本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用橫切花生種子為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生轉(zhuǎn)基因的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物的遺傳轉(zhuǎn)化是植物學(xué)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，是研究基因功能和應(yīng)用的基礎(chǔ)技術(shù)手段。特別是作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行作物遺傳改良的有效手段，也一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)?？焖佟⒑啽愕墨@得轉(zhuǎn)基因作物是大量獲得轉(zhuǎn)基因群體的前提，也是開展作物轉(zhuǎn)基因育種的基礎(chǔ)。

花生(Arachis hypogaea L.)是雙子葉植物，是一種重要的油料兼食作物的經(jīng)濟(jì)作物，在世界上廣泛種植。其產(chǎn)油量為油料作物總產(chǎn)的50％，也具有豐富的蛋白質(zhì)。和其它作物相比，花生的轉(zhuǎn)基因研究嚴(yán)重滯后。主要原因一是花生和其它豆科植物一樣，在遺傳轉(zhuǎn)化上相對比較困難；二是花生屬于四倍體，遺傳背景復(fù)雜。上世紀(jì)90年代才有轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道，近年來隨著研究的逐漸深入，通過農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法都可以獲得轉(zhuǎn)基因花生植株。但是這些方法都是建立在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，操作步驟又相對復(fù)雜，轉(zhuǎn)化的效率也不高，成本高，對操作人員和環(huán)境的要求也十分苛刻，很難適應(yīng)大規(guī)模花生轉(zhuǎn)基因育種的開展。特別是隨著花生基因組的完成，大量功能基因的驗(yàn)證需要更為簡單有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和方法。目前也有非組織培養(yǎng)的方法成功。在“在以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法”(201110074925.7)中需要對種子進(jìn)行用蒸餾水沖洗和浸泡；然后消毒，去種皮，切開種子，取含胚的半粒種子，沿胚的子葉節(jié)點(diǎn)切去胚芽，得到外植體。該方法前期處理步驟較多。風(fēng)干的花生種皮和子葉的結(jié)合非常牢固，不容易分離開，人工花費(fèi)大而且效率低下。同時(shí)在分離半邊胚的時(shí)候往往導(dǎo)致胚受傷死亡，萌芽率顯著降低。簡便的去掉種皮，合適的受體進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化，特別是適合大規(guī)模農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染的材料有利于提高轉(zhuǎn)基因的效率，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因花生的培育和商業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，該轉(zhuǎn)基因方法取材容易、操作簡單、節(jié)約時(shí)間和成本，且轉(zhuǎn)化效率高，適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因花生的研制。

本發(fā)明的另一目的在于提供該轉(zhuǎn)基因方法在制備轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，包括以下步驟：

1)取處于對數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌，重懸于培養(yǎng)基中，得到轉(zhuǎn)化菌液；

2)取成熟的花生種子，浸泡20-30分鐘，萌發(fā)0-4天；然后在離胚根0.2-0.5cm處將所述花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，即為轉(zhuǎn)化受體；

3)將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中，侵染20-50分鐘，接著取出轉(zhuǎn)化受體，吸干表面的液體，再置于吸水紙上，于22±2℃暗培養(yǎng)3-4天，得到花生幼苗；培養(yǎng)過程中，向吸水紙上噴施含0.2mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培養(yǎng)基，使得吸水紙保持濕潤；

4)將所述花生幼苗繼續(xù)培養(yǎng)至得到花生植株，對花生植株進(jìn)行鑒定，即可確定轉(zhuǎn)基因植株。

優(yōu)選的，在步驟1)中，所述的外源基因?yàn)殡p丙酰磷抗性基因(Bar)。

優(yōu)選的，在步驟1)中，采用YEP液體培養(yǎng)基，于28℃下將含有外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，即得所述處于對數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌。

優(yōu)選的，在步驟1)中，所述培養(yǎng)基為含100-200μM的乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，在步驟1)中，將含有外源基因的農(nóng)桿菌接種于含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜，再按體積百分比1％的接種量轉(zhuǎn)接入50-800mL含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4小時(shí)至OD600為0.6，收集菌體；然后用50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，于28℃搖床上培養(yǎng)至OD600到0.6，即得轉(zhuǎn)化菌液。

