本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人參皂苷是從人參及其同屬植物(如三七、西洋參等)中分離到的皂苷的總稱，屬于三萜類皂苷，是人參中的主要有效成份。目前，已經(jīng)從人參中分離出了至少60種皂苷，其中一些人參皂苷被證實具有廣泛的生理功能和藥用價值：包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、護心、護肝等功能。從結(jié)構(gòu)上來看，人參皂苷是皂苷元經(jīng)過糖基化后形成的生物活性小分子。人參皂苷的皂苷元只有有限的幾種，主要是達(dá)瑪烷型的原人參二醇和原人參三醇，以及齊墩果烷酸。近年來，人們又從三七中分離到了新的皂苷元，25-oh-ppd和25-och3-ppd，這些新的皂苷元都具有非常好的抗腫瘤活性。皂苷元通過糖基化后，可以提高水溶性，并產(chǎn)生出不同的生理活性。原人參二醇型皂苷的糖鏈一般結(jié)合在皂苷元的c3(和)或c20的羥基上。原人參三醇皂苷與原人參二醇皂苷相比，在c6位多一個羥基，目前發(fā)現(xiàn)的原人參三醇型皂苷都是在c6(和)或c20的羥基上結(jié)合糖基化，在c3上結(jié)合糖基的原人參三醇型皂苷尚未見報道。糖基可以是葡萄糖、鼠李糖、木糖、和阿拉伯糖。不同的糖基結(jié)合位點，糖鏈組成和長度使人參皂苷在生理功能和藥用價值上產(chǎn)生極大的差異。例如，人參皂苷rb1，rd和rc都是以原人參二醇為皂苷元的皂苷，它們之間的差別只是糖基修飾上的差別，但它們之間的生理功能就有很多的差別。rb1有穩(wěn)定中心神經(jīng)元系統(tǒng)的功能，而rc的功能卻是抑制中心神經(jīng)元系統(tǒng)的功能，rb1的生理功能非常廣泛，而rd卻只有非常有限的幾種功能。人參皂苷皂苷元和皂苷之間的結(jié)構(gòu)多樣性還體現(xiàn)在空間立體結(jié)構(gòu)上，雖然四環(huán)三萜的骨架上存在很多的手性碳原子，但是能夠產(chǎn)生空間立體結(jié)構(gòu)的主要是在c20位上。幾乎每種人參皂苷和皂苷元都存在c20位的差向異構(gòu)體。在人參中，c20位s構(gòu)型的人參皂苷和皂苷元含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于c20位r構(gòu)型的人參皂苷和皂苷，所以一般情況下所說的人參皂苷和皂苷元都指的c20位s構(gòu)型的人參皂苷和皂苷元。但是，人參皂苷和皂苷元c20位的差向異構(gòu)體具有明顯不同的生理活性。例如，s構(gòu)型人參皂苷rh2(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-20(s)-protopanaxadiol)可以明顯抑制前列腺癌細(xì)胞，但是r構(gòu)型人參皂苷rh2(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-20(r)-protopanaxadiol)的抑制效果卻很差。r構(gòu)型人參皂苷rh2可以選擇性地抑制破骨細(xì)胞的生成且沒有任何細(xì)胞毒性作用，但是s構(gòu)型人參皂苷rh2抑制破骨細(xì)胞生成的作用很弱，但是對破骨細(xì)胞卻有很強的細(xì)胞毒性作用。并且s構(gòu)型和r構(gòu)型人參皂苷rh2對于p-糖蛋白的調(diào)節(jié)作用也存在很大的差異。糖基轉(zhuǎn)移酶的功能是將糖基供體(核苷二磷酸糖，例如udp-葡萄糖)上的糖基轉(zhuǎn)移到不同的糖基受體上。根據(jù)氨基酸序列的不同，目前糖基轉(zhuǎn)移酶已有94個家族。目前已測序的植物基因組中，發(fā)現(xiàn)了上百種以上不同的糖基轉(zhuǎn)移酶。這些糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基受體包括糖、脂、蛋白、核酸、抗生素和其它的小分子。在人參中參與皂苷糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶，其作用是把糖基供體上的糖基轉(zhuǎn)移到皂苷元或者苷元的c-3、c-6或c-20的羥基上，從而形成具有不同藥用價值的皂苷。目前，通過對人參，花旗參和三七的轉(zhuǎn)錄組分析，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但是還不明確哪些糖基轉(zhuǎn)移酶參與了人參皂苷的合成。由于人參中含有數(shù)量眾多的糖基轉(zhuǎn)移酶，且它們的含量都很低，所以它們的分離純化的研究進展緩慢。稀有人參皂苷是指在人參中含量極低的皂苷。人參皂苷ck(20-o-β-(d-glucopyranosyl)-20(s)-protopanaxadiol)屬于原人參二醇類的皂苷，在皂苷元的c-20位羥基上連有一個葡萄糖基。人參皂苷ck在人參中含量極低，它是原人參二醇型皂苷在人體腸道中被微生物水解后產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物。研究表明，多數(shù)原人參二醇型皂苷只有被代謝為ck后才能被人體吸收，所以人參皂苷ck是直接被體內(nèi)吸收和發(fā)揮作用的真正實體，而其他皂苷只是藥物前體。人參皂苷ck具有很好的抗腫瘤活性，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。它與放療和化療結(jié)合試驗，可以增強放療和化療的效果。除此之外，人參皂苷ck還有具有抗過敏活性，抗炎活性，并且可以起到神經(jīng)保護作用，抗糖尿病作用和抗皮膚衰老作用。人參皂苷ck的藥理活性具有多靶點、高活性和低毒性的特點。人參皂苷f1(20-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol)屬于原人參三醇型皂苷，它在人參中的含量也非常低，也屬于稀有人參皂苷。人參皂苷f1的結(jié)構(gòu)與ck非常接近，也是在皂苷元的c-20位羥基上連有一個葡萄糖基。人參皂苷f1也具有獨特的藥用價值。它具有抗衰老和抗氧化的功能。人參皂苷rh1(6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol)屬于原人參三醇型皂苷，它在人參中的含量也非常低，也屬于稀有人參皂苷。人參皂苷rh1的結(jié)構(gòu)與f1非常接近，但是它的糖基化位點是在c6位上的羥基。人參皂苷rh1也具有特殊的生理功能，能夠抗過敏和抗炎癥。人參皂苷rh2(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-20(s)-protopanaxadiol)在人參中含量極低，它的含量大約只有人參干重的萬分之一左右，也屬于稀有人參皂苷。但是，人參皂苷rh2具有良好的抗腫瘤活性，是人參中最主要的抗腫瘤活性成分之一，能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤轉(zhuǎn)移。研究表明人參皂苷rh2能夠抑制lungcancercells3ll(mice)，morrislivercancercells(rats)，b-16melanomacells(mice)，以及helacells(human)的增值。在臨床上，人參皂苷rh2與放療或化療結(jié)合治療，可以增強放療和化療的效果。此外，人參皂苷rh2還具有抗過敏，提高機體免疫力的功能，抑制no和pge產(chǎn)生的炎癥等作用。人參皂苷rg3在人參中含量也很低，具有明顯的抗腫瘤的作用，與人參皂苷rh2在抗腫瘤的功能方面有互補性，臨床使用證明，rg3與rh2聯(lián)合使用其治療腫瘤的增效作用進一步提高。由于稀有人參皂苷ck、f1、rh1，rh2和rg3的含量非常低，所以目前生產(chǎn)的方法是從人參中的大量皂苷出發(fā)，通過選擇性水解糖基的方法進行轉(zhuǎn)化后再進行提取和純化。以人參屬植物的總皂苷或原人參二醇類皂苷為原料，轉(zhuǎn)化、分離和提取20(s)-原人參皂苷-rh2。該制備方法的優(yōu)點是利用了大量的二醇類皂苷，但是需在高溫和高壓下反應(yīng)(宋長春等.20(s)-人參皂苷-rh2的制備方法及其藥物組合物及應(yīng)用[p].中國專利：1225366，1999年)。韓國人參煙草研究所公開了2種從人參成分中制備20(r&s)-人參皂苷-rh2的方法。其特征在于首先得到原人參二醇皂苷組分，再經(jīng)酸水解處理得20(r&s)-人參皂苷-rg3，然后將人參皂苷rg3處理得到人參皂苷rh2。以上這些方法主要缺陷在于產(chǎn)物的起始材料需要原人參二醇類系列單體皂苷，使得反應(yīng)步驟較繁瑣，原料損失較大，操作繁瑣，從而導(dǎo)致成本增加，而且難以提高產(chǎn)率。由于ck和f1在c-20位的糖基容易在水解過程中被破壞，所以化學(xué)法不適用于ck和f1的生產(chǎn)。而酸法和堿法水解皂苷制備rh1的產(chǎn)率很低，而且還存在很多副產(chǎn)物。由于酶轉(zhuǎn)化法的條件溫和，專一性強、產(chǎn)物易分離純化的特點，是目前生產(chǎn)ck、f1和rh1的主要方法。用于制備人參皂苷ck，f1、rh1和rh2的酶主要有柚苷酶、果膠酶、纖維素酶及乳糖酶等。人參皂苷ck也可以通過微生物轉(zhuǎn)化的方法獲得，主要是利用腸道來源的厭氧菌。雖然，生物轉(zhuǎn)化法(酶法和微生物法)制備稀有人參皂苷ck、f1、rh1和rh2取得了很大的進步，但是由于其原料為人參皂苷，所以制備ck、f1、rh1和rh2的成本仍然非常高，并且其產(chǎn)量也相當(dāng)有限(中國專利：cn1105781c；金東史等，大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2001年)。由于人參皂苷rh2的重要生物活性和巨大的經(jīng)濟價值，幾十年來人們也一直嘗試?yán)没瘜W(xué)合成的方法來生產(chǎn)這種皂苷，其基本思路是由原人參二醇和相應(yīng)糖基縮和而成，即半合成法(日本專利：特開平8-208688,1996年)。該方法以原人參二醇為原料半合成20(s)-原人參皂苷-rh2，其合成步驟分為六步，且在糖苷化反應(yīng)中使用了當(dāng)量的碳酸銀作為催化劑，價格貴重使得該方法的成本較高，同時該催化劑的立體選擇性不高，產(chǎn)物得率低。另一種方法利用了芳香烴類的?；蛲榛〈藚⒍糲-12位羥基，再在有機溶劑和惰性氣體的保護下，加入活化了c-1為羥基的葡萄糖基供體，在分子篩存在和路易斯酸的催化下生發(fā)生縮合反應(yīng)，生成的產(chǎn)物經(jīng)過柱層析或重結(jié)晶純化后出去保護基團，得到20(s)-人參皂苷-rh2(惠永正等，20(s)-人參皂苷-rh2的制備方法，中國專利：cn1587273a，2005年)目前本領(lǐng)域尚缺乏一種有效的生產(chǎn)稀有人參皂苷ck、f1、rh1、rh2和rg3的方法，因此迫切需要開發(fā)多種特異高效的糖基轉(zhuǎn)移酶。