本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光探針檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法。

背景技術(shù)：

日本血吸蟲(chóng)病是世界性分布的人獸共患寄生蟲(chóng)病，是世界衛(wèi)生組織(WHO)界定的“六大熱帶病之一”，也是我國(guó)五大寄生蟲(chóng)病之一。日本血吸蟲(chóng)病是由尾蚴感染接觸疫水的人和動(dòng)物等終宿主引起的。幼蟲(chóng)在終宿主體內(nèi)通過(guò)吸收宿主營(yíng)養(yǎng)發(fā)育，造成宿主營(yíng)養(yǎng)不良；通過(guò)轉(zhuǎn)變抗原、抗原偽裝和減弱宿主的免疫力等途徑來(lái)抵抗宿主免疫的殺傷作用，逐漸發(fā)育至成蟲(chóng)，寄生于門(mén)脈-腸系膜靜脈系統(tǒng)。急性期癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、肝腫大、腹痛、腹瀉和便血等；慢性期癥狀主要表現(xiàn)為肝脾腫大或慢性腹瀉；晚期，主要與肝臟門(mén)靜脈周?chē)w維化有關(guān)，臨床表現(xiàn)為巨脾、腹水等。

日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)屬于扁形動(dòng)物門(mén)、吸蟲(chóng)綱、復(fù)殖目、裂體科、裂體屬、日本種，雌雄異體。雄蟲(chóng)平均長(zhǎng)13mm，雌蟲(chóng)平均長(zhǎng)15mm。蟲(chóng)卵圓形，淡黃色，卵殼薄，無(wú)蓋，在其側(cè)方有一小刺，成熟的卵內(nèi)含毛蚴。毛蚴呈長(zhǎng)橢圓形，卵內(nèi)毛蚴在水中孵出，侵入釘螺，釘螺是其唯一的中間宿主，所以日本血吸蟲(chóng)病的流行地理分布和釘螺的地理分布相一致，有一定的地方性。血吸蟲(chóng)的基因組由8對(duì)染色體組成，其中7對(duì)為常染色體，1對(duì)性染色體。

在我國(guó)血吸蟲(chóng)病的病原是日本血吸蟲(chóng)，我國(guó)血吸蟲(chóng)病主要分布在江蘇、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、廣西、廣東、福建等12個(gè)省的433個(gè)縣(市、區(qū))，共有釘螺面積148億平方米，累計(jì)感染者達(dá)1160萬(wàn)例，受威脅人口在1億以上。我國(guó)的血吸蟲(chóng)病經(jīng)過(guò)60年的積極防治，全國(guó)的血吸蟲(chóng)病疫情已得到有效控制，但近年來(lái)由于生物、自然、社會(huì)經(jīng)濟(jì)、人口流動(dòng)、政策保障等因素變化較大，一些地方呈現(xiàn)血吸蟲(chóng)病疫情擴(kuò)散蔓延的態(tài)勢(shì)，表現(xiàn)為老疫區(qū)血吸蟲(chóng)病患者增加，釘螺擴(kuò)散明顯，新釘螺區(qū)出現(xiàn)，感染性釘螺分布范圍擴(kuò)大，部分已達(dá)血吸蟲(chóng)病傳播控制和傳播阻斷的地區(qū)可能出現(xiàn)疫情回升，各地輸入性血吸蟲(chóng)病病例增加，我國(guó)的血吸蟲(chóng)病防治工作還任重道遠(yuǎn)。

在血吸蟲(chóng)病的防控中，診斷與檢測(cè)工作顯得更為重要，它為防治活動(dòng)的計(jì)劃、實(shí)施和防治效果評(píng)價(jià)等個(gè)環(huán)節(jié)提供必要的信息和科學(xué)依據(jù)。用于血吸蟲(chóng)診斷的方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和超聲診斷等，但是傳統(tǒng)的血吸蟲(chóng)檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、漏檢率高、程序復(fù)雜、檢測(cè)結(jié)果滯后，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代的檢測(cè)要求。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)建立了較多快速、靈敏以核酸為基礎(chǔ)的血吸蟲(chóng)檢測(cè)方法，目前已有多種日本血吸蟲(chóng)的核酸診斷方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等檢測(cè)方法。PCR及Q-PCR法依賴(lài)于熱循環(huán)儀器，對(duì)操作環(huán)境及人員有較高的要求，并且耗時(shí)長(zhǎng)，而LAMP法的問(wèn)題在于擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的污染，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，對(duì)操作環(huán)境及操作技巧的要求更高，這些方法不適合在基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、易于檢測(cè)結(jié)果的低溫血吸蟲(chóng)DNA檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法，包括以下步驟：將擴(kuò)增體系與血吸蟲(chóng)DNA混合，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中用熒光探針?lè)▽?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，有熒光信號(hào)放大為陽(yáng)性，說(shuō)明存在血吸蟲(chóng)DNA；

