yīng)液用水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝20/1–1/1)得到150.0mg淡黃色油狀物。將該油狀物溶解于0℃的2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，并在25℃攪拌16小時(shí)，用油泵濃縮后得到粘稠油狀物，向該固體中加入2mL甲基叔丁基醚打漿4小時(shí)，過(guò)濾干燥得到150.0mg白色固體，為產(chǎn)品鹽酸鹽形式，收率42％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.48(t,J＝7.2Hz,1H),7.42-7.28(m,3H),7.26-7.01(m,4H),5.21(s,2H),3.73(br.s.,1H),3.55(d,J＝14.0Hz,1H),3.30-3.10(m,2H),2.84(s,3H),2.41-2.31(m,1H),2.28(s,3H),1.95-1.76(m,3H),1.74-1.43(m,4H),0.51(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):382.3[M+1]⁺。

實(shí)施例11制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10210)

該化合物XW10210即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚(N-甲基)-4-哌啶基基碳酸酯。

127.2mg(0.4mmol)三光氣溶于4mL二氯甲烷中，形成均相溶液，冷卻至0℃，滴加148.1mg(1.3mmol)N-甲基哌啶-4-醇和130mg(1.3mmol)三乙胺在10mL二氯甲烷中的混合溶液。保持反應(yīng)溫度在0℃，攪拌0.5小時(shí)后，向反應(yīng)中一次性加入0.2g(0.8mmol)左旋美普他酚固體，自然升溫至25℃攪拌16小時(shí)后。加入4mL二氯甲烷稀釋?zhuān)♂屵^(guò)的反應(yīng)液用10mL飽和碳酸氫鈉溶液洗。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到黃色油狀物，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10/1–1/1，0.5％三乙胺)得到淡黃色油狀物。將該油狀物溶解于0℃的2mL鹽酸乙酸乙酯(濃度約2M)，得到白色漿狀物，過(guò)濾干燥得到210.0mg白色固體，為產(chǎn)物的鹽酸鹽形式，收率55％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.64-7.53(m,1H),7.45(d,J＝7.6Hz,1H),7.39-7.31(m,1H),7.27-7.17(m,1H),5.16(br.s.,1H),5.06-4.92(m,1H),3.88(d,J＝14.4Hz,1H),3.74-3.58(m,2H),3.53-3.46(m,1H),3.40-3.11(m,4H),3.02-2.86(m,5H),2.61-2.39(m,2H),2.31(d,J＝15.6Hz,1H),2.20-2.11(m,1H),2.10-1.75(m,5H),1.74-1.49(m,3H),0.60(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):375.0[M+1]⁺。

實(shí)施例12制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10212)

該化合物XW10212即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-N-乙氧酰基-L-纈氨酸酯。

步驟一：

1.0g(8.5mmol)L-纈氨酸和3.1g(22.2mmol)碳酸鉀溶于10mL水中，將該溶液冷卻至0℃后，滴加1.2g(11.1mmol)乙基氯甲酸酯。反應(yīng)升溫至25℃攪拌16小時(shí)后，用乙酸乙酯(2x 20mL)洗，水相在冰浴中用冷的濃鹽酸調(diào)pH＝2。乙酸乙酯(2x 30mL)萃取。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到1.5g(60％)N-乙氧?；?L-纈氨酸，無(wú)色油狀物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝5.12(d,J＝9.2Hz,1H),4.33(dd,J＝4.6,8.8Hz,1H),4.14(q,J＝7.2Hz,2H),2.32-2.11(m,1H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H),1.01(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.2Hz,3H)。

步驟二：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和174.8mg(0.9mmol)N-乙氧?；?L-纈氨酸溶于4mL二氯甲烷中，向該溶液中加入212.2mg(1.0mmol)DCC和5mg DMAP，形成白色漿狀物，25℃下攪拌16小時(shí)后過(guò)濾。過(guò)濾后的反應(yīng)液加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)蔑柡吐然@溶液(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、旋干得到淡黃色油狀物，酸性制備分離后得到0.2g左旋美普他酚-N-乙氧酰基-L-纈氨酸酯鹽酸鹽，白色固體，收率53％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.55(t,J＝7.8Hz,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.17-7.06(m,2H),4.33(d,J＝5.2Hz,1H),4.12(q,J＝6.8Hz,2H),3.84(d,J＝16.0Hz,1H),3.61(d,J＝13.6Hz,1H),3.21(t,J＝6.0Hz,2H),2.85(s,3H),2.50-2.29(m,2H),1.98-1.49(m,7H),1.22(t,J＝7.0Hz,3H),1.05(dd,J＝7.0,10.4Hz,6H),0.56(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):405.2[M+1]⁺。