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是提供一組糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外糖基化方法，包括步驟：在糖基轉(zhuǎn)移酶存在下，將糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的以下位點上：c-20位、c-6位、c-3位上或c-3位的第一個糖基上；從而形成糖基化的四環(huán)三萜類化合物；其中，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶選自：如seqidnos.:22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示的糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的多肽，所述的多肽選自下組：(a)具有seqidnos.:26、28、41、43、55、57、59或61中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b)將seqidnos.:26、28、41、43、55、57、59或61中任一條所示氨基酸序列的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信號肽序列后形成的、并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽；(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；(d)氨基酸序列與seqidnos：26、28、41、43、55、57、59或61中任一條中所示氨基酸序列的同源性≥85％或≥90％(較佳地≥95％)，并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的序列(c)為由(a)或(b)添加了標(biāo)簽序列、信號序列或分泌信號序列后所形成的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽為seqidnos.:26、28、41、43、55、57、59或61所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的多肽，所述的多肽選自下組：(a1)具有seqidnos.:22、24中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b1)序列中含有(a1)中所述多肽序列的多肽；和/或所述的多肽選自下組：(a2)具有seqidnos.:4或6中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b2)將seqidnos.:4或6中任一條所示氨基酸序列的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信號肽序列后形成的、并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽；(c2)序列中含有(b2)中所述多肽序列的衍生多肽；(d2)氨基酸序列與seqidnos.:4或6中任一條中所示氨基酸序列的同源性≥85％(較佳地≥95％)，并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的序列(c2)為由(a2)或(b2)添加了標(biāo)簽序列、信號序列或分泌信號序列后所形成的融合蛋白。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸為選自下組的序列：(a)編碼第一或第二方面所述多肽的核苷酸序列；(b)編碼如seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示多肽的核苷酸序列；(c)如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示的核苷酸序列；(d)與seqidnos.:15、17、19、21、27、40、42、54、56、58或60所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)的核苷酸序列；(e)在seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸所形成的核苷酸序列；(f)與(a)-(e)任一所述的核苷酸序列互補(較佳地完全互補)的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸的序列如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示。在另一優(yōu)選例中，序列如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示的多核苷酸編碼氨基酸序列分別如seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述的載體含有第三方面所述的多核苷酸。較佳地，所述載體包括表達(dá)載體、穿梭載體、整合載體。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明第一或第二方面所述分離的多肽的用途，它被用于催化以下一種或多種反應(yīng)，或被用于制備催化以下一種或多種反應(yīng)的催化制劑：將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物c-20位和/或c-6位和/或c-3位的羥基以替換所述羥基的h，以及將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的c-3位的第一個糖基上以延伸糖鏈。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體包括選自下組的核苷二磷酸糖：udp-葡萄糖，adp-葡萄糖，tdp-葡萄糖，cdp-葡萄糖，gdp-葡萄糖，udp-乙?；咸烟牵琣dp-乙?；咸烟?，tdp-乙?；咸烟?，cdp-乙?；咸烟?，gdp-乙?；咸烟牵瑄dp-木糖，adp-木糖，tdp-木糖，cdp-木糖，gdp-木糖，udp-半乳糖醛酸，adp-半乳糖醛酸，tdp-半乳糖醛酸，cdp-半乳糖醛酸，gdp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，adp-半乳糖，tdp-半乳糖，cdp-半乳糖，gdp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，adp-阿拉伯糖，tdp-阿拉伯糖，cdp-阿拉伯糖，gdp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，adp-鼠李糖，tdp-鼠李糖，cdp-鼠李糖，gdp-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體包括選自下組的尿苷二磷酸(udp)糖：udp-葡萄糖，udp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述分離的多肽用于催化下述一種或多種反應(yīng)或被用于制備催化下述一種或多種反應(yīng)的催化制劑：(a)其中，r1為h，單糖糖基或多糖糖基；r2和r3為h或oh；r4為糖基；所述的多肽選自seqidno：2、16或18或其衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的單糖包括葡萄糖(glc),鼠李糖(rha),乙?；咸烟?glc(6)ac),阿拉伯呋喃糖(araf),阿拉伯吡喃糖(arap),木糖(xyl)等。在另一優(yōu)選例中，所述的多糖包括glc(2-1)glc,glc(6-1)glc,glc(6)ac,glc(2-1)rha,glc(6-1)arap,glc(6-1)xyl,glc(6-1)araf,glc(3-1)glc(3-1),glc(2-1)glu(6)ac,glc(6-1)arap(4-1)xyl,glc(6-1)arap(2-1)xyl,或glc(6-1)arap(3-1)xyl等2-4個單糖組成的多糖。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物ppdhhoh糖基ckrh21個糖基hoh糖基f2rg32個糖基hoh糖基rdppthohoh糖基f1dmhhh糖基20-g-dm即當(dāng)所述的r1，r2都為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為原人參二醇(ppd)r1為一個葡萄糖基，r2為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為人參皂苷rh2r1為兩個葡萄糖基，r2為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為人參皂苷rg3r1為h，r2為oh，r3為oh，所述的式(i)化合物為原人參三醇(ppt)r1為h，r2為h，r3為h，所述的式(i)化合物達(dá)瑪烯二醇(dm)(b)其中，r1為h或者糖基，r2糖基，r3為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:2、16、18或20或其衍生多肽；或，r1為h或者糖基；r2為h；r3為糖基，所述的多肽選自seqidno.:20或其衍生多肽。r1-r3經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3產(chǎn)物f1h糖基糖基rg1ppthh糖基rh1即當(dāng)r1，r2都為h時，所述的式(iii)化合物為原人參三醇(ppt)。r1為h，r2為葡萄糖基時，所述的式(iii)化合物為人參皂苷f1。(c)其中，r1為h或者oh；r2為h或者oh；r3為h或者糖基；r4為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物ppdhohh糖基rh2ckhoh糖基糖基f2pptohohh糖基3-g-pptf1ohoh糖基糖基3-g-f1dmhhh糖基3-g-dm即當(dāng)r1和r3都為h，r2為oh時，所述的式(v)化合物為原人參二醇(ppd)；r1為h，r2為oh,r3為葡萄糖基時，所述的式(v)化合物為人參皂苷ck；r1為oh，r2為oh，r3為h時，所述的式(v)化合物為原人參三醇(ppt)；r1為oh，r2為oh，r3為葡萄糖基時，所述的式(v)化合物為人參皂苷f1；r1為h，r2為oh，r3為為h時，所述的式(v)化合物為達(dá)瑪烯二醇(dm)。