技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明及獼猴桃種植技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法。

背景技術(shù)：

獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiacea）獼猴桃屬（Actinidia）落葉藤本果樹，其果實營養(yǎng)豐富，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及多種維生素，尤其是維生素C含量居各種水果之首。同時，獼猴桃又具有很高藥用價值，獼猴桃全株均可入藥，其根、果實等部位提取物具有抗突變、抗腫瘤、抗氧化等作用。獼猴桃在我國分布范圍很廣，北方的陜西、甘肅和河南，南方的兩廣和福建，西南的貴州、云南、四川、重慶，以及長江中下游流域的各省(區(qū))都有栽培種植。

近年來，由于獼猴桃種植面積迅速擴(kuò)大，獼猴桃細(xì)菌性潰瘍?。╧iwifruit bacterial canker）快速蔓延，在日本、美國、韓國、中國、意大利、法國、葡萄牙、西班牙、新西蘭、瑞士和智利等國家相繼被發(fā)現(xiàn)，并在報道的國家造成了嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。目前該病害已成為2005年以來獼猴桃栽培過程中最具毀滅性的危害，嚴(yán)重威脅世界獼猴桃的安全生產(chǎn)。

據(jù)有關(guān)報道，獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌在潛伏期很難發(fā)現(xiàn)，具有一定的隱蔽性，且病原菌極易隨繁殖材料和苗木遠(yuǎn)距離傳播。雖然化學(xué)和生物農(nóng)藥在防治方面有一定的效果，但是一旦在果園發(fā)生，要徹底防治就相當(dāng)難。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是一種毀滅性病害，由丁香假單孢桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidae）引起，主要為害獼猴桃的主干、枝干和葉片。到目前為止，有關(guān)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病菌鑒定的研究很多，但大多集中于病原菌的形態(tài)學(xué)和生理生化特性等傳統(tǒng)的鑒定方法。前期對病原菌的檢測主要通過癥狀、形態(tài)、生理生化反應(yīng)等方法開展，這些方法費時費力，需要對病原進(jìn)行分離純化，往往因為樣品帶菌少和分離純化過程復(fù)雜等而失敗，從而造成漏檢及疫情的逃逸、擴(kuò)散。

傳統(tǒng)的檢測方法如分離培養(yǎng)、生理生化指標(biāo)的測定、寄主癥狀觀察等都比較耗時費力，而且經(jīng)驗性強(qiáng)，不能滿足口岸檢疫快速驗放的要求，更難以標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模推廣應(yīng)用。隨著生命科學(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)的迅猛發(fā)展，血清學(xué)、分子雜交及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法、技術(shù)逐步應(yīng)用到植物病原細(xì)菌的檢測和鑒定工作中，這些方法特異性好，靈敏度高，耗時短，能夠很好地提高檢測效率。但是這些方法易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，容易對實驗室造成污染，也容易對實驗人員的身體造成傷害。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題為提供一種自動化程度高、檢測快速、靈敏度高的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、將細(xì)菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，并得到測序后的序列；

步驟二、用生物學(xué)軟件clastal X對測序后的序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進(jìn)行多重同源性比較分析，并找出獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū)；

步驟三、根據(jù)獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū)，應(yīng)用引物和探針設(shè)計軟件Prmier Express設(shè)計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針；

步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進(jìn)行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測和以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測；

步驟五、重復(fù)步驟三和步驟四直至獲得用于對獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌檢測的實時熒光PCR引物和實時熒光PCR探針。

本實發(fā)明有益效果是：通過建立基于實時熒光PCR的快速獼猴桃潰瘍病菌分子檢測技術(shù)，可以有效地防止檢測過程中的污染和假陽性結(jié)果。并且可對獼猴桃種苗、接穗、花、果實上的獼猴桃潰瘍病菌進(jìn)行微量檢測，以及帶有潛伏病菌而未表現(xiàn)癥狀的獼猴桃材料進(jìn)行有效的監(jiān)測，阻止該病害在新區(qū)的擴(kuò)散蔓延。依據(jù)獼猴桃潰瘍病菌ITS序列的多態(tài)性得到實時熒光PCR引物和探針，建立獼猴桃潰瘍病菌實時定量熒光PCR檢測體系，實現(xiàn)獼猴桃潰瘍病菌的快速、特異、靈敏、定量檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行實時定量熒光PCR的檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)的檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性，在NB液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋，通過平板計數(shù)法計算菌液原始濃度；

以連續(xù)稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性，在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

提取培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA，通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度，將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋；

以DNA各濃度梯度為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

通過注射器針刺將培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖桿上；

通過蘸有無菌水的棉花對接種后的獼猴桃植株進(jìn)行保濕，觀察獼猴桃發(fā)病情況；

在接種獼猴桃植株發(fā)病后，提取發(fā)病植株有癥狀部位及無癥狀部位的總DNA；

以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，進(jìn)行熒光PCR檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述步驟四中以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測步驟為：

采集田間發(fā)病獼猴桃樣品，提取其病健交界處的總DNA；

以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照，健康的獼猴桃樣品作陰性對照，進(jìn)行實時熒光PCR檢測。

具體實施方式

為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式詳予說明。

本發(fā)明一種獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、將細(xì)菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，并得到測序后的序列；

步驟二、用生物學(xué)軟件clastal X對測序后的序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進(jìn)行多重同源性比較分析，并找出獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū)；

步驟三、根據(jù)獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū)，應(yīng)用引物和探針設(shè)計軟件Prmier Express設(shè)計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針；

步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進(jìn)行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測和以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測；

步驟五、重復(fù)步驟三和步驟四直至獲得用于對獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌檢測的實時熒光PCR引物和實時熒光PCR探針。以獲得對獼猴桃潰瘍病菌檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)的實時熒光PCR引物和探針為準(zhǔn)。

通過本實施例，可建立基于TaqMan實時熒光PCR的快速獼猴桃潰瘍病菌分子檢測技術(shù)，可以有效地防止檢測過程中的污染和假陽性結(jié)果。并且可對獼猴桃種苗、接穗、花、果實上的獼猴桃潰瘍病菌進(jìn)行微量檢測，以及帶有潛伏病菌而未表現(xiàn)癥狀的獼猴桃材料進(jìn)行有效的監(jiān)測，阻止該病害在新區(qū)的擴(kuò)散蔓延。

本實施例中所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行實時定量熒光PCR的檢測。

本實施例中所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)的檢測。

本實施例中所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性，在NB液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋，通過平板計數(shù)法計算菌液原始濃度；

以連續(xù)稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。

本實施例中所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性，在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

提取培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA，通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度，將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋；

以DNA各濃度梯度為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。

本實施例中所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測步驟為：

將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h；

通過注射器針刺將培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖桿上；

通過蘸有無菌水的棉花對接種后的獼猴桃植株進(jìn)行保濕，觀察獼猴桃發(fā)病情況；

在接種獼猴桃植株發(fā)病后，提取發(fā)病植株有癥狀部位及無癥狀部位的總DNA；

以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，進(jìn)行熒光PCR檢測。

本實施例中所述步驟四中以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測步驟為：

采集田間發(fā)病獼猴桃樣品，提取其病健交界處的總DNA；

以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照，健康的獼猴桃樣品作陰性對照，進(jìn)行實時熒光PCR檢測。

本發(fā)明依據(jù)獼猴桃潰瘍病菌ITS序列的多態(tài)性設(shè)計TaqMan實時熒光PCR引物和探針，同時建立獼猴桃潰瘍病菌實時定量熒光PCR檢測體系，實現(xiàn)獼猴桃潰瘍病菌的快速、特異、靈敏、定量檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。