實(shí)施例13制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10216)

該化合物XW10216即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-N-異丙氧酰基-L-纈氨酸酯。

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和191.6mg(0.9mmol)N-異丙氧?；?L-纈氨酸溶于4mL二氯甲烷中，向該溶液中加入212.2mg(1.0mmol)DCC和5mg DMAP，形成白色漿狀物，25℃下攪拌16小時(shí)后過(guò)濾。過(guò)濾后的反應(yīng)液加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)蔑柡吐然@溶液(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、旋干得到淡黃色油狀物，酸性制備分離后得到0.2g左旋美普他酚-N-異丙氧?；?L-纈氨酸酯鹽酸鹽，白色固體，收率51％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.58(t,J＝8.0Hz,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),7.19-7.09(m,2H),4.94-4.84(m,1H),4.33(d,J＝5.6Hz,1H),3.87(d,J＝14.8Hz,1H),3.63(d,J＝14.0Hz,1H),3.32-3.15(m,2H),2.88(s,3H),2.47-2.25(m,2H),2.02-1.55(m,7H),1.37-1.17(m,6H),1.08(dd,J＝7.0,10.6Hz,6H),0.59(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):419.3[M+1]⁺。

實(shí)施例14制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10243)

該化合物XW10243即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-2-乙酰氧基異丁酸酯。

0.3g(1.3mmol)左旋美普他酚和156.1mg(1.5mmol)三乙胺溶于4mL二氯甲烷中形成均相溶液，將反應(yīng)液冷卻至0℃后滴加232.8mg(1.4mmol)2-乙酰氧基異丁酰氯，攪拌16小時(shí)后加入10mL二氯甲烷稀釋反應(yīng)液，鹽水(2x 8mL)洗。收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到半固體，酸性制備純化后得到70mg左旋美普他酚-2-乙酰氧基異丁酸酯鹽酸鹽，無(wú)色油狀物，收率14％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.15-7.04(m,2H),3.85(d,J＝14.4Hz,1H),3.62(d,J＝14.0Hz,1H),3.22(t,J＝5.8Hz,2H),2.86(s,3H),2.44(dd,J＝5.6,14.8Hz,1H),2.16(s,3H),1.99-1.76(m,4H),1.70(s,6H),1.64-1.54(m,3H),0.57(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):362.5[M+1]⁺。

實(shí)施例15制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10245)

該化合物XW10245即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-N-乙?；“彼狨ァ?/p>

步驟一：

0.2g(0.86mmol)左旋美普他酚和178.4mg(0.9mmol)N-Boc-肌氨酸溶于4mL二氯甲烷中，向該溶液中加入212.2mg(1.0mmol)DCC和5mg DMAP，形成白色漿狀物，25℃下攪拌16小時(shí)后過(guò)濾。過(guò)濾后的反應(yīng)液加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)蔑柡吐然@溶液(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、旋干得到淡黃色油狀物，制備分離后得到250.0mg左旋美普他酚-N-Boc-肌氨酸酯，淡黃色油狀物，收率72％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.38-7.32(m,1H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H),7.04(s,1H),6.98(t,J＝7.4Hz,1H),4.23(s,1H),4.13(s,1H),3.16(t,J＝14.0Hz,1H),3.02(d,J＝11.2Hz,3H),2.98-2.79(m,2H),2.59(d,J＝15.2Hz,3H),2.72-2.53(m,1H),2.33-2.18(m,1H),1.94-1.66(m,6H),1.64-1.54(m,1H),1.48(d,J＝5.6Hz,9H),0.60(dt,J＝2.6,7.0Hz,3H)。