當(dāng)?shù)孜餅閜pd時，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽；當(dāng)?shù)孜餅閏k時，所述的多肽選自seqidnos.:22、24或43或其衍生多肽；當(dāng)?shù)孜餅閜pt時，所述的多肽選自seqidnos.:22、24或41或其衍生多肽；當(dāng)?shù)孜餅閒1和dm時，所述的多肽選自seqidnos.:22或24或其衍生多肽。(d)其中，r1為oh或者och3；r2為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽。r1-r2經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2產(chǎn)物25-oh-ppdoh糖基3-g-25-oh-ppd25-och3-ppdoch3糖基3-g-25-och3-ppd即當(dāng)r1為oh時，所述的式(vii)化合物為25-oh-ppd；r1為och時，所述的式(vii)化合物為25-och3-ppd。(e)其中，r1為糖基；r2和r3為oh或者h(yuǎn)；r4為糖基或者h(yuǎn)；r5為糖基，r5-r1-o為c3第一個糖基衍生的糖基，所述的多肽選自seqidnos.:26、28、55、57、59或61或其衍生多肽。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物rh2糖基hohhrg3f2糖基hoh糖基rd即當(dāng)r1為葡萄糖基；r2為h，r3為oh，r4為h，式(ix)化合物為rh2。r1為葡萄糖基；r2為h，r3為oh，r4為葡萄糖基，式(ix)化合物為f2。(f)所述的多肽選自seqidno:22或seqidno:24或其衍生多肽。式(xi)化合物為羊毛甾醇(lanosterol)，并且式(xii)化合物為3-o-β-(d-glucopyranosyl)-lanosterol。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基選自：葡萄糖基、半乳糖醛酸基、半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基，以及其他己糖基或戊糖基。在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)式(i)、(iii)、(v)、(vii)，(ix)或者(xi)化合物包括(但不限于)：s構(gòu)型或r構(gòu)型的達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類化合物、羊毛脂烷型四環(huán)三萜類化合物、甘遂烷型四環(huán)三萜類化合物、環(huán)阿屯烷(環(huán)阿爾廷烷)型四環(huán)三萜類化合物、葫蘆烷四環(huán)三萜類化合物、或楝烷型四環(huán)三萜類化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽選自下組：(a)具有seqidnos.:26、28、41、43、55、57、59或61中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b)將seqidnos.:26、28、41、43、55、57、59或61中任一條所示氨基酸序列的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信號肽序列后形成的、并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽；(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；(d)氨基酸序列與seqidno：26、28、41、43、55、57、59或61中任一條中所示氨基酸序列的同源性≥85％或≥90％(較佳地≥95％)，并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽選自下組：(a1)具有seqidnos.:22、24中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b1)序列中含有(a1)中所述多肽序列的多肽；和/或所述的多肽選自下組：(a2)具有seqidnos.:4或6中任一條所示氨基酸序列的多肽；(b2)將seqidnos.:4或6中任一條所示氨基酸序列的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信號肽序列后形成的、并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽；(c2)序列中含有(b2)中所述多肽序列的衍生多肽；(d2)氨基酸序列與seqidnos.:4或6中任一條中所示氨基酸序列的同源性≥85％(較佳地≥95％)，并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，編碼所述多肽的核苷酸所述的多核苷酸為選自下組的序列：(a)編碼本發(fā)明第一或第二方面所述多肽的核苷酸序列；(b)編碼如seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示多肽的核苷酸序列；(c)如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示的核苷酸序列；(d)與seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)的核苷酸序列；(e)在seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸所形成的核苷酸序列；(f)與(a)-(e)任一所述的核苷酸序列互補(較佳地完全互補)的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸的序列如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示。在另一優(yōu)選例中，序列如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示的多核苷酸編碼氨基酸序列分別如seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示的多肽。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種進行糖基轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)的方法，包括步驟：在本發(fā)明第二或第三方面所述的多肽或其衍生多肽存在的條件下，進行糖基轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：在糖基供體以及如本發(fā)明第二方面或第三方面所述多肽及其衍生多肽的存在下，將所述的式(i)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(ii)化合物，或式(iii)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(iv)化合物，或式(v)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(vi)化合物，或式(vii)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(viii)化合物，或式(ⅸ)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(x)化合物，或式(xi)化合物轉(zhuǎn)化為所述的式(xii)化合物；在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括將所述的多肽及其衍生多肽分別加入催化反應(yīng)；和/或?qū)⑺龅亩嚯募捌溲苌嚯耐瑫r加入催化反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括在糖基供體以及如本發(fā)明第二方面和第三方面所述多肽及其衍生多肽中兩種以上多肽共同存在的條件下，將式(i)化合物轉(zhuǎn)化為式(iv)，(vi)，(viii)，(x)的化合物，或者式(iii)化合物轉(zhuǎn)化為式(ii)，(vi)，(viii)，(x)的化合物；或者式(v)化合物轉(zhuǎn)化式(ii)，(iv)，(viii)，(x)的化合物，或者式(vii)化合物轉(zhuǎn)化式(ii)，(iv)，(vi)，(x)的化合物，或者(ix)化合物轉(zhuǎn)化式(ii)，(iv)，(vi)，(viii)的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括將編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列與達(dá)瑪稀二醇和/或原人參二醇和/或原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，從而獲得所述的式(ii)，(iv)，(vi)，(viii)、(x)或(xii)化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為酵母菌或大腸桿菌。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽為具有seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示氨基酸序列的多肽及其衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，編碼所述多肽的核苷酸序列如seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：向反應(yīng)體系中提供用于調(diào)節(jié)酶活性的添加物。在另一優(yōu)選例中，所述的用于調(diào)節(jié)酶活性的添加物是：提高酶活性或抑制酶活性的添加物。在另一優(yōu)選例中，所述的用于調(diào)節(jié)酶活性的添加物選自下組：ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+、或fe2+。在另一優(yōu)選例中，所述的用于調(diào)節(jié)酶活性的添加物是：可以生成ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+、或fe2+的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體是核苷二磷酸糖，選自下組：udp-葡萄糖，adp-葡萄糖，tdp-葡萄糖，cdp-葡萄糖，gdp-葡萄糖，udp-乙?