優(yōu)選的，在步驟2)中，取成熟的花生種子，浸泡20-30分鐘，萌發(fā)0-4天；然后在離胚根0.2-0.5cm處將所述花生種子橫切為兩半，正好切掉胚芽，選擇含有胚根的一半，即為轉(zhuǎn)化受體。

優(yōu)選的，在步驟3)中，將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中，使得轉(zhuǎn)化菌液剛好浸沒轉(zhuǎn)化受體。

優(yōu)選的，在步驟3)中，所述侵染的時(shí)間為30-50min。

優(yōu)選的，在步驟4)中，在花生幼苗培養(yǎng)成花生植株的過程中，對花生幼苗進(jìn)行了煉苗、移栽及除草劑篩選的處理。

本發(fā)明還公開了上述利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法在制備轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明采用橫切花生種子作為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將外源基因?qū)牖ㄉ?xì)胞，直接通過細(xì)胞途徑再生出轉(zhuǎn)基因植株，整個(gè)過程只需要3個(gè)月，大大縮短了轉(zhuǎn)基因花生研制周期。同時(shí)，轉(zhuǎn)化所用的受體材料也容易得到，不受材料的限制，特別適合大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因花生的生產(chǎn)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究，有著成本低廉，效率高的特點(diǎn)。以抗草丁膦的Bar為目的基因?qū)M切花生種子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了含有Bar的抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生，證實(shí)了該方法的可行性。

2.與目前常用的轉(zhuǎn)基因方法相比較，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因方法不受材料限制，節(jié)約時(shí)間，不需要進(jìn)行組織培養(yǎng)，不需要無菌操作等苛刻的試驗(yàn)條件，也避免了花生再生體系建立的困難。本方法以橫切花生種子為外源基因受體，通過細(xì)胞途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株，和以愈傷組織等其它受體的轉(zhuǎn)基因方法相比，取材容易，也大大縮短了得到轉(zhuǎn)基因花生植株的時(shí)間，更適合大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因花生研制。同時(shí)，方法培養(yǎng)時(shí)間短，避免了長期組織培養(yǎng)過程中，外源激素導(dǎo)致變異的影響。本方法采用恒切花生種子作為轉(zhuǎn)基因受體，為獲得轉(zhuǎn)基因花生提供新方法。

3.本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因方法，轉(zhuǎn)化效率高，得到的嵌合體少；而且具有可拓展性，可以適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因花生的研制，大大減少工作量，降低研究費(fèi)用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測的電泳結(jié)果；

圖2為實(shí)施例2中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測的電泳結(jié)果；

圖3為實(shí)施例3中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測的電泳結(jié)果；

圖4為實(shí)施例4中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測的電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

以下實(shí)施例中，LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301。

實(shí)施例1

利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，包括以下步驟：

①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404：將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。

②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜，接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基中，27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5，得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。

③轉(zhuǎn)化受體的制備：取成熟的花生種子(航花2號(hào)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育)，自來水浸泡30分鐘后，用手術(shù)刀片在離胚根0.2-0.5cm處將成熟的花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，得到轉(zhuǎn)化的受體。

④農(nóng)桿菌侵染：

A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM的AS)中，30min后將轉(zhuǎn)化受體取出，中間輕緩晃動(dòng)數(shù)次。

B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干，再將其置于濕潤的吸水紙上，于22±2℃暗培養(yǎng)3天，培養(yǎng)過程中噴施含0.2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，以保持吸水紙的濕潤。

⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽：

待苗高為2-3cm時(shí)，對其進(jìn)行煉苗、移栽。待苗高為5-10cm時(shí)，采用草胺膦噴施，14天后選擇存活的植株，再對其進(jìn)行PCR檢測，如為陽性即為轉(zhuǎn)基因再生植株。

⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，采用微量法提取總DNA(王繼華，李余良，胡建廣等，一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業(yè)，2007，(6)：6-7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

B、PCR擴(kuò)增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計(jì)。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補(bǔ)ddH₂O至15μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，本實(shí)施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶，說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。

實(shí)施例2

利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，包括以下步驟：

①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404：將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。

②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜，接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基中，27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5，得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。