步驟二：

250.0mg(0.6mmol)左旋美普他酚-N-Boc-肌氨酸酯溶于4mL二氯甲烷中，冷卻至0℃，加入1mL三氟乙酸，反應(yīng)自然升溫至25℃攪拌2小時(shí)。用油泵濃縮除去二氯甲烷和三氟乙酸得到棕色油狀物，加入4mL二氯甲烷和187.6mg(1.8mmol)三乙胺，形成棕色溶液。將該溶液冷去至0℃，滴加58.2mg(0.7mmol)乙酰氯，升溫至25℃反應(yīng)16小時(shí)。加入如10mL二氯甲烷稀釋后，飽和食鹽水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，酸性制備分離后得到90mg左旋美普他酚-N-乙?；“彼狨}酸鹽，淡黃色粘稠油狀物，收率38％。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.53(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),7.29(s,1H),7.18-7.09(m,1H),4.39(s,2H),3.95(d,J＝14.4Hz,1H),3.57(d,J＝14.4Hz,1H),3.22(s,3H),3.27-3.18(m,1H),3.04-2.90(m,3H),2.49-2.36(m,1H),2.23-2.08(m,3H),2.01-1.56(m,7H),1.31(t,J＝7.2Hz,1H),0.63(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):347.0[M+1]⁺。

實(shí)施例16制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10260)

該化合物XW10260即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-N-異丁?；“彼狨ァ?/p>

250.0mg(0.6mmol)左旋美普他酚-N-Boc-肌氨酸酯溶于4mL二氯甲烷中，冷卻至0℃，加入1mL三氟乙酸，反應(yīng)自然升溫至25℃攪拌2小時(shí)。用油泵濃縮除去二氯甲烷和三氟乙酸得到棕色油狀物，加入4mL二氯甲烷和187.6mg(1.9mmol)三乙胺，形成棕色溶液。將該溶液冷去至0℃，滴加74.2mg(0.7mmol)異丁酰氯，升溫至25℃反應(yīng)16小時(shí)。加入10mL二氯甲烷稀釋后，鹽水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，酸性制備分離后得到120.0mg左旋美普他酚-N-異丁?；“彼狨}酸鹽，收率49％，白色泡狀固體。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.57-7.46(m,1H),7.42-7.21(m,2H),7.12(d,J＝8.0Hz,1H),4.36(s,2H),4.02-3.84(m,1H),3.58(d,J＝14.0Hz,1H),3.26(s,3H),3.30-3.17(m,1H),2.93(s,3H),3.16-2.74(m,2H),2.52-2.35(m,1H),2.06-1.52(m,7H),1.13(d,J＝6.4Hz,6H),0.63(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):375.2[M+1]⁺。

實(shí)施例17制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10258)

該化合物XW10258即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-N-異丁酰基-L-丙氨酸酯。

步驟一：

0.2g(0.8mmol)左旋美普他酚和178.4mg(0.9mmol)N-Boc-L-丙氨酸溶于4mL二氯甲烷中，向該溶液中加入212.2mg(1.0mmol)DCC和5mg DMAP，形成白色漿狀物，25℃下攪拌16小時(shí)后過(guò)濾。過(guò)濾后的反應(yīng)液加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)蔑柡吐然@溶液(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、旋干得到淡黃色油狀物，中性制備分離后得到250.0mg左旋美普他酚-N-Boc-L-丙氨酸酯，收率72％，淡黃色油狀物。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.54(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(s,1H),7.11(d,J＝8.0Hz,1H),4.34(q,J＝7.2Hz,1H),3.94(d,J＝14.4Hz,1H),3.58(d,J＝14.4Hz,1H),3.24(t,J＝6.2Hz,2H),2.93(s,3H),2.45-2.40(m,1H),2.08-1.66(m,6H),1.62-1.57(m,1H),1.52(d,J＝7.2Hz,3H),1.46(s,9H),0.63(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):405.2[M+1]⁺。

步驟二：

250.0mg(0.6mmol)左旋美普他酚-N-Boc-L-丙氨酸酯溶于4mL二氯甲烷中，冷卻至0℃，加入1mL三氟乙酸，反應(yīng)自然升溫至25℃攪拌2小時(shí)。用油泵濃縮除去二氯甲烷和三氟乙酸得到棕色油狀物，加入4mL二氯甲烷和187.6mg(1.9mmol)三乙胺，形成棕色溶液。將該溶液冷去至0℃，滴加74.2mg(0.7mmol)異丁酰氯，升溫至25℃反應(yīng)16小時(shí)。加入如10mL二氯甲烷稀釋后，鹽水(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、濃縮得到類(lèi)白色油狀物，酸性制備分離后得到120.0mg左旋美普他酚-N-異丁酰基-L-丙氨酸酯鹽酸鹽，收率47％，白色泡狀固體。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.55-7.45(m,1H),7.41-7.31(m,1H),7.23(s,1H),7.09(d,J＝6.4Hz,1H),4.51(q,J＝7.2Hz,1H),3.95(d,J＝12.0Hz,1H),3.57(d,J＝13.6Hz,1H),3.27-3.17(m,2H),2.93(s,3H),2.58-2.51(m,1H),2.47-2.38(m,1H),2.00-1.60(m,7H),1.56(d,J＝7.6Hz,3H),1.14(dd,J＝2.8,6.8Hz,6H),0.63(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):375.1[M+1]⁺。

