本發(fā)明屬于生物催化
技術領域：
，涉及一種生物催化拆分賴諾普利氫化物的方法。
背景技術：
：賴諾普利(lisinopril)，化學名稱為n-{n-[(s)-1-羧基-3-苯丙基]-l-賴氨酰}-l-脯氨酸，是依那普利拉的賴氨酸衍生物，1987年由默克公司研發(fā)上市的第三代血管緊張素ⅱ轉換酶抑制劑(angiotensin-convertingenzymeinhibitor，acei)，主要用于治療高血壓，抑制ace以減少血管緊張素i(angi)向血管緊張素ii(angii)的轉化，導致angii濃度降低，從而使angii的升壓作用及醛固酮分泌作用下降。還有降低左心室重量指數(shù)(lvmi)、改善左心室功能、降低急性心肌梗死患者死亡率，以及顯著降低尿白蛋白排泌率等作用。賴諾普利氫化物是合成賴諾普利工藝中的關鍵手性中間體，其有2個手性位點，分為(r,s)-型和(s,s)-型，合成賴諾普利后續(xù)反應所需的構型為(s,s)-型。本發(fā)明選用的賴諾普利氫化物為混合物，其(s,s)-型∶(r,s)-型含量比為2～3:1，二者的結構式如下。隨著醫(yī)藥技術的不斷發(fā)展，人們對手性藥物安全性的認識逐漸深入，手性藥物的市場不斷擴大，世界醫(yī)藥領域對手性藥物的開發(fā)正形成一股潮流。不對稱合成和拆分技術的研究已經(jīng)成為焦點，其中化學合成手性藥物是利用手性源、手性助劑、手性催化劑以及各種中間體等，通過不對稱合成得到手性藥物。盡管化學合成方法日趨成熟，但是手性藥物種類多樣、更新迅速，化學合成的應用有一定的局限性，并且化學合成方法造成的環(huán)境問題不容忽視。因此，利用生物系統(tǒng)的多樣性和安全性來獲得光學純藥物已成為另一選擇，特別是一些微生物產(chǎn)生酯酶/脂肪酶用于生產(chǎn)手性藥物的單一對映體是化學合成之外的重要途徑，已經(jīng)越來越受到人們關注。目前關于賴諾普利的合成路線主要是以3-苯甲酰丙烯酸乙酯為起始原料，與三氟乙酰賴氨酸在氫氧化鋰的作用下，發(fā)生不對稱加成反應，再經(jīng)pd/c氫化還原、環(huán)合、縮合、水解等反應過程制備得到，此工藝通過不對稱加成反應選擇性較低，(s,s)-型∶(r,s)-型含量比通常為75：25。為目前工業(yè)生產(chǎn)上采用的主要方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種生物催化拆分賴諾普利氫化物的方法，不同于傳統(tǒng)化學拆分法，獲得光學純度較高的(s,s)-賴諾普利氫化物，且將細胞固定化后減少產(chǎn)物中菌體自身降解產(chǎn)生的雜質，且易于分離。為達到上述的發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種生物催化拆分賴諾普利氫化物的方法，該方法以賴諾普利氫化物為底物原料，加入合適體積的水，在脂肪酶存在的條件下發(fā)生選擇性酯水解(r,s)-賴諾普利氫化物，保留(s,s)-賴諾普利氫化物；反應完全后，將混合液分離，獲得(s,s)-賴諾普利氫化物；所述脂肪酶采用通過不動桿菌(acinetobactersp.)cxzy-l119產(chǎn)生的胞內脂肪酶，該菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏編號：cctccno：m2016572。作為優(yōu)選，所述反應時間為4～36h、反應溫度為35～38℃，反應ph維持在7.0～7.3。作為再優(yōu)選，反應過程用15％na2co3(v/v)溶液進行調節(jié)ph。作為優(yōu)選，所述賴諾普利氫化物在反應體系濃度10～80g/l，優(yōu)選為40～60g/l。作為優(yōu)選，按體積比向反應液中加入1:0.1～0.2的助溶劑。作為在優(yōu)選，所述助溶劑選自甲醇、乙腈中的任一種。作為優(yōu)選，所述脂肪酶以固定化細胞重量計，所述固定化細胞量為5～40g/l，再優(yōu)選為5～25g/l。作為優(yōu)選，反應結束后，將上述反應液真空抽濾，保留固定化細胞以便重復使用，再將抽濾后得到的反應液35～60℃旋蒸除去助溶劑和水解副產(chǎn)物乙醇，調節(jié)ph為7.2～7.8，按體積比向反應液中加入1:0.7～1.5的乙酸乙酯，30～50℃保溫并攪拌2～4h，萃取1～3次，分層后保留有機相，將有機相合并，旋轉蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得固體濃縮物，(s,s)-賴諾普利氫化物。作為再優(yōu)選，固定化細胞可重復利用次數(shù)不低于15次。作為優(yōu)選，所述的脂肪酶采用通過不動桿菌(acinetobactersp.)cxzy-l119產(chǎn)生的胞內脂肪酶，該菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏編號：cctccno：m2016572。