；咸烟?，adp-乙?；咸烟?，tdp-乙?；咸烟?，cdp-乙?；咸烟?，gdp-乙?；咸烟?，udp-木糖，adp-木糖，tdp-木糖，cdp-木糖，gdp-木糖，udp-半乳糖醛酸，adp-半乳糖醛酸，tdp-半乳糖醛酸，cdp-半乳糖醛酸，gdp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，adp-半乳糖，tdp-半乳糖，cdp-半乳糖，gdp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，adp-阿拉伯糖，tdp-阿拉伯糖，cdp-阿拉伯糖，gdp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，adp-鼠李糖，tdp-鼠李糖，cdp-鼠李糖，gdp-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體是尿苷二磷酸糖，選自下組：udp-葡萄糖，udp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其組合。在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)體系的ph為：ph4.0-10.0，優(yōu)選ph為5.5-9.0。在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)體系的溫度為：10℃-105℃，優(yōu)選20℃-50℃。在另一優(yōu)選例中，所述的達(dá)瑪稀二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因。在另一優(yōu)選例中，所述的原人參二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因和p450cyp716a47的還原酶基因，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因、p450cyp716a47的還原酶基因、及細(xì)胞色素p450cyp716a53v2基因及其還原酶基因，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述糖基催化反應(yīng)的底物為式(i)、(iii)、(v)、(vii)、(ix)或(xi)化合物，且所述的底物為(ii)、(iv)、(vi)、(viii)、(x)或(xii)化合物；在另一優(yōu)選例中，所述的式(i)化合物為原人參二醇ppd(protopanaxadiol)，并且式(ii)化合物為人參皂苷ck(20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(20-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))；或，所述的式(i)化合物為人參皂苷rh2(3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))，并且式(ii)化合物為人參皂苷f2(3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-20-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))；或，所述的式(i)化合物為人參皂苷rg3，并且式(ii)化合物為人參皂苷rd；或，所述的式(i)化合物為原人參三醇ppt(protopanaxatriol)，并且式(ii)化合物為人參皂苷f1(20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參三醇)(20-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxatriol))；或，所述的式(i)化合物為達(dá)瑪烯二醇dm(dammarenediolii)，并且式(ii)化合物為人參皂苷20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-達(dá)瑪烯二醇(20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarenediolii；或，所述的式(iii)化合物為原人參三醇ppt，并且式(iv)化合物為人參皂苷rh1(6-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參三醇)(6-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxatriol))；或，所述的式(iii)化合物為人參皂苷f1，并且式(iv)化合物為人參皂苷rg1(6-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(6-o-β-(d-glucopyranosyl)-20-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))；或，所述的式(v)化合物為原人參二醇，并且式(vi)化合物為人參皂苷rh2(3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))；或，所述的式(v)化合物為ck，并且式(vi)化合物為人參皂苷f2(3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-20-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參二醇)(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-20-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))；或，所述的式(v)化合物為原人參三醇ppt，并且式(vi)化合物為人參皂苷3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-原人參三醇(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)；或，所述的式(v)化合物為人參皂苷f1，并且式(vi)化合物為人參皂苷3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-f1(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1)；或，所述的式(v)化合物為達(dá)瑪烯二醇dm，并且式(vi)化合物為人參皂苷3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-達(dá)瑪烯二醇(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarenediolii)；或，所述的式(vii)化合物為25-oh-原人參二醇(25-oh-protopanaxadiol)，并且式(viii)化合物為人參皂苷3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-25-oh-原人參二醇(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-protopanaxadiol)；或，所述的式(vii)化合物為25-och3-原人參二醇(25-och3-protopanaxadiol)，并且式(viii)化合物為人參皂苷3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-25-och3-原人參二醇(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-och3-protopanaxadiol)；或，所述的式(ix)化合物為人參皂苷rh2，并且式(x)化合物為人參皂苷rg3；或，所述的式(ix)化合物為人參皂苷f2，并且式(x)化合物為人參皂苷rd?；?，所述的式(xi)化合物為羊毛甾醇(lanosterol)，并且式(xii)化合物為3-o-β-(d-吡喃葡萄糖基)-羊毛甾醇(3-o-β-(d-glucopyranosyl)-lanosterol)。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第五方面所述的載體，或其基因組中整合本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶為如本發(fā)明第二或第三方面中所述的多肽或其衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，編碼所述糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列如本發(fā)明第四方面所述。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞原核細(xì)胞，如大腸桿菌。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為人參細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞不是天然產(chǎn)生式(ii)，(iv)，(vi)，(viii)，(x)，(xii)化合物的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞不是天然產(chǎn)生稀有人參皂苷ck和/或稀有人參皂苷f1和/或稀有人參皂苷rh2和/或rg3和/或rh1，和/或新的人參皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dm、3-o-β-d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-och3-ppd，以及和/或rh1、f2、rd和rg1等的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的達(dá)瑪稀二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞含有原人參二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因、和p450cyp716a47的還原酶基因，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞含有原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因、p450cyp716a47的還原酶基因、及細(xì)胞色素p450cyp716a53v2基因，或其組合。