③轉(zhuǎn)化受體的制備：取成熟的花生種子(粵油7號(hào)，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育)，自來水浸泡20分鐘后，用手術(shù)刀片在離胚根0.2-0.5cm處將成熟的花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，得到轉(zhuǎn)化的受體。

④農(nóng)桿菌侵染：

A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM的AS)中，20min后將轉(zhuǎn)化受體取出，中間輕緩晃動(dòng)數(shù)次。

B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干，再將其置于濕潤的吸水紙上，于22±2℃暗培養(yǎng)4天，培養(yǎng)過程中噴施含0.2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，以保持吸水紙的濕潤。

⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽：

待苗高為2-3cm時(shí)，對其進(jìn)行煉苗、移栽。待苗高為5-10cm時(shí)，采用草胺膦噴施，14天后選擇存活的植株，再對其進(jìn)行PCR檢測，如為陽性即為轉(zhuǎn)基因再生植株。

⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，采用微量法提取總DNA(王繼華，李余良，胡建廣等，一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業(yè)，2007，(6)：6-7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

B、PCR擴(kuò)增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計(jì)。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補(bǔ)ddH₂O至15μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，本實(shí)施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶，說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。

實(shí)施例3

利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，包括以下步驟：

①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404：將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。

②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜，接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基中，27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5，得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。

③轉(zhuǎn)化受體的制備：取成熟的花生種子(粵油7號(hào)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育)，自來水浸泡30分鐘，萌發(fā)4天后，用手術(shù)刀片在離胚根0.2-0.5cm處將成熟的花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，得到轉(zhuǎn)化的受體。

④農(nóng)桿菌侵染：

A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM的AS)中，30min后將轉(zhuǎn)化受體取出，中間輕緩晃動(dòng)數(shù)次。

B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干，再將其置于濕潤的吸水紙上，于22±2℃暗培養(yǎng)3天，培養(yǎng)過程中噴施含0.2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，以保持吸水紙的濕潤。

⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽：

待苗高為2-3cm時(shí)，對其進(jìn)行煉苗、移栽。待苗高為5-10cm時(shí)，采用草胺膦噴施，14天后選擇存活的植株，再對其進(jìn)行PCR檢測，如為陽性即為轉(zhuǎn)基因再生植株。

⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，采用微量法提取總DNA(王繼華，李余良，胡建廣等，一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業(yè)，2007，(6)：6-7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

B、PCR擴(kuò)增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計(jì)。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補(bǔ)ddH₂O至15μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，本實(shí)施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶，說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。

實(shí)施例4

利用橫切花生種子快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法，包括以下步驟：

①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404：將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。

②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜，接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS液體培養(yǎng)基中，27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5，得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。

③轉(zhuǎn)化受體的制備：取成熟的花生種子(航花2號(hào)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育)，自來水浸泡20分鐘，萌發(fā)2天后，用手術(shù)刀片在離胚根0.2-0.5cm處將成熟的花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，得到轉(zhuǎn)化的受體。

④農(nóng)桿菌侵染：

A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM的AS)中，50min后將轉(zhuǎn)化受體取出，中間輕緩晃動(dòng)數(shù)次。

B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干，再將其置于濕潤的吸水紙上，于22±2℃暗培養(yǎng)4天，培養(yǎng)過程中噴施含0.2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，以保持吸水紙的濕潤。

⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽：

待苗高為2-3cm時(shí)，對其進(jìn)行煉苗、移栽。待苗高為5-10cm時(shí)，采用草胺膦噴施，14天后選擇存活的植株，再對其進(jìn)行PCR檢測，如為陽性即為轉(zhuǎn)基因再生植株。

⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，采用微量法提取總DNA(王繼華，李余良，胡建廣等，一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業(yè)，2007，(6)：6-7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

B、PCR擴(kuò)增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計(jì)。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補(bǔ)ddH₂O至15μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，本實(shí)施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶，說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。

圖1-圖4的結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法，可快速獲得大量的轉(zhuǎn)基因花生，說明該轉(zhuǎn)基因方法切實(shí)可行，為批量獲得轉(zhuǎn)基因花生提供了新思路。

對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。