本發(fā)明屬于新化合物合成和藥物應(yīng)用領(lǐng)域，涉及8-氮雜香豆素類(lèi)化合物，包括合成、評(píng)價(jià)及應(yīng)用。

技術(shù)背景

香豆素，又稱(chēng)1,2-苯并吡喃酮，是一種用途廣泛的香料。研究表明：香豆素具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗艾滋病、抗細(xì)菌、抗凝血、抗氧化、增強(qiáng)人體免疫功能，光敏等作用，具有潛在的藥用價(jià)值，因而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥，制藥等行業(yè)。但經(jīng)典的香豆素類(lèi)化合物具有水溶性差的明顯缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。雖然可以通過(guò)在底物母體上引入水溶性基團(tuán)而提高水溶性，但由于引入多余的官能團(tuán)往往造成化合物活性降低，此外增加了成本。氮雜香豆素是香豆素的電子等排體，但由于結(jié)構(gòu)中含有吡啶環(huán)而具有較好的水溶性，且有文獻(xiàn)報(bào)道該類(lèi)化合物具有比香豆素更好的光化學(xué)性質(zhì)。因此，開(kāi)發(fā)氮雜香豆素類(lèi)化合物的合成方法受到許多化學(xué)家的關(guān)注。

1978年，Ronald L.Atkins等人用von Pechmann反應(yīng)，以2,6-二羥基吡啶為原料，乙醇為溶劑，與乙酰乙酸乙酯在加熱條件下反應(yīng)合成4-甲基-7-羥基-8-氮雜香豆素。該反應(yīng)條件較為苛刻,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),收率很低。此外，該方法僅能合成7-位具有給電子基的8-氮雜香豆素類(lèi)化合物，限制了其應(yīng)用。1993年，D.Billeret等以4-羥基-3-吡啶醛為原料，首先用Knoevenagel-Doebner反應(yīng)條件得到反式-4-羥基-3-吡啶丙烯酸，再在吡啶鹽酸鹽高溫條件下脫水關(guān)環(huán)得到6-氮雜香豆素。該反應(yīng)需要高溫,且收率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種8-氮雜香豆素的合成方法，本方法是以氮氧化物為底物，乙酸酐為溶劑，碳酸鉀為堿，在120～140度下，反應(yīng)生成8-氮雜香豆素類(lèi)化合物。本方法具有操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)選擇性高，底物適用性廣，產(chǎn)率高等顯著優(yōu)點(diǎn)。此外，該類(lèi)化合物水溶性顯著提高，相關(guān)抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)其活性并未降低，甚至有提高。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一類(lèi)8-氮雜香豆素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)通式如下：

其中，R₁為取代的氫、芳基或烷基，R₂為在吡啶環(huán)4,5,6位取代的氫，鹵素，硝基，芳基，羧基，三氟甲基，酯基，烷基或烷氧基，R₃為在喹啉環(huán)4,5,6,7,8位取代的氫，鹵素，硝基，芳基，羧基，三氟甲基，酯基，烷基或烷氧基。R₃和R₄為氫原子，或者碳原子并與所連接的吡啶環(huán)上的兩個(gè)碳形成5-7元芳香環(huán)或芳香雜環(huán)；

化合物I是通過(guò)以下合成路線得到的：

該反應(yīng)所用的溶劑為乙酸酐。反應(yīng)溫度為120～140度，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為6～14小時(shí)。

氮氧化物(II)是通過(guò)以下合成路線得到的：

即以III為原料，在醋酸鈀催化下，與丙烯酸甲酯類(lèi)化合物發(fā)生Heck反應(yīng)得到IV，IV在堿作用下水解得到羧酸V，再用間氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)氧化得到II。

已合成的8-氮雜香豆素類(lèi)化合物的命名與結(jié)構(gòu)如下表所示：

表1一類(lèi)8-氮雜香豆素類(lèi)化合物

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、本發(fā)明采用價(jià)廉易得的氮氧化物為原料，所發(fā)明的反應(yīng)方法具有位置選擇性高，底物適用性廣，產(chǎn)率高等顯著優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明的反應(yīng)不需無(wú)水無(wú)氧操作，操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)。