實(shí)施例18制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10271)

該化合物XW10271即為左旋美普他酚前藥分子：(N-(S)-美普他酚氧?；?-L-丙氨酰-L-脯氨酸。

步驟一：

2.0g(9.3mmol)N-Boc-L-脯氨酸，2.0g(18.6mmol)芐醇，3.6g(18.6mmol)EDCI和113.5mg(0.9mmol)DMAP溶于40mL二氯甲烷中，形成漿狀液。向漿狀液中滴加4.8g(37.2mmol)N,N-二異丙基乙胺。滴加完成后，在25℃反應(yīng)16小時(shí)，加入40mL二氯甲烷稀釋?zhuān)来斡美涞?M稀鹽酸(2x 80mL)，水(100mL)和鹽水(2x 50mL)洗。有機(jī)相干燥，過(guò)濾，濃縮得到油狀物，過(guò)柱分離(石油醚/乙酸乙酯＝10/1-1/1)得到1.3g N-Boc-L-脯氨酸芐酯，收率46％，為無(wú)色油狀物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.43-7.28(m,5H),5.31-5.03(m,2H),4.38(dd,J＝3.2,8.6Hz,0.4H),4.26(dd,J＝3.8,8.6Hz,0.6H),3.64-3.31(m,2H),2.29-2.11(m,1H),2.05-1.79(m,3H),1.46(s,3H),1.34(s,6H)。

步驟二：

1.3g(4.3mmol)N-Boc-L-脯氨酸芐酯溶解于20mL二氯甲烷中，形成透明溶液，向該溶液中加入2mL三氟乙酸。在25℃反應(yīng)3小時(shí)后，濃縮除去二氯甲烷和三氟乙酸得到1.5g L-脯氨酸芐酯三氟乙酸鹽粗品，為淡黃色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟三：

0.8g(4.2mmol)N-Boc-L-丙氨酸，1.5g(4.7mmol)L-脯氨酸芐酯三氟乙酸鹽粗品和1.9g(5.1mmol)HATU溶于40mL二氯甲烷中形成漿狀物，向該漿狀物中滴加1.3g(10.5mmol)N,N-二異丙基乙胺。滴加完成后，在25℃反應(yīng)16小時(shí)，加入20mL二氯甲烷稀釋?zhuān)来斡美涞?M稀鹽酸(2x 50mL)，水(50mL)和鹽水(2x 30mL)洗。有機(jī)相干燥，過(guò)濾，濃縮得到油狀物，過(guò)柱分離(石油醚/乙酸乙酯＝10/1-1/1)得到1.3g(82％)N-Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯，無(wú)色油狀物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.43-7.28(m,5H),5.20(d,J＝12.4Hz,1H),5.10(d,J＝12.4Hz,1H),4.65-4.55(m,1H),4.52-4.38(m,1H),3.77-3.65(m,1H),3.65-3.53(m,1H),2.27-2.15(m,1H),2.06-1.94(m,3H),1.42(s,9H),1.29(d,J＝6.8Hz,3H)。

步驟四：

445.0mg(1.2mmol)N-Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯溶解于4mL二氯甲烷中，形成透明溶液，向該溶液中加入1mL三氟乙酸。在25℃反應(yīng)3小時(shí)后，濃縮除去二氯甲烷和三氟乙酸得到0.5g L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯三氟乙酸鹽粗品，淡黃色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。

步驟五：

250.0mg(1.1mmol)左旋美普他酚分散于4mL二氯甲烷中，形成漿狀液，向該漿狀液中加入191.2mg(1.2mmol)CDI。反應(yīng)加熱回流48小時(shí)后形成均相澄清溶液，向反應(yīng)中加入0.5g(1.2mmol)L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯三氟乙酸鹽粗品后形成漿狀液，25℃反應(yīng)16小時(shí)后加入6mL二氯甲烷稀釋?zhuān)来斡蔑柡褪雏}水(2x 5mL)，水(5mL)洗。收集有機(jī)相，干燥，濃縮得到半固體物質(zhì)，制備分離得到220.0mg(38％)(N-(S)-美普他酚氧酰基)-L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯，白色固體。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.49(t,J＝8.0Hz,1H),7.44-7.27(m,6H),7.26-7.16(m,1H),7.14-7.04(m,1H),5.20-5.12(m,2H),4.58-4.40(m,2H),3.92(d,J＝14.4Hz,1H),3.83-3.73(m,1H),3.71-3.54(m,2H),3.24(t,J＝6.0Hz,2H),2.91(s,3H),2.50-2.39(m,1H),2.30-2.22(m,1H),2.11-1.78(m,7H),1.76-1.50(m,3H),1.35(d,J＝7.2Hz,3H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。

