技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)，具體涉及從杜仲葉中分離得到七個(gè)黃酮類化合物及其被驗(yàn)證為可溶性環(huán)氧化物水解酶的抑制劑。
背景技術(shù)：
：心血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。隨著科技的發(fā)展，人們?cè)谥委熜难芗膊》矫嬉呀?jīng)取得了很大進(jìn)展。然而，每年仍有大量心血管疾病患者因無法得到有效治療而去世。故此，人類對(duì)于心血管疾病新的治療途徑和藥物具有迫切需求性。可溶性環(huán)氧化合物水解酶(solubleepoxidehydrolase，sEH)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的一種酶。近來研究發(fā)現(xiàn)sEH與高血壓、終末器官損傷、心肌肥厚及缺血/再灌注損傷關(guān)系密切，極有可能成為一種預(yù)防和治療心血管疾病的新靶點(diǎn)(HumMolGenet，2006，15(10):1640-1649；JIntPatholClinicalMed，2008,28(5):443-446)?；诖耍种苨EH酶活性可以作為緩解和治療高血壓、終末器官損傷以、心肌肥大、糖尿病等多種心血管疾病以及抗炎鎮(zhèn)痛的潛在治療途徑?；谀蛩氐目扇苄原h(huán)氧化物水解酶抑制劑在過去的十多年中有快速發(fā)展。相關(guān)研究結(jié)果表明這類成分具有抗高血壓、抗炎以及保護(hù)心臟、腎臟和大腦免受損傷的功效。然而溶解性差，降解迅速等特點(diǎn)也在很大程度上限制了此類化合物的應(yīng)用前景。此外，部分sEH抑制劑可以在肝臟微粒體中被快速代謝掉。后來，人們對(duì)基于尿素的sEH抑制劑從藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度兩個(gè)角度進(jìn)行了改進(jìn)，但仍然存在諸如吸收緩慢、半衰期短和水溶性差等缺點(diǎn)。1951年，前蘇聯(lián)研究杜仲可調(diào)節(jié)血壓，1976年，美國威斯康辛大學(xué)教授研究認(rèn)為杜仲降血壓的機(jī)理是杜仲中松脂素二葡萄糖苷的作用。此后，日本人研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉中的京尼平苷和京尼平苷酸為杜仲葉降血壓的有效成分；我國科學(xué)家研究認(rèn)為杜仲葉的藥用有效成分與皮其本相同、藥用功能基本一致及杜仲葉降血壓的機(jī)理是其有效成分對(duì)冠狀動(dòng)脈血管的擴(kuò)張作用。至今未見杜仲葉中的可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑的有關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，目的是提供黃酮類化合物作為可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供的黃酮類化合物作為sEH抑制劑的應(yīng)用，所述黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示：式I中；上述類黃酮化合物的提取原料為杜仲葉。本發(fā)明的另一目的是提供了上述黃酮類化合物用于制備預(yù)防和治療心血管疾病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明從杜仲葉中分離得到具有可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制活性的七個(gè)黃酮類成分。此類成分具有水溶性好，毒副作用小、含量高、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)?；钚詼y試結(jié)果顯示杜仲葉黃酮可以抑制sEH活性?；诳扇苄原h(huán)氧化物水解酶的作用原理，本發(fā)明提供的杜仲葉中可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑，可以用于預(yù)防和治療多種心血管疾病。附圖說明圖1是杜仲葉中黃酮化合物于37℃下對(duì)于可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)水解底物PHOME的影響；圖2EU-26米氏方程雙倒數(shù)曲線；圖3RU-40米氏方程雙倒數(shù)曲線；圖4EU-26Dixon曲線；圖5RU-40Dixon曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供的黃酮類化合物的制備方法如下：(1)新鮮采摘的杜仲葉，于室內(nèi)充分陰干；(2)粉碎后使用濃度為50％的甲醇滲漉提取，直到流出液無色；(3)合并提取液，減壓濃縮得浸膏；(4)浸膏用純水按照kg/L1:10混懸，使用等體積正丁醇進(jìn)行萃取，3次。將水相和正丁醇相分別濃縮，回收溶劑；(5)水相按質(zhì)量比1:3與100-200目硅膠拌樣，氯仿：甲醇(5:1至1:1)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。收集硫酸乙醇顯黃色的部分，合并；(6)繼續(xù)使用AB-8大孔吸附樹脂、硅膠、反相硅膠、凝膠以及HPLC等分離技術(shù)進(jìn)行純化。最終分離得到EU-6和EU-7；(7)所得正丁醇相使用少量水溶解，使用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行分離；依次使用水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇進(jìn)行洗脫。收集30％至75％部分，分別使用硅膠、凝膠、反相硅膠以及HPLC等技術(shù)進(jìn)行分離純化；最終分離得到Eu-18、EU-23、EU-26、EU-40以及EU-43；本發(fā)明的黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下：EU-26，黃色固體，ESI-MSm/z:301[M-H]-,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-18，黃色固體，ESI-MSm/z:465[M-H]-,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-6，黃色固體，ESI-MSm/z:619[M+Na]+,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-7,黃色固體，ESI-MSm/z:633[M+Na]+,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-40,黃色固體，ESI-MSm/z:285[M-H]-,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-23,黃色固體，ESI-MSm/z:447[M-H]-,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2；EU-43,黃色固體，ESI-MSm/z:617[M+Na]+,13C-NMR見表1，1H-NMR見表2。表1杜仲葉黃酮13CNMR譜數(shù)據(jù)發(fā)明人檢測了本發(fā)明的黃酮類化合物對(duì)可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)的抑制活性：表3本發(fā)明的黃酮類化合物在100M時(shí)對(duì)于sEH的抑制活性編號(hào)sEH抑制活性EU-2616.7±0.2EU-1830.1±2.5EU-637.4±0.7EU-731.3±0.3EU-4019.3±1.3EU-2330.9±2.2EU-4340.4±5.9表3所示結(jié)果表明，杜仲葉黃酮成分對(duì)sEH具有一定程度的抑制活性。進(jìn)一步活性測試結(jié)果如表4所示：表4AUDA為陽性對(duì)照；Ki表示抑制常數(shù)；NT表示未檢測?；钚詼y定結(jié)果表明：本發(fā)明的化合物對(duì)于sEH水解酶具有一定程度的抑制活性，且活性大小和結(jié)構(gòu)特征存在一定的關(guān)系。其中EU-26(槲皮素)和EU-40(山奈酚)抑制可溶性環(huán)氧化物水解酶均為非競爭性抑制，其抑制常數(shù)分別為18.2M和27.5M。當(dāng)前第1頁1 2 3