在本發(fā)明的第八方面，提供了第七方面所述的宿主細(xì)胞的用途，用于制備酶催化試劑，或生產(chǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶、或作為催化細(xì)胞、或產(chǎn)生式(ii)，(iv)，(vi)，(viii)，(x)或(xii)，化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞用于通過對達(dá)瑪稀二醇(dm)和/或原人參二醇(ppd)和/或原人參三醇(ppt)的糖基化反應(yīng)，生產(chǎn)新皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii和/或3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)–protopanaxatriol、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1和/或稀有人參皂苷ck和/或稀有人參皂苷f1和/或稀有人參皂苷rh1和/或稀有人參皂苷rh2和/或稀有人參皂苷rg3。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟：將第七方面所述的遺傳工程化的宿主細(xì)胞再生為植物，并且所述的遺傳工程化的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的遺傳工程化的宿主細(xì)胞為人參細(xì)胞。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1為ggt25基因，ggt25-1基因，ggt25-3和ggt25-5基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖2為sds-page檢測ggt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，蛋白marker的電泳結(jié)果(分子量由上到下依次為200、116、97.2、66.4、44.3kda)；泳道2，gt25-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，gt25-1-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道4，gt25-3-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道5，gt25-5-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道6,pyes2空載體重組子的裂解液上清。圖3顯示westernblot檢測ggt25，ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5基因在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，gt25-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道2，gt25-1-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道4，gt25-3-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道5，gt25-5-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，pyes2空載體重組子的裂解液上清。圖4為sds-page檢測ggt13和ggt30在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，gt30-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道2，gt13-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，空載體pyes2重組子的裂解液上清。圖5顯示westernblot檢測ggt13和ggt30在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，gt30-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道2，gt13-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，空載體pyes2重組子的裂解液上清。圖6顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25，ggt25-1和ggt25-3催化原人參二醇和原人參二醇型皂苷的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。泳道25，ggt25粗酶液(gt25-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-1，ggt25-1粗酶液(gt25-1-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-3，ggt25-3粗酶液(gt25-3-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道“-”，負(fù)對照，空載體酵母的裂解液上清代替酶液；泳道m(xù)，原人參二醇和原人參二醇型皂苷的混合標(biāo)樣。圖7顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25，ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5催化原人參三醇與原人參三醇型皂苷的產(chǎn)物tlc檢測圖譜；泳道m(xù)，原人參三醇(ppt)與原人參三醇型皂苷的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道25，ggt25粗酶液(gt25-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-1，ggt25-1粗酶液(gt25-1-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-3，ggt25-3粗酶液(gt25-3-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-5，ggt25-5粗酶液(gt25-5-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道“-”，負(fù)對照，空載體重組酵母裂解代替酶液。圖8顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25，ggt25-1和ggt25-3催化達(dá)瑪烯二醇的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。泳道25，ggt25粗酶液(gt25-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-1，ggt25-1粗酶液(gt25-1-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道25-3，ggt25-3粗酶液(gt25-3-pyes2酵母重組子裂解上清)；泳道“-”，負(fù)對照，空載體酵母裂解代替酶液；泳道m(xù)，標(biāo)準(zhǔn)樣品達(dá)瑪烯二醇(dm)。圖9顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt13和ggt30催化原人參二醇和三醇的產(chǎn)物tlc檢測圖譜；泳道m(xù)1，原人參二醇皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道m(xù)2，原人參三醇皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道1，ggt13粗酶液催化原人參二醇；泳道2，ggt30粗酶液催化原人參二醇；泳道3，負(fù)對照，ddh2o代替酶液；泳道4，ggt13粗酶液催化原人參三醇；泳道5，ggt30粗酶液催化原人參三醇；泳道6，負(fù)對照，ddh2o代替酶液。圖10顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25催化原人參二醇的產(chǎn)物hplc檢測，第二行樣品：原人參二醇(ppd)與多種皂苷(ck、rh2、f2、rg3)的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第一行樣品：ggt25粗酶液催化ppd；第三行樣品：負(fù)對照1，空載體重組酵母裂解液催化ppd；第四行樣品：負(fù)對照2，dh2o。圖11顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25催化原人參三醇的產(chǎn)物hplc檢測，第二行樣品：原人參三醇(ppt)與多種三醇皂苷(f1、rh1、rg1)的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第一行樣品：ggt25粗酶液催化ppt；第三行樣品：負(fù)對照1，空載體重組酵母裂解液催化ppt；圖12顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25催化原人參二醇產(chǎn)物的lc/ms檢測，顯示了圖10中峰2(產(chǎn)物峰)和標(biāo)準(zhǔn)ck樣品的質(zhì)譜圖。圖13顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25催化原人參三醇產(chǎn)物的lc/ms檢測，顯示了圖11中峰1(產(chǎn)物峰)和標(biāo)準(zhǔn)f1樣品的質(zhì)譜圖。圖14顯示westernblot檢測ggt25-pet28a在e.colibl21中的表達(dá)；泳道1-3分別是50umiptg誘導(dǎo)后的總蛋白、上清和沉淀。圖15顯示ggt25-pet28a重組大腸桿菌細(xì)胞裂解液體外催化ppd的產(chǎn)物tlc檢查圖譜；泳道1，ppd和ck的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物；泳道2，ggt25-pet28a重組大腸桿菌誘導(dǎo)后(50μmiptg)細(xì)胞裂解液上清催化ppd。