步驟六：

220.0mg(0.4mmol)(N-(S)-美普他酚氧?；?-L-丙氨酰-L-脯氨酸芐酯溶于4mL甲醇，形成均相溶液，加入20.0mg鈀碳，形成黑色漿狀液。在25℃加氫反應(yīng)2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮，中性制備分離得到90.0mg(N-(S)-美普他酚氧?；?-L-丙氨酰-L-脯氨酸，收率49％，為類(lèi)白色粉末狀固體。

¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ＝7.50(t,J＝8.1Hz,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(s,1H),7.10(dd,J＝1.6,8.1Hz,1H),4.51(q,J＝7.2Hz,1H),4.46(dd,J＝4.3,8.7Hz,1H),3.93(d,J＝13.8Hz,1H),3.83-3.75(m,1H),3.72-3.56(m,2H),3.25(t,J＝6.0Hz,2H),2.92(s,3H),2.44(dd,J＝6.0,14.4Hz,1H),2.30-2.21(m,1H),2.12-1.81(m,7H),1.76-1.67(m,1H),1.67-1.52(m,2H),1.43(d,J＝6.6Hz,3H),0.62(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(ESI):446.3[M+1]⁺。

實(shí)施例19制備左旋美普他酚前藥分子(化合物XW10275)

該化合物XW10275即為左旋美普他酚前藥分子：左旋美普他酚-1,1’-二羥基異丁酸酯。

步驟一：

0.2g(0.8mmol)左旋美普他酚和164.8mg(1.0mmol)5-甲酸基-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)溶于4mL二氯甲烷中，向該溶液中加入212.2mg(1.0mmol)DCC和5mg DMAP，形成白色漿狀物，25℃下攪拌16小時(shí)后過(guò)濾。過(guò)濾后的反應(yīng)液加入10mL二氯甲烷稀釋?zhuān)蔑柡吐然@溶液(2x 5mL)洗，收集有機(jī)相，干燥、過(guò)濾、旋干得到淡黃色油狀物，制備分離后得到150.0mg(S)-美普他酚-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)基-5-甲酸酯，收率47％，為白色固體。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.31(d,J＝8.0,1H),7.19(d,J＝7.6Hz,1H),7.00(s,1H),6.90(dd,J＝1.2,8.0Hz,1H),4.26-4.16(m,4H),3.09-3.02(m,1H),2.85(d,J＝14.0Hz,1H),2.60-2.45(m,3H),2.39(s,3H),2.10(dd,J＝8.0,14.4Hz,1H),1.77-1.59(m,6H),1.58-1.37(m,1H),1.49(s,3H),1.46(s,3H),0.59(t,J＝7.6Hz,3H)。

步驟二：

30.0mg(0.08mmol)左旋美普他酚-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)基-5-甲酸酯溶于1mL乙腈和1mL水中，加入濃鹽酸調(diào)pH為1，在25℃反應(yīng)1.5小時(shí)后，加入碳酸氫鈉調(diào)pH為6-7，濃縮去除乙腈，剩余水溶液中性條件下制備分離得到10.0mg左旋美普他酚-1,1’-二羥基異丁酸酯，收率35％，為無(wú)色粘稠膠狀物。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.52(t,J＝8.0Hz,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,1H),7.28(s,1H),7.13(d,J＝7.6Hz,1H),4.00-3.88(m,4H),3.74-3.45(m,2H),3.25(t,J＝5.8Hz,2H),3.07-2.99(m,1H),2.93(s,3H),2.43(dd,J＝6.0,14.4Hz,1H),2.06-1.81(m,4H),1.81-1.70(m,1H),1.69-1.48(m,2H),0.63(t,J＝7.4Hz,3H)；MS(ESI):336.0。