所述擴(kuò)增體系包括以下組分：Tris緩沖液、醋酸鉀、醋酸鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、熒光探針、DNA聚合酶和血吸蟲(chóng)DNA特異性引物；

所述血吸蟲(chóng)DNA特異性引物包括正向引物和反向引物：

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述熒光探針序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

所述等溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～45℃；

所述等溫?cái)U(kuò)增的時(shí)間為5～20min。

優(yōu)選的，所述擴(kuò)增體系包括以下濃度的組分：Tris緩沖液(0～60]mM、醋酸鉀50～150mM、醋酸鎂8～30mM、二硫蘇糖醇4～9mM、質(zhì)量濃度為5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、單鏈結(jié)合蛋白300～1000ng/μL、重組酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、熒光探針50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM。

優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為30000～40000。

優(yōu)選的，所述擴(kuò)增體系的體積為25～100μL。

優(yōu)選的，所述血吸蟲(chóng)DNA的體積為0.5～1.5μL，濃度為10～100ng/μL。

優(yōu)選的，所述等溫?cái)U(kuò)增在恒溫條件下進(jìn)行，所述等溫?cái)U(kuò)增的溫度為37～42℃。

優(yōu)選的，所述等溫?cái)U(kuò)增的時(shí)間為10～20min。

優(yōu)選的，所述擴(kuò)增體系由冷凍干燥粉末狀態(tài)的擴(kuò)增體系原料溶解得到，用于溶解所述擴(kuò)增體系原料的溶劑為反應(yīng)緩沖液。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)緩沖液為質(zhì)量濃度為5.5～6.5％、分子量為30000～40000的聚乙二醇水溶液。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的等溫?cái)U(kuò)增體系，包括以下含量的組分：Tris緩沖液(0～60]mM、醋酸鉀50～150mM、醋酸鎂8～30mM、二硫蘇糖醇4～9mM、質(zhì)量濃度為5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、單鏈結(jié)合蛋白300～1000ng/μL、重組酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、熒光探針50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM；

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；

所述熒光探針序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法，采用擴(kuò)增體系與血吸蟲(chóng)DNA混合，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中用熒光探針?lè)▽?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，有熒光信號(hào)放大為陽(yáng)性，說(shuō)明存在血吸蟲(chóng)DNA；所述擴(kuò)增體系中包括Tris緩沖液、醋酸鉀、醋酸鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、熒光探針、DNA聚合酶和血吸蟲(chóng)DNA特異性引物，本發(fā)明的擴(kuò)增體系可以在恒定的相對(duì)較低的溫度下完成擴(kuò)增，不依賴(lài)熱循環(huán)儀，操作簡(jiǎn)單，能夠在較低的溫度(35～45℃)下對(duì)血吸蟲(chóng)DNA進(jìn)行檢測(cè)，并且擴(kuò)增所用時(shí)間短(5～20min)，熒光信號(hào)易于收集，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為血吸蟲(chóng)DNA檢測(cè)過(guò)程中陰性和陽(yáng)性的熒光信號(hào)變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法，包括以下步驟：將擴(kuò)增體系與血吸蟲(chóng)DNA混合，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中用熒光探針?lè)▽?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，有熒光信號(hào)放大為陽(yáng)性，說(shuō)明存在血吸蟲(chóng)DNA；

所述擴(kuò)增體系包括以下組分：Tris緩沖液、醋酸鉀、醋酸鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、熒光探針、DNA聚合酶和血吸蟲(chóng)DNA特異性引物；

所述血吸蟲(chóng)DNA特異性引物包括正向引物和反向引物：

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述熒光探針序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’；

所述等溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～45℃；所述等溫?cái)U(kuò)增的時(shí)間為5～20min。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)對(duì)血吸蟲(chóng)DNA的檢測(cè)，提供擴(kuò)增體系，將所述擴(kuò)增體系與血吸蟲(chóng)DNA混合進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增體系優(yōu)選由冷凍干燥粉末狀態(tài)的擴(kuò)增體系原料溶解得到，所述擴(kuò)增體系以冷凍干燥粉末的形貌儲(chǔ)存，以便擴(kuò)增體系的長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸。在本發(fā)明中，用于溶解所述擴(kuò)增體系原料用溶劑優(yōu)選為反應(yīng)緩沖液。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)緩沖液優(yōu)選為聚乙二醇水溶液，所述聚乙二醇水溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為5.5～6.5％，更優(yōu)選的為6％；所述聚乙二醇的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選的為30000～40000，更優(yōu)選的為35000。