采用硅藻土吸附結合聚乙烯亞胺和戊二醛交聯(lián)法固定化不動桿菌(acinetobactersp.)cxzy-l119細胞。作為再優(yōu)選，所述脂肪酶制備方法為：(1)將不動桿菌acinetobactersp.cxzy-l119接種至lb培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1～2天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基濃度組成為：nacl10g/l，酵母浸出粉5.0g/l，蛋白胨10g/l，ph調節(jié)7.0，121℃滅菌20min；(2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基濃度組成為：nacl0.5g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，k2hpo41.0g/l，nh4no31.0g/l，蛋白胨10.0g/l，酵母浸出粉5.0g/l，橄欖油2.0g/l，121℃滅菌20min；(3)將種子液以體積濃度1％～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成：nacl0.5g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，k2hpo41.0g/l，nh4no31.0g/l，蛋白胨10.0g/l，酵母浸出粉5.0g/l，賴諾普利氫化物2g/l，115℃滅菌20min。當然，本發(fā)明的脂肪酶也可以選用市售的脂肪酶，優(yōu)選為胞內脂肪酶；市售的脂肪酶如amanoprotinapconc，lipaseays"amano"等。當在轉化效率和轉化率不及不動桿菌acinetobactersp.cxzy-l119菌體細胞。本發(fā)明還公開了不動桿菌(acinetobactersp.)cxzy-l119菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏編號：cctccno：m2016572。本發(fā)明還公開了上述的不動桿菌cxzy-l119菌株生產(chǎn)的胞內脂肪酶。包括上述的胞內脂肪酶的反應催化劑載體，其該反應催化劑載體采用硅藻土吸附結合聚乙烯亞胺和戊二醛交聯(lián)法固定化所述的不動桿菌cxzy-l119菌株細胞。本發(fā)明以脂肪酶為催化劑，在一定條件下進行立體選擇性酯水解(r,s)-賴諾普利氫化物，保留底物為(s,s)-賴諾普利氫化物，生物酶催化反應通常具有以下優(yōu)點：(1)高度立體專一性；(2)副反應少，產(chǎn)率高，產(chǎn)品分離提純簡單；(3)反應條件較溫和；(4)酶蛋白無毒，易降解，環(huán)境污染少，適于規(guī)模生產(chǎn)。進一步，將酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復多次使用，便于運輸和貯存，更有利于自動化生產(chǎn)。再進一步，本發(fā)明以固定化后的不動桿菌acinetobactersp.cxzy-l119菌體細胞為催化劑，底物轉化率達到31.2％，(s,s)-賴諾普利氫化物對映體過量值e.e.不低于98.1％。本發(fā)明具有催化效率高、立體選擇性好、酶與底物易于分離且酶可重復使用、成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)點。附圖說明圖1為催化拆分混旋賴諾普利氫化物0h的出峰圖譜。圖2為催化拆分混旋賴諾普利氫化物3h的出峰圖譜。圖3為催化拆分混旋賴諾普利氫化物6h的出峰圖譜。圖4為隨著重復固定化細胞使用次數(shù)增加相對酶活的變化圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：實施例1：生物催化劑的制備(1)將不動桿菌acinetobactersp.cxzy-l119接種至lb培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1～2天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基濃度組成為：nacl10g/l，酵母浸出粉5.0g/l，蛋白胨10g/l，ph調節(jié)7.0，121℃滅菌20min；(2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基濃度組成為：nacl0.5g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，k2hpo41.0g/l，nh4no31.0g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸出粉5.0g/l，橄欖油2.0g/l，121℃滅菌20min；(3)將種子液以體積濃度1％～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成：nacl0.5g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，k2hpo41.0g/l，nh4no31.0g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸出粉5.0g/l，賴諾普利氫化物2g/l，115℃滅菌20min。