實(shí)施例20前藥分子體外化學(xué)穩(wěn)定性測(cè)試

1、測(cè)試前藥分子在緩沖液中的化學(xué)穩(wěn)定性

配制pH分別為1.2、6.5、7.4和8.0的緩沖液，具體如下：

pH 1.2緩沖液：取765μL濃鹽酸，加水稀釋至100mL，即得；pH 6.5磷酸緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加1mol/L氫氧化鈉溶液15.2mL，用水稀釋至1L，即得；pH 7.4磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加1mol/L氫氧化鈉溶液39.5mL，用水稀釋至1L，即得；pH 8.0磷酸緩沖液：取2.722g磷酸二氫鉀溶于水，并稀釋至100mL，得溶液A；取0.8g氫氧化鈉溶于水，并稀釋至100mL，得溶液B；將以上25mL溶液A和23.05mL溶液B進(jìn)行混合，并以水稀釋至100mL，即得。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施如下：

將緩沖液于37℃預(yù)熱3分鐘。在1.0mL緩沖液中加入0.1mL的0.1mg/mL反應(yīng)液(分別針對(duì)實(shí)施例制備獲得的所示化合物)。將樣品置于37℃孵育，分別在反應(yīng)0、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)及4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)取樣分析，采用LC-MS檢測(cè)以上化合物原形的剩余含量。均采取平行樣品分析。

結(jié)果見(jiàn)表1。由表1所示的結(jié)果可知，所示化合物在pH 1.2、6.5、7.4和8.0的緩沖液中孵化2-4小時(shí)中呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。

2、測(cè)試前藥分子在人工胃液中的穩(wěn)定性

人工胃液配置：將0.04g氯化鈉和0.06g胃蛋白酶溶解于0.14mL濃鹽酸中，加水稀釋至20mL。pH值測(cè)定為1.20±0.05。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施如下：從200μM的工作液(儲(chǔ)備液用DMSO溶解配置，后以50％乙腈/水稀釋)中吸取4μL加到96深孔板中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(T0，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，24小時(shí))做一塊板，每次做兩個(gè)平行(復(fù)孔)。除了T0點(diǎn)，其它時(shí)間點(diǎn)的深孔板中加入4μL受試藥物工作液后，加入人工胃液396μL，得到終濃度為2μM的孵育濃度，且有機(jī)相DMSO與乙腈的濃度為0.2％與0.45％。在37℃培養(yǎng)箱中以300轉(zhuǎn)/分鐘孵育樣品至相應(yīng)的時(shí)間。受試藥物在相應(yīng)的孵育時(shí)間(T0，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，24小時(shí))結(jié)束后，立即加入含有200ng/mL甲磺丁脲和拉貝洛爾(內(nèi)標(biāo))的冰乙腈800μL混合均勻。從以上各孔中取出100μL液體加到96深孔板中，再次加入含有200ng/mL甲磺丁脲和拉貝洛爾(內(nèi)標(biāo))的乙腈200μL混合均勻。

T0點(diǎn)準(zhǔn)備：深孔板中加入4μL受試藥物工作液后，先加入含有200ng/mL甲磺丁脲和拉貝洛爾(內(nèi)標(biāo))的乙腈800μL終止反應(yīng)，再加入人工胃液396μL混合均勻后，從中取出100μL液體加入含有200ng/mL甲磺丁脲和拉貝洛爾(內(nèi)標(biāo))的乙腈200μL混合均勻。

將96深孔板置于4℃離心機(jī)中，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心后取上清液60μL加入180μL水混合均勻后，用LC/MS/MS進(jìn)行樣品分析。

結(jié)果見(jiàn)表1。由上述結(jié)果可知，所示化合物在人工胃液中孵化24小時(shí)，均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。

表1顯示了前述實(shí)施例制備的左旋美普他酚前藥分子在緩沖液、人工胃液中穩(wěn)定性的部分結(jié)果。

表1

實(shí)施例21受試化合物的代謝穩(wěn)定性測(cè)定

1.大鼠/人肝臟S9組分代謝穩(wěn)定性測(cè)定

使用大鼠/人肝臟S9組分代謝穩(wěn)定性測(cè)定方案來(lái)確定前述實(shí)施例制備的本發(fā)明的左旋美普他酚前藥分子在體外從前藥向左旋美普他酚轉(zhuǎn)化的釋放效能。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施如下：