在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增體系的體積優(yōu)選的為25～100μL，更優(yōu)選的為40～60μL。在本發(fā)明中，所述的擴(kuò)增體系包括Tris緩沖液，所述Tris緩沖液在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選為(0,60]mM，更優(yōu)選為20～55mM，最優(yōu)選為30～50mM。在本發(fā)明中，所述Tris緩沖液具有良好的緩沖能力，能夠維持?jǐn)U增體系在穩(wěn)定的pH值范圍，所述擴(kuò)增體系的pH值范圍優(yōu)選的為7.0～7.5。

在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增體系包括醋酸鉀，所述醋酸鉀在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為50～150mM，更優(yōu)選的為60～120mM，最優(yōu)選的為75～85mM。在本發(fā)明中，所述醋酸鉀中鉀離子在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中能夠促進(jìn)引物退火。

在本發(fā)明中，所述的擴(kuò)增體系包括醋酸鎂，所述醋酸鎂在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為8～30mM，更優(yōu)選的為10～20mM，最優(yōu)選的為12～16mM。在本發(fā)明中，所述醋酸鎂中的鎂離子在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中能夠提高擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量。

在本發(fā)明中，所述的擴(kuò)增體系中包括二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為4～9mM，更優(yōu)選的為5～8mM，最優(yōu)選的為6～7mM。在等溫?cái)U(kuò)增中，所述二硫蘇糖醇可以打斷二硫鍵，使與染色體DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)從DNA上釋放出來(lái)，導(dǎo)致更多的DNA與引物結(jié)合，提高擴(kuò)增效率。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括聚乙二醇，所述聚乙二醇在擴(kuò)增體系中的質(zhì)量濃度優(yōu)選的為5.5～7.8％，更優(yōu)選的為6.0～7.5％，最優(yōu)選的為7.1～7.3％。在本發(fā)明中，所述聚乙二醇的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選的為30000～40000，更優(yōu)選的為35000；本發(fā)明中所述的聚乙二醇作為縮合劑，與單鏈結(jié)合蛋白共同作用，使得整個(gè)等溫?cái)U(kuò)增化學(xué)平衡朝著擴(kuò)增產(chǎn)物方向發(fā)展，提高等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括ATP，所述ATP在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為1～6mM，更優(yōu)選的為3～5.5mM，最優(yōu)選的為5mM；

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系中包括dNTPs，所述dNTPs在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為0.1～0.4mM，更優(yōu)選的為0.15～0.35mM，最優(yōu)選的為0.2～0.3mM；

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系中包括磷酸肌酸，所述磷酸肌酸在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為20～100μg/U，更優(yōu)選的為25～70μg/U，最優(yōu)選的為30～50μg/U；

在本發(fā)明所述等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中，dNTPs為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)提供原料，ATP提供反應(yīng)所需的能量，而磷酸肌酸能夠促進(jìn)ATP的再生，為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)源源不斷的提供能量，實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括單鏈結(jié)合蛋白，所述單鏈結(jié)合蛋白在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為300～1000ng/μL，更優(yōu)選的為400～700ng/μL，最優(yōu)選的為450～550ng/μL。在本發(fā)明中，所述的單鏈結(jié)合蛋白與上述技術(shù)方案所述聚乙二醇作共同作用，提高等溫產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括重組酶，所述重組酶來(lái)源可以是噬菌體T2、T4、T7也可以來(lái)源于細(xì)菌和真菌中的重組酶，所述重組酶能夠起到解開(kāi)雙鏈DNA功能。所述重組酶在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為50～500ng/μL，更優(yōu)選的為100～450ng/μL，最優(yōu)選的為380～4200ng/μL；

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括UvsY蛋白，所述UvsY蛋白在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為50～200ng/μL，更優(yōu)選的為60～150ng/μL，最優(yōu)選的為65～85ng/μL；