3、本發(fā)明方法能得到不同位置取代的8-氮雜香豆素類(lèi)化合物，且適用于各類(lèi)取代基?？梢园凑毡景l(fā)明的原理進(jìn)行推廣使用，適用性很好。

4、本發(fā)明所涉及的氮雜香豆素類(lèi)化合物比相應(yīng)的香豆素類(lèi)化合物水溶性得到明顯改善，但并未在母體結(jié)構(gòu)中引入多余的水溶性基團(tuán)。

5、本發(fā)明所涉及的氮雜香豆素類(lèi)化合物具有較好的抗腫瘤活性，個(gè)別活性較相應(yīng)香豆素類(lèi)化合物有較大的提高。

附圖說(shuō)明

圖1為化合物4在氘代三氯甲烷中的核磁氫譜圖；

圖2為化合物4在氘代三氯甲烷中的核磁碳譜圖；

圖3為化合物10在氘代三氯甲烷中的核磁氫譜圖；

圖4為化合物10在氘代三氯甲烷中的核磁碳譜圖；

圖5為化合物13在氘代甲醇中的核磁氫譜圖；

圖6為化合物13在氘代甲醇中的核磁碳譜圖。

具體的實(shí)施方式

為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

化合物I是通過(guò)以下合成路線得到的：

即以III為原料，在醋酸鈀催化下，與丙烯酸甲酯類(lèi)化合物發(fā)生Heck反應(yīng)得到IV；IV在堿作用下水解得到羧酸V；再用間氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)氧化得到II；最后以乙酸酐為溶劑，碳酸鉀為堿，發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)得到終產(chǎn)物8-氮雜香豆素I。

1、Heck反應(yīng)操作

將3-溴吡啶類(lèi)底物III(1.0equiv),丙烯酸甲酯類(lèi)底物(1.5equiv)用除氧DMF溶解(底物濃度0.2mol/L)，依次向溶液中加入DABCO(0.04equiv)，K₂CO₃(1.0equiv)，Pd(OAc)₂(0.02equiv),氬氣保護(hù)，125℃反應(yīng)12小時(shí)。冷卻到室溫后，將不溶物過(guò)濾掉，濾餅用少量水和乙酸乙酯淋洗。母液中加入適量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，飽和食鹽水洗，干燥，過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)品。柱層析純化(10:1～3:1)得到產(chǎn)物IV。

2、水解反應(yīng)操作

在圓底燒瓶中依次加入化合物III(1.0eq.)，氫氧化鈉水溶液(3M，3.0eq.),加入甲醇(底物濃度1.0mol/L)，然后加熱至回流攪拌數(shù)個(gè)小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)直至反應(yīng)結(jié)束(需要1～5h)。反應(yīng)完全后冷卻至室溫，減壓蒸餾除掉甲醇。水相用3mol/L鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH 5～6.析出大量固體，用布氏漏斗抽濾，濾餅用適量水淋洗。再用真空干燥得到相應(yīng)產(chǎn)物IV。直接投入下一步反應(yīng)。

3、氧化反應(yīng)操作

在圓底燒瓶中加入化合物IV，再加入溶劑二氯甲烷(底物濃度0.5mol/L)。然后溫度降至0℃，加間氯過(guò)氧苯甲酸(1.2eq.)。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，析出白色固體，次日TLC跟蹤反應(yīng)直到反應(yīng)結(jié)束。用布氏漏斗抽濾，固體用乙醚打漿2～3次。在45℃真空干燥，得到相應(yīng)產(chǎn)物II。

4、關(guān)環(huán)反應(yīng)操作

在圓底燒瓶中依次加入化合物II(1.0eq.)，碳酸鉀(3.0eq.)、水(7.0eq.)，加入乙酸酐(底物濃度0.2mol/L)，然后加熱至120～140度反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)直到反應(yīng)結(jié)束(需要6～14h)。降至室溫后，減壓蒸干溶劑。加入乙酸乙酯與水，取上層有機(jī)相。對(duì)水相萃取兩次后，合并有機(jī)相，干燥，濃縮后得粗產(chǎn)品。用二氯甲烷：甲醇＝100:1～30:1作為流動(dòng)相，柱層析得到I(表1所示各化合物)，產(chǎn)率31-92％。