在360μL的Tris緩沖液(pH 7.4)中加入40μL的500μM分析液(分別針對(duì)實(shí)施例制備獲得的化合物)，使其終濃度為50μM。分別取20μL上述反應(yīng)液若干份，往其中加入100μL的S9溶液(蛋白含量1mg/mL)，37℃水浴預(yù)熱10min，然后加入80μL 1.3mM NADP啟動(dòng)反應(yīng)。于0、5、10、20、30、60min時(shí)間點(diǎn)往每份樣品分別加入600μL的冰乙腈終止溶液(含內(nèi)標(biāo)物甲苯磺丁脲、拉貝洛爾、普萘洛爾和膽堿各200ng/mL)和中渦旋混合終止反應(yīng)，4℃，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清進(jìn)樣。每個(gè)樣品平行兩份，采用LC-MS/MS方法檢測(cè)以上化合物原形的剩余含量以及母藥的生成含量。

結(jié)果表明(見(jiàn)表2)：使用大鼠/人肝臟S9組分進(jìn)行的體外左旋美普他酚釋放效能測(cè)定顯示前藥化合物能夠有效代謝。其中大鼠S9母藥生成率較低，與左旋美普他酚自身可被大鼠S9繼續(xù)代謝相關(guān)。在人肝臟S9組分代謝實(shí)驗(yàn)中，前藥被迅速代謝且有效釋放左旋美普他酚。

2.大鼠/人全血代謝穩(wěn)定性測(cè)試

使用大鼠/人全血代謝穩(wěn)定性測(cè)定方案以確定本申請(qǐng)化合物在體外從前藥向母藥轉(zhuǎn)化的釋放效能。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施如下：

將2μL 250μM的受試化合物工作溶液摻入98μL全血中以使其終濃度為5μM。在37℃水浴中在約60轉(zhuǎn)/分鐘下孵育反應(yīng)樣品。在0、10、30、60和120分鐘，從反應(yīng)樣品中各取出100μL，通過(guò)加入100μL超純水以及600μL冰乙腈(含內(nèi)參物200ng/mL甲苯磺丁脲、20ng/mL拉貝洛爾)終止反應(yīng)。將所有樣品渦旋10分鐘，隨后在4000rpm離心10分鐘以沉淀蛋白。將100μL上清液轉(zhuǎn)移至新板中。使用200μL超純水稀釋上清液，隨后在800轉(zhuǎn)/分鐘搖勻10分鐘。使用LC/MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行分析以檢測(cè)受試化合物剩余量和左旋美普他酚生成效率。

結(jié)果表明(見(jiàn)表2)：使用大鼠/人全血進(jìn)行的體外左旋美普他酚釋放效能測(cè)定顯示前藥化合物能夠以多種釋放效率轉(zhuǎn)化成母藥，這表明在向大鼠/人施用前藥化合物后，其可在系統(tǒng)循環(huán)中被轉(zhuǎn)化成左旋美普他酚。

其中，部分化合物的體外酶代謝穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2：

表2

實(shí)施例22評(píng)價(jià)左旋美普他酚對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎(Spinal Nerve Ligation,SNL)SD大鼠模型的藥效作用

SNL模型是針對(duì)神經(jīng)性疼痛評(píng)估的常用動(dòng)物模型。本試驗(yàn)的目的是評(píng)估左旋美普他酚減輕SNL大鼠機(jī)械痛覺(jué)超敏的效用。

實(shí)驗(yàn)組：

試驗(yàn)步驟：

SNL模型建立：

1)將各組藥品根據(jù)不同給藥需求以生理鹽水作為溶媒對(duì)應(yīng)配置。

2)手術(shù)前，將所有涉及器皿進(jìn)行消毒無(wú)菌處理。

3)所有動(dòng)物均以戊巴比妥(50mg/kg，腹腔注射)進(jìn)行麻醉。手術(shù)切口前，擠壓動(dòng)物腳趾以確認(rèn)動(dòng)物手術(shù)前已經(jīng)完全麻醉。在動(dòng)物眼部涂抹眼用軟膏以防止動(dòng)物角膜干燥。

4)剃去動(dòng)物下半身手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，使用碘伏和70％乙醇對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚消毒三遍。待皮膚干燥后開(kāi)始手術(shù)。

5)使用手術(shù)刀在動(dòng)物腰部薦骨后部開(kāi)一縱向切口，暴露左側(cè)椎旁肌，使用撐開(kāi)器分離肌肉組織以暴露脊椎骨。

6)分離左側(cè)L5和L6脊神經(jīng)，以6-0絲線(xiàn)緊密結(jié)扎。對(duì)傷口進(jìn)行封閉，同時(shí)對(duì)皮膚進(jìn)行縫合處理。