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系中包括核酸外切酶，所述核酸外切酶在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為30-200ng/μL，更優(yōu)選的為50～150ng/μL，更優(yōu)選的為80～90ng/μL；本發(fā)明中所述核酸外切酶為核酸外切酶Ⅲ。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系中包括熒光探針，所述熒光探針的在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為50～150nM，更優(yōu)選的為100～140nM，最優(yōu)選的為120nM；所述熒光探針的序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’。在本發(fā)明中，所述熒光探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，所述報(bào)告熒光基團(tuán)優(yōu)選的為FAM熒光基團(tuán)；所述的猝滅熒光基團(tuán)為T(mén)AMRA或BHQ；熒光探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，無(wú)熒光信號(hào)；當(dāng)目標(biāo)靶基因成功擴(kuò)增時(shí)，5’端的報(bào)告基團(tuán)隨著熒光探針?biāo)舛撀湎聛?lái)，不再與淬滅基團(tuán)發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光信號(hào)；在熒光檢測(cè)過(guò)程中，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與擴(kuò)增產(chǎn)物形成完全同步，熒光量強(qiáng)弱與擴(kuò)增產(chǎn)物成正比；因此，熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物之間存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過(guò)對(duì)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為60～150ng/μL，更優(yōu)選的為70～120ng/μL，最優(yōu)選的為85～95ng/μL；

在本發(fā)明中，UvsY蛋白是重組蛋白，對(duì)目標(biāo)序列具有高度特異性，與重組酶、DNA聚合酶共同作用，完成等溫?cái)U(kuò)增，減少非特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的無(wú)本底背景的高效擴(kuò)增。

本發(fā)明所述的擴(kuò)增體系包括血吸蟲(chóng)DNA特異性引物，所述血吸蟲(chóng)DNA特異性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為200～600ng/μL，更優(yōu)選的為150～450ng/μL，最優(yōu)選的為180～220ng/μL；所述反向引物在擴(kuò)增體系中的濃度優(yōu)選的為200～600ng/μL，更優(yōu)選的為150～450ng/μL，最優(yōu)選的為180～220ng/μL。本發(fā)明中正向引物的序列為：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,反向引物序列為：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；在本發(fā)明中血吸蟲(chóng)DNA特異性引物能夠以血吸蟲(chóng)DNA為模板，進(jìn)行特異性核酸擴(kuò)增。

在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增體系由冷凍干燥粉末狀態(tài)的擴(kuò)增體系原料溶解得到，用于溶解所述擴(kuò)增體系原料的溶劑為反應(yīng)緩沖液。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)緩沖液為質(zhì)量濃度為5.5～6.5％、分子量為30000～40000的聚乙二醇水溶液。

在本發(fā)明中，所述血吸蟲(chóng)DNA作為等溫?cái)U(kuò)增的模板，體積優(yōu)選的為0.5～1.5μL，更優(yōu)選的為0.8～1.2μL，最優(yōu)選為1μL；所述血吸蟲(chóng)DNA的體積與擴(kuò)增體系體積比優(yōu)選的為(0.5～1.5):49，更優(yōu)選的為1:49；所述血吸蟲(chóng)DNA的濃度優(yōu)選的為10～100ng/μL，更優(yōu)選的為20～80ng/μL，最優(yōu)選的為40～60ng/μL。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的將所述擴(kuò)增體系與血吸蟲(chóng)DNA混合后進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。所述等溫?cái)U(kuò)增在恒溫條件下進(jìn)行，所述等溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～45℃，優(yōu)選的為37～42℃，更優(yōu)選的為38～41℃；所述等溫?cái)U(kuò)增的時(shí)間為5～20min，更優(yōu)選的為10～20min；所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選的在能夠檢測(cè)FAM熒光的儀器中進(jìn)行。

本發(fā)明在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中，利用熒光探針?lè)▽?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，當(dāng)目標(biāo)靶基因成功擴(kuò)增時(shí)，熒光探針發(fā)出熒光信號(hào)；在熒光檢測(cè)過(guò)程中，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與擴(kuò)增產(chǎn)物形成完全同步，熒光量強(qiáng)弱與擴(kuò)增產(chǎn)物成正比；因此，熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物之間存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過(guò)對(duì)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的等溫?cái)U(kuò)增體系，包括以下含量的組分：Tris緩沖液(0～60]mM、醋酸鉀50～150mM、醋酸鎂8～30mM、二硫蘇糖醇4～9mM、質(zhì)量濃度為5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、單鏈結(jié)合蛋白300～1000ng/μL、重組酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、熒光探針50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM；

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；熒光探針的序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

