1.一種獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟一、將細(xì)菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴增并測序,并得到測序后的序列;
步驟二、用生物學(xué)軟件clastal X對測序后的序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進(jìn)行多重同源性比較分析,并找出獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū);
步驟三、根據(jù)獼猴桃潰瘍病菌穩(wěn)定性點突變區(qū),應(yīng)用引物和探針設(shè)計軟件Prmier Express設(shè)計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針;
步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進(jìn)行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測和以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測;
步驟五、重復(fù)步驟三和步驟四直至獲得用于對獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌檢測的實時熒光PCR引物和實時熒光PCR探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于:所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行實時定量熒光PCR的檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于:所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為:
將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性,在NB液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h;
將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋,通過平板計數(shù)法計算菌液原始濃度;
以連續(xù)稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為:
將獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性,在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h;
提取培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA,通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度,將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行10×濃度梯度稀釋;
以DNA各濃度梯度為模板進(jìn)行熒光PCR檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測步驟為:
將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)12h;
通過注射器針刺將培養(yǎng)好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖桿上;
通過蘸有無菌水的棉花對接種后的獼猴桃植株進(jìn)行保濕,觀察獼猴桃發(fā)病情況;
在接種獼猴桃植株發(fā)病后,提取發(fā)病植株有癥狀部位及無癥狀部位的總DNA;
以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照,進(jìn)行熒光PCR檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以田間發(fā)病樣品為對象的熒光PCR檢測步驟為:
采集田間發(fā)病獼猴桃樣品,提取其病健交界處的總DNA;
以獼猴桃潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照,健康的獼猴桃樣品作陰性對照,進(jìn)行實時熒光PCR檢測。