(4)本發(fā)明采用硅藻土吸附結合聚乙烯亞胺和戊二醛交聯(lián)法固定化不動桿菌acinetobactersp.cxzy-l119細胞，單一用硅藻土吸附酶或細胞在使用中因酶與載體結合不牢極易脫落；戊二醛是一種雙功能交聯(lián)劑，它的兩個醛基分別與蛋白質的氨基形成希夫氏堿，中間以五個碳原子連接在一起從而使蛋白質-蛋白質(菌體-菌體)之間共價交聯(lián)，聚乙烯亞胺具有高附著性和吸附性且聚乙烯亞胺的氨基與戊二醛的醛基同樣與合形成致密的網(wǎng)狀結構將菌體細胞包裹，硅藻土除了具有吸附作用也為菌體細胞提供了附著點，因此采用吸附-交聯(lián)結合的固定化方法使載體與細胞結合更加牢固。具體為：取上述獲得的濕菌體80g于1l轉化瓶中，加入800ml水與5g硅藻土攪拌，待攪拌均勻后加入25ml5％聚乙烯亞胺溶液交聯(lián)1h，再加入25％戊二醛溶液攪拌1h后真空抽濾，得到固定化細胞，再用水洗滌三次抽濾，于4℃保存?zhèn)溆?。實施?：反應液監(jiān)測方法將反應液用5％的na2co3溶液調至ph7.5左右，用乙酸乙酯萃取，保留上層有機相，取適量上層有機相，氮氣吹干，加入流動相溶解，混勻后用0.45μm的微孔濾膜過濾，待進樣。hplc分析條件：流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸＝50∶50∶0.1；流速：lml/min；檢測紫外波長：210nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl；c18色譜柱(5μm，4.6×250nm)。(s,s)-賴諾普利氫化物對映體過量值e.e.及底物轉化率按以下公式計算：公式1：公式2：式中，[a]ss和[a]rs分別為液相色譜測得樣品中底物ss和rs型的峰面積，ee為(s,s)-賴諾普利氫化物對映體過量值，cs為反應開始時底物的摩爾濃度，cs1為剩余底物摩爾濃度，c為轉化率。實施例3：賴諾普利氫化物小試催化工藝300ml催化反應體系：混旋的賴諾普利氫化物濃度50g/l；甲醇30ml作為助溶劑：實施例1制備的生物催化劑10g。在500ml的轉化瓶中加入混旋的賴諾普利氫化物15g，加入30ml甲醇開啟攪拌溶解，再加入270ml水，用na2co3溶液(15％，v/v)將ph調節(jié)至7.2左右。轉化溫度37℃，加入實施例1制備的固定化細胞10g，開始轉化。用na2co3溶液(15％，v/v)將ph維持在7.0～7.3。利用hplc檢測反應轉化結果，見表以及附圖。表1生物拆分賴諾普利氫化物結果催化時間轉化率c對映體過量值e.e剩余底物主要構型0h0％33.3％(s,s)、(r,s)3h15.2％58.8％(s,s)、(r,s)6h32.1％98.1％(s,s)實施例4：游離細胞和固定化細胞催化賴諾普利氫化物對比分別取以實施例1方法中(1)～(3)步制備濕菌體7.5g，以及通過第(4)步制備固定化細胞10g(濕菌體含量為7.5g)作為催化劑，其他操作同實施例3，對賴諾普利氫化物進行催化反應3h，游離細胞作為催化劑的平均轉化率比固定化細胞平均轉化率提高了26.1％，如表2。這說明固定化細胞由于吸附于硅藻土上相較于游離酶減少了與底物接觸的機會，且由于交聯(lián)等化學反應破壞了部分酶蛋白，損失了部分酶活，但鑒于固定化細胞可以重復利用、穩(wěn)定性好、易分離的優(yōu)點仍選擇固定化細胞作為生物催化劑。表2游離細胞和固定化細胞催化結果轉化率c對映體過量值e.e水解主要構型游離細胞19.8％67.5％(r,s)固定化細胞15.7％57.9％(r,s)實施例5：固定化細胞重復使用酶活穩(wěn)定性取5g固定化細胞加入含10g/l混旋的賴諾普利氫化物的水溶液中，反應體系150ml，用na2co3溶液(15％，v/v)將ph維持在7.0～7.3，37℃反應10min，取適量反應液強酸終止反應，液相檢測底物的消耗量。將反應液通過抽濾分離固定化細胞，按照與上述相同的轉化條件用于下次催化反應，重復15次。酶活力的計算方法：在特定的檢測條件下，轉化混旋體賴諾普利氫化物1min消耗1μmol/l的(r,s)-賴諾普利氫化物所需要的酶量為一個酶活單位(u)；相對酶活：以第一次反應酶活u1為最高定為100％，分別計算其他重復次數(shù)酶活，例如第n次酶活為un，則酶重復使用n次時的相對酶活算按下面公式計算：公式3：圖4為固定化細胞重復使用15次后相對酶活的變化圖，從圖中可以看出隨著固定化細胞的重復使用，相對酶活整體呈下降趨勢，使用15次后仍保留70％的酶活，固定化效果較為理想。當前第1頁12