本發(fā)明提供的檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的等溫?cái)U(kuò)增體系與上述檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法中的擴(kuò)增體系相同，具體參見(jiàn)上述技術(shù)方案所述的擴(kuò)增體系的組成，在此不再贅述。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA的方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

樣品來(lái)源：由日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)提取的基因組DNA，DNA的濃度為50ng/μL。

設(shè)計(jì)以下血吸蟲(chóng)引物和探針，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成：

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。

熒光探針的序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

配制擴(kuò)增體系

在200μL離心管中按以下的配比進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增體系配制(體積為50μL)：

將以上配制好的擴(kuò)增體系在冷凍干燥機(jī)中負(fù)壓冷凍干燥成為粉未狀擴(kuò)增體系。

向離心管中加入終濃度為6％(w/v)的，分子量為35000的聚乙二醇作為反應(yīng)緩沖液將擴(kuò)增體系重新溶解成為49μL，再加入制備好的1μL血吸蟲(chóng)基因組DNA，混合均勻，瞬時(shí)離心，放入能夠檢測(cè)FAM熒光的儀器中，在39℃條件下反應(yīng)15分鐘。(注：為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，設(shè)置不加模板的體系作為陰性對(duì)照)。檢測(cè)結(jié)果如附圖1所示，由圖1可以看出，添加血吸蟲(chóng)DNA的樣品隨著等溫?cái)U(kuò)增熒光信號(hào)成對(duì)數(shù)曲線增長(zhǎng)，而陰性對(duì)照的熒光信號(hào)則不增長(zhǎng)。

實(shí)施例2

樣品來(lái)源：由日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)提取的基因組DNA，DNA的濃度為70ng/μL。

設(shè)計(jì)以下血吸蟲(chóng)引物和探針，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成：

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。

熒光探針的序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

配制擴(kuò)增體系

在200μL離心管中按以下的配比進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增體系配制(體積為100μL)：

將以上配制好的擴(kuò)增體系在冷凍干燥機(jī)中負(fù)壓冷凍干燥成為粉未狀擴(kuò)增體系。

向離心管中加入終濃度為6％(w/v)的，分子量為35000的聚乙二醇作為反應(yīng)緩沖液將擴(kuò)增體系重新溶解成為98μL，再加入制備好的2μL血吸蟲(chóng)基因組DNA，混合均勻，瞬時(shí)離心，放入能夠檢測(cè)FAM熒光的儀器中，在38℃條件下反應(yīng)15分鐘。(注：為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，設(shè)置不加模板的體系作為陰性對(duì)照)。通過(guò)觀察熒光信號(hào)強(qiáng)弱變化判斷樣品中是否存在血吸蟲(chóng)DNA。

實(shí)施例3

樣品來(lái)源：由日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)提取的基因組DNA，DNA的濃度為82ng/μL。

設(shè)計(jì)以下血吸蟲(chóng)引物和探針，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成：

正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,

反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。

熒光探針的序列為：

5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’

配制擴(kuò)增體系

在200μL離心管中按以下的配比進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增體系配制(體積為50μL)：

將以上配制好的擴(kuò)增體系在冷凍干燥機(jī)中負(fù)壓冷凍干燥成為粉未狀擴(kuò)增體系。

向離心管中加入終濃度為6％(w/v)的，分子量為35000的聚乙二醇作為反應(yīng)緩沖液將擴(kuò)增體系重新溶解成為49μL，再加入制備好的1μL血吸蟲(chóng)基因組DNA，混合均勻，瞬時(shí)離心，放入能夠檢測(cè)FAM熒光的儀器中，在39℃條件下反應(yīng)10分鐘。(注：為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，設(shè)置不加模板的體系作為陰性對(duì)照)。通過(guò)觀察熒光信號(hào)強(qiáng)弱變化判斷樣品中是否存在血吸蟲(chóng)DNA。

以上實(shí)施例說(shuō)明使用本發(fā)明的方法能夠快速檢測(cè)血吸蟲(chóng)DNA，操作簡(jiǎn)便，所用時(shí)間大大縮減，不需要大型儀器設(shè)備，不依賴(lài)熱循環(huán)儀，操作簡(jiǎn)單，能夠在較低的溫度(35～45℃)下對(duì)血吸蟲(chóng)DNA進(jìn)行檢測(cè)，并且擴(kuò)增所用時(shí)間短(5～20min)，熒光信號(hào)易于收集，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)，適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)的大規(guī)模篩選檢測(cè)。另外，本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、迅速，并且對(duì)檢測(cè)材料質(zhì)量要求低。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。