下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明。

實(shí)施例1

化合物1的合成。

將3-溴喹啉(2.3g,1.0eq.),丙烯酸甲酯(1.5equiv)用除氧DMF溶解(底物濃度0.2mol/L)，依次向溶液中加入三乙烯二胺(0.04equiv)，K₂CO₃(1.0equiv)，Pd(OAc)₂(0.02equiv),氬氣保護(hù)，125℃反應(yīng)12小時(shí)。冷卻到室溫后，將不溶物過(guò)濾掉，濾餅用少量水和乙酸乙酯淋洗。母液中加入適量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，飽和食鹽水洗，干燥，過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)品。柱層析純化(10:1～3:1)得到產(chǎn)物3-喹啉丙烯酸甲酯(1.7g,73％)。

在圓底燒瓶中依次加入3-喹啉丙烯酸甲酯(2.90g,1.0eq.)，氫氧化鈉水溶液(3M,3.0eq.)，甲醇(底物濃度1.0mol/L)，然后加熱至回流，TLC跟蹤反應(yīng)直至反應(yīng)結(jié)束(需要1～5h)。反應(yīng)完全后冷卻至室溫，減壓蒸餾除掉甲醇。水相用3mol/L鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH 5～6.析出大量固體，用布氏漏斗抽濾，濾餅用適量水淋洗。再用真空干燥得到3-喹啉丙烯酸(2.12g,80％)。直接投入下一步反應(yīng)。

在圓底燒瓶中加入上步所得產(chǎn)物(2.12g，1.0eq.)，再加入二氯甲烷溶解(底物濃度0.5mol/L)。然后溫度降至0℃，加入間氯過(guò)氧苯甲酸(1.2eq.)。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，析出白色固體。用布氏漏斗抽濾，固體用乙醚打漿2～3次。在45℃真空干燥，得到相應(yīng)產(chǎn)物II(2.1g，92％)。

在圓底燒瓶中依次加入上步所得產(chǎn)物(150mg，1.0eq.)，碳酸鉀(3.0eq.)，水(7.0eq.)，乙酸酐(底物濃度0.2mol/L)，然后加熱至140度攪拌過(guò)夜。降至室溫后，減壓蒸干溶劑。加入乙酸乙酯與水，取上層有機(jī)相。對(duì)水相萃取兩次后，合并有機(jī)相，干燥，濃縮后得粗產(chǎn)品。用二氯甲烷：甲醇＝100:1～30:1作為流動(dòng)相，柱層析得到化合物1(124mg)，產(chǎn)率90％。結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.85-7.82(m,2H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),6.55(d,J＝9.6Hz,1H).符合標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)特征。

實(shí)施例2

化合物2的合成。

實(shí)施例2的合成方法同上述合成通法。

4-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]quinolin-2-one

收率：61％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.09(d,J＝8.8Hz,1H),7.84–7.82(m,2H),7.61–7.52(m,6H),6.50(s,1H)；HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₁₈H₁₁NO₂H⁺[(M+H)⁺]:274.0863,found 274.0863.

實(shí)施例3

化合物3的合成。

實(shí)施例3的合成方法同上述合成通法。

2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：70％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.90(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),7.72(d,J＝9.6Hz,1H),7.31(dd,J＝7.6,4.8,1H),6.51(d,J＝9.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.2,159.0,150.8,142.1,137.3,121.2,118.5,114.2.符合標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)特征。

實(shí)施例4

化合物4的合成。

實(shí)施例4的合成方法同上述合成通法。

6-fluoro-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：65％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.39(d,J＝2.8Hz,1H),7.70(d,J＝9.6Hz,1H),7.63(dd,J＝7.2,3.2Hz,1H),6.58(d,J＝9.6Hz,1H)；HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₈H₄NO₂FH⁺[(M+H)⁺]:166.0299,found 166.0305.

實(shí)施例5

化合物5的合成。

實(shí)施例5的合成方法同上述合成通法。

6-chloro-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：80％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.47(d,J＝2.4Hz,1H),7.87(d,J＝2.4Hz,1H),7.66(d,J＝9.6Hz,1H),6.57(d,J＝9.2Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.6,157.1,149.2,140.9,136.1,128.4,119.6,114.8.HRMS(ESI-TOF)m/zcalcd.for C₈H₄NO₂ClH⁺[(M+H)⁺]:182.0003,found 182.0009.