圖16顯示產(chǎn)ck酵母工程菌a細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測，第一行樣品：原人參二醇(ppd)、達(dá)瑪烯二醇和ck的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)ck酵母工程菌a細(xì)胞裂解液；第三行樣品：負(fù)對照1，酵母出發(fā)菌株的裂解液。圖17顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25-5催化原人參三醇的產(chǎn)物hplc檢測，第一行樣品：原人參三醇(ppt)與多種三醇皂苷(f1、rh1、rg1和re)的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：ggt25-5粗酶液催化ppt后的產(chǎn)物。圖18顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25-5催化原人參三醇的產(chǎn)物lc/ms檢測，顯示了圖17中p1峰(產(chǎn)物rh1峰)和rh1標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖。圖19為(a)3gt1和3gt2，(b)3gt3和(c)3gt4基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。圖20為sds-page檢測(a)3gt1和3gt2，(b)3gt3和(c)3gt4基因在大腸桿菌中的表達(dá)；(a)泳道1,pet28a空載體大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；泳道2，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道3，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道4，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的總蛋白；；泳道5，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道6，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道7，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的總蛋白；泳道8，蛋白分子量marker(b)泳道1，蛋白分子量marker；泳道2，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道3，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道4，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；(c),泳道1，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；泳道2，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道3，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道4，pet28a空載體大腸桿菌重組子的裂解液；泳道5，蛋白分子量marker。箭頭指向目的蛋白的位置。圖21為westernblot檢測檢測(a)3gt1和3gt2，(b)3gt3和(c)3gt4基因在大腸桿菌中的表達(dá)；(a)泳道1,pet28a空載體大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；泳道2，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道3，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道4，3gt1-pet28a大腸桿菌重組子的總蛋白；；泳道5，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道6，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道7，3gt2-pet28a大腸桿菌重組子的總蛋白；(b)泳道1，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道2，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道3，3gt3-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；(c),泳道1，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液總蛋白；泳道2，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液沉淀；泳道3，3gt4-pet28a大腸桿菌重組子的裂解液上清；泳道4，pet28a空載體大腸桿菌重組子的裂解液。圖22顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和3gt2催化原人參二醇和ck的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。泳道1，原人參二醇型皂苷標(biāo)樣，泳道2，糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1催化原人參二醇生成rh2；泳道3，糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1催化人參皂苷ck生成f2；泳道4，糖基轉(zhuǎn)移酶3gt2催化原人參二醇生成rh2；泳道5，糖基轉(zhuǎn)移酶3gt2催化人參皂苷ck生成f2。圖23顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和3gt2催化達(dá)瑪烯二醇(dm)和25-oh-ppd的產(chǎn)物tlc檢測圖譜(a)3gt1粗酶液粗酶液(3gt1-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化達(dá)瑪烯二醇(dm)和25-oh-ppd。泳道1，25-oh-ppd標(biāo)樣，泳道2，3gt1粗酶液催化25-oh-ppd生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-protopanaxadiol；泳道3，達(dá)瑪烯二醇標(biāo)樣；泳道4，3gt1粗酶液催化達(dá)瑪烯二醇生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii；(b)3gt2粗酶液(3gt2-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化達(dá)瑪烯二醇(dm)和25-oh-ppd。泳道1，25-oh-ppd標(biāo)樣，泳道2，3gt2粗酶液催化25-oh-ppd生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-protopanaxadiol；泳道3，達(dá)瑪烯二醇標(biāo)樣；泳道4，3gt2粗酶液催化達(dá)瑪烯二醇生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii。圖24顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和3gt2催化ppt和f1的的產(chǎn)物tlc檢測，泳道1，3gt1粗酶液(3gt1-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化ppt生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxatriol；泳道2，3gt1粗酶液催化f1生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1；泳道3，3gt2粗酶液(3gt2-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化ppt生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-protopanaxatriol；泳道4，3gt2粗酶液催化f1生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1。圖25顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和3gt2催化20(r)-ppd的產(chǎn)物tlc檢測。泳道1，20(r)-ppd標(biāo)樣；泳道2，3gt1粗酶液(3gt1-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化20(r)-ppd生成20(r)-rh2；泳道3，3gt2粗酶液(3gt2-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化20(r)-ppd生成20(r)-rh2；泳道4，對照，pet28a空載體大腸桿菌重組子裂解上清取代酶液；泳道5，20(r)-rh2標(biāo)樣.圖26顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1催化羊毛甾醇(lanosterol)的產(chǎn)物tlc檢測。泳道1，3gt1粗酶液(3gt1-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化lanosterol；泳道2，3gt2粗酶液(3gt2-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化lanosterol；泳道3：對照，pet28a空載體大腸桿菌重組子裂解上清取代酶液。圖27顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt3催化原人參二醇,原人參三醇和25-oh-ppd的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。(a)3gt3粗酶液(3gt3-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化原人參二醇生成rh2,m為原人參二醇型皂苷混合標(biāo)樣，(b)3gt3粗酶液催化原人參皂苷三醇生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt(3-g-ppt)；(c)3gt3粗酶液催化25-oh-ppd生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd(3-g-25-oh-ppd)。