7)手術(shù)后將動(dòng)物放置在電熱毯上，皮下注射5mL生理鹽水以防止脫水。等動(dòng)物完全蘇醒后(可自由活動(dòng))將動(dòng)物放回籠中。

1、機(jī)械痛覺(jué)超敏測(cè)試

1)將大鼠單獨(dú)放置在有機(jī)玻璃盒中，盒子底部為網(wǎng)格以保證大鼠腳部可以測(cè)試。在測(cè)試前大鼠將適應(yīng)15分鐘。

2)適應(yīng)完成后，使用測(cè)試?yán)w維在大鼠后腳中部測(cè)試。測(cè)試?yán)w維包括8個(gè)測(cè)試強(qiáng)度：3.61(0.4g)，3.84(0.6g)，4.08(1g)，4.31(2g)，4.56(4g)，4.74(6g)，4.93(8g)，5.18(15g)。測(cè)試時(shí)，將測(cè)試?yán)w維垂直壓向皮膚并施力使纖維彎曲6-8秒，每次測(cè)試間隔5秒。測(cè)試時(shí)，動(dòng)物迅速縮腳被記為疼痛反應(yīng)。測(cè)試?yán)w維離開(kāi)動(dòng)物皮膚時(shí)動(dòng)物縮腳也被記為疼痛反應(yīng)。如果動(dòng)物移動(dòng)或走動(dòng)，不記疼痛反應(yīng)，應(yīng)重復(fù)測(cè)試。

3)測(cè)試時(shí)首先使用4.31(2g)，如果動(dòng)物有疼痛反應(yīng)，下一次測(cè)試使用力度小一級(jí)的測(cè)試?yán)w維；如果動(dòng)物沒(méi)有疼痛反應(yīng)，下一次測(cè)試使用力度大一級(jí)的測(cè)試?yán)w維(Chaplan et al.,J Neurosci Methods 53:55-63,1994)。測(cè)試?yán)w維的最大力度為5.18(15g)。

測(cè)試結(jié)果記錄在圖1-2所示的表格中，有疼痛反應(yīng)記錄x，沒(méi)有疼痛反應(yīng)記錄o。其中，如圖1-2所示，表現(xiàn)出機(jī)械痛覺(jué)超敏閾值<4g，沒(méi)有表現(xiàn)出機(jī)械痛覺(jué)超敏＝15g。

其中，機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏使用如下公式計(jì)算：

50％反應(yīng)閾值(g)＝(10^(Xf+kδ))/10,000，

其中，Xf＝測(cè)試中使用的最終測(cè)試?yán)w維值，k＝表值，δ＝平均差。

2、適應(yīng)動(dòng)物和機(jī)械痛覺(jué)超敏基線(xiàn)測(cè)試

手術(shù)10天后將動(dòng)物放在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)15分鐘，連續(xù)在測(cè)試環(huán)境中適應(yīng)三天。給藥前一天(手術(shù)13天后)，進(jìn)行機(jī)械痛覺(jué)超敏基線(xiàn)測(cè)試，將沒(méi)有表現(xiàn)出機(jī)械痛覺(jué)超敏的動(dòng)物(縮腳閾值大于5)的動(dòng)物剔除后隨機(jī)分組。

給藥：根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排的時(shí)間給藥。

依據(jù)數(shù)據(jù)分析，該SNL模型試驗(yàn)結(jié)論如下：在5毫克/千克、10毫克/千克及20毫克/千克不同劑量下，左旋美普他酚在0.5小時(shí)及1小時(shí)給藥后，都實(shí)現(xiàn)了SNL導(dǎo)致的機(jī)械痛覺(jué)超敏反轉(zhuǎn)。

不同劑量、不同時(shí)間點(diǎn)下，左旋美普他酚抗痛覺(jué)超敏效果對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖3。

如圖3所示，*p<0.05，***p<0.001是化合物與溶劑組比較；#p<0.05，##p<0.01是化合物與左旋美普他酚(5mg/kg 0.5h)比較；^p<0.05，^^p<0.01是化合物與左旋美普他酚(5mg/kg 1h)比較，均使用單因素方差分析附加Dunnett多重比較檢驗(yàn)；％顯示每組的機(jī)械痛覺(jué)超敏的抑制率。

其中，機(jī)械痛覺(jué)超敏的抑制率＝(溶劑組的平均值-給藥組的值)/(溶劑組組的平均值-15)*100％。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。