實(shí)施例6

化合物6的合成。

實(shí)施例6的合成方法同上述合成通法。

6-bromo-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：49％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.01(d,J＝2.4Hz,1H),7.66(d,J＝9.6Hz,1H),6.56(d,J＝9.6Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.5,157.5,151.4,140.9,139.0,119.5,116.1,115.4.HRMS(ESI-TOF)m/zcalcd.for C₈H₄NO₂BrH⁺[(M+H)⁺]:225.9498,found 225.9495.

實(shí)施例7

化合物7的合成。

實(shí)施例7的合成方法同上述合成通法。

6-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：76％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),7.66-7.69(m,2H),6.50(d,J＝9.6Hz,1H),2.43(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.5,157.2,151.0,142.0,137.2,130.9,118.4,113.6,17.8.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found 162.0552.

實(shí)施例8

化合物8的合成。

實(shí)施例8的合成方法同上述合成通法。

ethyl 2-oxo-2H-pyrano[2,3-b]pyridine-6-carboxylate

收率:55％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.14(d,J＝2.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),7.78(d,J＝9.6Hz,1H),6.59(d,J＝9.6Hz,1H),4.46(q,J＝7.2Hz,2H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ164.0,161.1,159.4,152.2,141.7,138.6,124.3,119.2,113.6,62.1,14.4.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₁₁H₉NO₄H⁺[(M+H)⁺]:220.0604,found 220.0598.

實(shí)施例9

化合物9的合成。

實(shí)施例9的合成方法同上述合成通法。

6-methoxy-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：59％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(d,J＝2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.6Hz,1H),7.34(d,J＝2.8Hz,1H),6.52(d,J＝9.6Hz,1H),3.92(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ160.5,153.6,153.1,141.8,138.6,119.9,118.9,113.9,56.5.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd for C₉H₇NO₃H⁺[(M+H)⁺]:178.0499,found 178.0502.

實(shí)施例10

化合物10的合成。

實(shí)施例10的合成方法同上述合成通法。

6-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：88％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.75(s,1H),8.04(s,1H),7.78(d,J＝9.6Hz,1H),7.60–7.58(m,2H),7.52(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(t,J＝7.2Hz,1H),6.57(d,J＝9.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.2,158.2,149.2,142.1,136.2,135.2,134.9,129.5,128.8,127.3,118.8,113.9.

實(shí)施例11

化合物11的合成。

實(shí)施例11的合成方法同上述合成通法。

7-(trifluoromethyl)-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率:73％；；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(d,J＝6.8Hz,1H),7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.70(d,J＝7.2Hz,1H),6.65(d,J＝9.2Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.7(d,J＝50Hz),148.3(d,J＝36Hz),140.9,139.0,122.1,120.5,119.3,117.7(d,J＝3.00Hz),116.8.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₄NO₂F₃H⁺[(M+H)⁺]:216.0267,found 216.0257.

實(shí)施例12

化合物12的合成。

實(shí)施例12的合成方法同上述合成通法。

4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：85％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.54(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.99(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.33(dd,J＝8.0,4.8Hz,1H),6.37(s,1H),2.46(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,158.5,151.2,150.8,134.3,121.0,116.6,115.5,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found162.0558.

實(shí)施例13

化合物13的合成。

實(shí)施例13的合成方法同上述合成通法。

3-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：53％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.41(d,J＝3.6Hz,1H),8.07(d,J＝7.6Hz,1H),7.79(s,1H),7.40(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),2.20(s,3H).¹³C NMR(100MHz,MeOD)δ163.1,159.4,149.8,139.5,138.5,128.7,122.5,116.7,16.9.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found 162.0547.

實(shí)施例14

化合物14的合成。

實(shí)施例14的合成方法同上述合成通法。

4-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：87％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(dd,J＝4.8,1.2Hz,1H),7.91(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.57–7.55(m,3H),7.45–7.43(m,2H),7.28(d,J＝4.8,1H),6.47(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,159.1,154.5,150.9,136.6,134.2,130.3,129.3,128.5,121.0,116.5,114.6.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₁₄H₉NO₂H⁺[(M+H)⁺]:224.0706,found 224.0709.