圖28顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt4催化原人參二醇,ck和25-oh-ppd的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。(a)3gt4粗酶液(3gt4-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化原人參二醇生成rh2,m為原人參二醇型皂苷混合標(biāo)樣，“+”代表加入3gt4粗酶液的樣品，“-”為對照，即用pet28a空載體大腸桿菌重組子裂解上清代替酶液(b)3gt4粗酶液催化ck生成f2；“+”代表加入3gt4粗酶液的樣品，“-”為對照，即用pet28a空載體大腸桿菌重組子裂解上清代替酶液；(c)糖基轉(zhuǎn)移酶3gt4催化25-oh-ppd生成3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd(3-g-25-oh-ppd)，“+”代表加入3gt4粗酶液的樣品，“-”為對照，即用pet28a空載體大腸桿菌重組子裂解上清代替酶液。圖29顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt3和3gt4催化原人參二醇生成rh2的hplc檢測，第一行樣品：人參皂苷ck、rh2和f2的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1粗酶液(3gt1-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化ppd后的產(chǎn)物；第三行；3gt3粗酶液(3gt3-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化ppd后的產(chǎn)物；第四行：3gt4粗酶液(3gt4-pet28a大腸桿菌重組子裂解上清)催化ppd后的產(chǎn)物。圖30顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt3和3gt4催化原人參二醇產(chǎn)物的lc/ms檢測。顯示rh2標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖和圖29中p1峰(3gt1的產(chǎn)物峰)，p2峰(3gt2的產(chǎn)物峰)以及p3峰(3gt4的產(chǎn)物峰)的質(zhì)譜圖。圖31顯示(a)ggt29/ggt29-3基因和(b)ggt29-4/ggt29-5/ggt29-6和ggt29-7基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。(b)泳道1，核酸marker；泳道2，ggt29/ggt29-3基因pcr產(chǎn)物；(b)泳道1，ggt29-4/ggt29-5/ggt29-6基因pcr產(chǎn)物；泳道2，ggt29-7基因pcr產(chǎn)物；泳道3，核酸marker。圖32顯示sds-page檢測ggt29和ggt29-3在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，空載體pyes2重組子的裂解液上清；泳道2，ggt29-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，ggt29-3-pyes2酵母重組子的裂解液上清。圖33顯示westernblot檢測ggt29和ggt29-3在釀酒酵母中的表達(dá)；泳道1，空載體pyes2重組子的裂解液上清；泳道2，ggt29-pyes2酵母重組子的裂解液上清；泳道3，ggt29-3-pyes2酵母重組子的裂解液上清。圖34顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29和ggt29-3催化人參皂苷rh2和f2的產(chǎn)物的tlc檢測圖譜；泳道1，ppd及ppd類型皂苷混合標(biāo)樣，泳道2，ggt29粗酶液(ggt29-pyes2酵母重組子的裂解液上清)催化rh2生成rg3，泳道3，ggt29粗酶液催化rh2對照，加入pyes2空質(zhì)粒酵母重組子裂解液替代酶液；泳道4，ggt29催化f2生成rd，泳道5，ggt29催化f2對照，加入pyes2空質(zhì)粒酵母重組子裂解液替代酶液；泳道6，ggt29-3粗酶液(ggt29-3-pyes2酵母重組子的裂解液上清)催化rh2生成rg3；泳道7，ggt29-3粗酶液催化f2生成rd。圖35顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29和3gt1或ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd產(chǎn)物的tlc檢測；(a)ggt29和3gt1聯(lián)合催化ppd,泳道1，ppd及ppd類型皂苷混合標(biāo)樣；泳道2，3gt1催化ppd生成rh2；泳道3，ggt29催化rh2生成rg3；泳道4，3gt1和ggt29聯(lián)合催化ppd生成rg3；(b)ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd,泳道1，ppd及ppd類型皂苷混合標(biāo)樣；泳道2，3gt4催化ppd生成rh2；泳道3，ppd；泳道4，3gt4和ggt29聯(lián)合催化ppd生成rg3。圖36顯示糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和ggt29分別催化20(r)-ppd和20(r)-ppd以及聯(lián)合催化20(r)-ppd的產(chǎn)物tlc檢測圖譜；泳道1，3gt1催化20(r)-ppd生成20(r)-rh2；泳道2，ggt29催化20(r)-rh2生成20(r)-rg3；泳道3，3gt1和ggt29聯(lián)合催化20(r)-ppd生成20(r)-rg3。圖37顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29和3gt1或ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd產(chǎn)物的的hplc檢測結(jié)果。第一行，rg3，rh2和ppd混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行，ggt29和3gt1聯(lián)合催化ppd,第三行，ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd。圖38顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29和3gt1或ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd的產(chǎn)物lc/ms檢測結(jié)果。顯示了標(biāo)準(zhǔn)樣品rg3的質(zhì)譜圖和圖37中p1峰(ggt29和3gt1聯(lián)合催化ppd的產(chǎn)物)和p2峰(ggt29和3gt4聯(lián)合催化ppd的產(chǎn)物產(chǎn)物峰)的質(zhì)譜圖。圖39顯示產(chǎn)rh2酵母工程菌a1細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測結(jié)果，第一行樣品：原人參二醇(ppd)、達(dá)瑪烯二醇(dm)，人參皂苷rh2和rg3的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)rh2酵母工程菌a1細(xì)胞裂解液抽提物。圖40顯示產(chǎn)rg3酵母工程菌a2細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測結(jié)果，第一行樣品：原人參二醇(ppd)、達(dá)瑪烯二醇(dm)，人參皂苷rh2和rg3的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)rg3酵母工程菌a2細(xì)胞裂解液抽提物。圖41顯示產(chǎn)rh1酵母工程菌a3細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測結(jié)果，第一行樣品：原人參三醇(ppt)和人參皂苷rh1的標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)rh1酵母工程菌a3細(xì)胞裂解液抽提物；圖42顯示產(chǎn)f1酵母工程菌a4細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測結(jié)果，第一行樣品：原人參三醇(ppt)和人參皂苷f1的標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)f1酵母工程菌a4細(xì)胞裂解液抽提物。圖43顯示產(chǎn)rh2酵母工程菌a5細(xì)胞裂解液抽提物的hplc檢測結(jié)果，第一行樣品：達(dá)瑪烯二醇(dm)，原人參二醇(ppd)，人參皂苷rh2和人參皂苷rg3的標(biāo)準(zhǔn)樣品；第二行樣品：產(chǎn)rh2酵母工程菌a5細(xì)胞裂解液抽提物。圖44顯示sds-page檢測ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7在重組大腸桿菌中的表達(dá)。泳道1，ggt29-4-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道2，ggt29-4-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道3，ggt29-5-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道4，ggt29-5-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道5，ggt29-6-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道6，ggt29-6-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道7，ggt29-7-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道8，ggt29-7-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道9，蛋白分子量marker。