實(shí)施例15

化合物15的合成。

實(shí)施例15的合成方法同上述合成通法。

3-(3,4-dimethoxyphenyl)-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：92％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.51(d,J＝4.8Hz,1H),7.93(d,J＝7.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.33–7.28(m,3H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),3.95(s,3H),3.93(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,158.2,150.3,149.9,148.9,137.0,136.8,129.7,126.8,121.5,121.3,115.2,111.9,111.2,56.2,56.1.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₁₆H₁₃NO₄H⁺[(M+H)⁺]:284.0917,found 284.0922.

實(shí)施例16

化合物16的合成。

實(shí)施例16的合成方法同上述合成通法。

6-chloro-4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：91％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.46(d,J＝2.4Hz,1H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),6.41(s,1H),2.44(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.5,156.7,150.2,149.1,133.5,128.4,117.5,116.3,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₆NO₂Cl H⁺[(M+H)⁺]:196.0160,found 196.0154.

實(shí)施例17

化合物17的合成。

實(shí)施例17的合成方法同上述合成通法。

6-bromo-4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：76％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.08(d,J＝2.0Hz,1H),6.40(s,1H),2.45(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.4,157.1,151.3,150.2,136.3,117.4,116.9,116.0,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₆NO₂Br H⁺[(M+H)⁺]:239.9655,found 239.9659.

實(shí)施例18

化合物18的合成。

實(shí)施例18的合成方法同上述合成通法。

5-methoxy-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：31％；結(jié)構(gòu)參數(shù):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.40(d,J＝5.6Hz,1H),8.02(d,J＝9.6Hz,1H),6.77(d,J＝5.6Hz,1H),6.41(d,J＝9.6Hz,1H),4.02(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ163.8,160.5,160.4,152.0,137.3,116.0,104.5,103.6,56.7.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₃H⁺[(M+H)⁺]:178.0499,found 178.0493.

化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率)

1.1原理

利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使外源性MTT還原為難溶于水的藍(lán)紫色的結(jié)晶物質(zhì)甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞線粒體中此種酶失去活性從而無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)或鹽酸-異丙醇溶液能溶解細(xì)胞中沉積的結(jié)晶物質(zhì)甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm(630nm)或570nm(630nm)波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值(OD值)，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的晶體物質(zhì)的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴cell/mL接種于96孔板上，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置空白孔和對(duì)照孔。于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間(懸浮細(xì)胞培養(yǎng)2h，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)24h)，分別加入終濃度為0.001，0.01，0.1，1，10μM的化合物，每孔0.5μL，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白孔為單純培養(yǎng)基孔不含有細(xì)胞、DMSO以及化合物。對(duì)照孔為僅加入含相同濃度DMSO的完全培養(yǎng)基作用于細(xì)胞。置于37℃，5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中，分別于6h，12h，24h，48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(用PBS配制，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌)，置于37℃，5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞處理方式小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100μL DMSO，懸浮細(xì)胞處理方式就是在每孔中繼續(xù)加入100μL鹽酸-異丙醇溶液反復(fù)吹打混勻，37℃放置10min后，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀(490nm,630nm或570nm,630nm)測(cè)定各孔的吸光度(OD)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100％

IC₅₀：即細(xì)胞存活率為50％時(shí)的藥物濃度，又稱(chēng)半數(shù)有效抑制濃度。根據(jù)MTT結(jié)果求直線回歸方程，并計(jì)算每個(gè)化合物的IC₅₀值。

IC₅₀值與化合物的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性呈反比例關(guān)系，即IC₅₀值越小，化合物的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性越高，越有可能具有高效的抗腫瘤活性。

化合物3-6以及相應(yīng)香豆素的體外抗腫瘤活性結(jié)果如表2所示。

表2體外抗腫瘤活性(100μM的抑制率)

表2結(jié)果表明，氮雜香豆素化合物3,6及7的脂水分配系數(shù)LogP比相應(yīng)的香豆素要小約0.6個(gè)單位，因此氮雜香豆素的水溶性比相應(yīng)香豆素均得到明顯改善。此外，該類(lèi)化合物對(duì)人白血病細(xì)胞(K562)及肝癌細(xì)胞(HepG2)均有抑制活性，尤其對(duì)人白血病細(xì)胞(K562)的抑制，氮雜香豆素3比香豆素有顯著提高。