圖45顯示westernblot檢測ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7在重組大腸桿菌中的表達(dá)。泳道1，ggt29-4-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道2，ggt29-4-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道3，ggt29-5-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道4，ggt29-5-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道5，ggt29-6-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道6，ggt29-6-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清；泳道7，ggt29-7-pet28a重組大腸桿菌體裂解總蛋白；泳道8，ggt29-7-pet28a重組大腸桿菌體裂解上清。圖46顯示糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7分別催化rh2和f2的產(chǎn)物tlc檢測圖譜。泳道rh2表示用皂苷rh2為底物；泳道f2表示用皂苷f2為底物。ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7表示用不同的酶液進行催化反應(yīng)。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次提供糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25(seqidno.:2)、ggt25-1(seqidno.:16)、ggt25-3(seqidno.:18)、ggt25-5(seqidno.:20)，ggt29(seqidno.:26)，ggt29-3(seqidno.:28)，ggt29-4(seqidno.:55)，ggt29-5(seqidno.:57)，ggt29-6(seqidno.:59)，ggt29-7(seqidno.:61)以及3gt1(seqidno.:22)、3gt2(seqidno.:24)、3gt3(seqidno.:41)、3gt4(seqidno.:43)、ggt13(seqidno.:4)、ggt30(seqidno.:6)在萜類化合物糖基化催化及新皂苷合成中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶能特異和高效地催化四環(huán)三萜化合物底物的c-20位和/或c-6位和/或c-3的羥基糖基化，和/或?qū)碜蕴腔w的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的c-3位的第一個糖基上以延伸糖鏈。特別是能夠?qū)⒃藚⒍嫁D(zhuǎn)化為具有抗癌活性的稀有人參皂苷ck和rh2，將原人參三醇轉(zhuǎn)化為具有抗衰老活性的稀有人參皂苷f1和抗過敏作用的稀有人參皂苷rh1，將rh2轉(zhuǎn)化為抗癌活性優(yōu)良的稀有人參皂苷rg3。本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還能將達(dá)瑪稀二醇、原人參三醇、f1、25-oh-ppd、25-och3-ppd合成之前未見報道的新皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyrano-syl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd、3-o-β-(d-glucopyrano-syl)-25-och3-ppd。本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還能將rh2，ck,rg3分別轉(zhuǎn)化為人參皂苷人參皂苷f2，rd和rg1等。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化和催化方法。本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還可與達(dá)瑪烯二醇和/或原人參二醇或原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，或者應(yīng)用于制備達(dá)瑪烯二醇(dm)，原人參二醇(ppd)和原人參三醇(ppt)的遺傳工程細(xì)胞中，應(yīng)用于構(gòu)建人工合成稀有人參皂苷ck，f1，rh1、rh2和rg3，以及新的人參皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)–dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-och3-ppd和f2、rd和rg1等的代謝途徑中。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。定義如本文所用，術(shù)語“活性多肽”、“本發(fā)明的多肽及其衍生多肽”、“本發(fā)明的酶”、“糖基轉(zhuǎn)移酶”、“本發(fā)明的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5、ggt29、ggt29-3、3gt1、3gt2、3gt3、3gt4蛋白”或“本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶”，均指糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25(seqidno.:2)、ggt13(seqidno.:4)、ggt30(seqidno.:6)、ggt25-1(seqidno.:16)、ggt25-3(seqidno.:18)、ggt25-5(seqidno.:20)，ggt29(seqidno.:26)，ggt29-3(seqidno.:28)，ggt29-4(seqidno.:55)，ggt29-5(seqidno.:57)，ggt29-6(seqidno.:59)，ggt29-7(seqidno.:61)以及3gt1(seqidno.:22)、3gt2(seqidno.:24)、3gt3(seqidno.:41)、3gt4(seqidno.:43)多肽及其衍生多肽。如非特別說明，本文所說的人參皂苷和皂苷元，是的c20位s構(gòu)型的人參皂苷和皂苷元。如本文所用，“分離的多肽”是指所述多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化所述多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。所述多肽的純度還可以用氨基酸序列進行進一步分析。本發(fā)明的活性多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、植物)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括所述多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明的活性多肽具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且能夠催化以下一種或多種反應(yīng)：(a)其中，r1為h，單糖糖基或多糖糖基；r2和r3為h或oh；r4為糖基；所述的多肽選自seqidno：2、16或18或其衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的單糖包括葡萄糖(glc),鼠李糖(rha),乙酰基葡萄糖(glc(6)ac),阿拉伯呋喃糖(araf),阿拉伯吡喃糖(arap),木糖(xyl)等。在另一優(yōu)選例中，所述的多糖包括glc(2-1)glc,glc(6-1)glc,glc(6)ac,glc(2-1)rha,glc(6-1)arap,glc(6-1)xyl,glc(6-1)araf,glc(3-1)glc(3-1),glc(2-1)glu(6)ac,glc(6-1)arap(4-1)xyl,glc(6-1)arap(2-1)xyl,glc(6-1)arap(3-1)xyl等2-4個單糖組成的多糖。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物ppdhhoh糖基ckrh21個糖基hoh糖基f2rg32個糖基hoh糖基rdppthohoh糖基f1dmhhh糖基20-g-dm即當(dāng)所述的r1，r2都為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為原人參二醇(ppd)r1為一個葡萄糖基，r2為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為人參皂苷rh2.r1為兩個葡萄糖基，r2為h，r3為oh時，所述的式(i)化合物為人參皂苷rg3。r1為h，r2為oh，r3為oh，所述的式(i)化合物為原人參三醇(ppt)。r1為h，r2為h，r3為h，所述的式(i)化合物達(dá)瑪烯二醇(dm)。(b)：其中，r1為h或者糖基，r2糖基，r3為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:2、16、18或20或其衍生多肽；或，r1為h或者糖基；r2為h或者糖基；r3為糖基，所述的多肽選自seqidno.:20或其衍生多肽。r1-r3經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3產(chǎn)物f1h糖基糖基rg1ppthh糖基rh1即當(dāng)r1，r2都為h時，所述的式(iii)化合物為原人參三醇(ppt)。r1為h，r2為葡萄糖基時，所述的式(iii)化合物為人參皂苷f1。(c)：其中，r1為h或者oh；r2為h或者oh；r3為h或者糖基；r4為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物ppdhohh糖基rh2ckhoh糖基糖基f2pptohohh糖基3-g-pptf1ohoh糖基糖基3-g-f1dmhhh糖基3-g-dm當(dāng)r1和r3都為h，r2為oh時，所述的式(v)化合物為原人參二醇(ppd)，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽。當(dāng)r1為h，r2為oh,r3為葡萄糖基時，所述的式(v)化合物為人參皂苷ck，所述的多肽選自seqidnos.:22、24或43或其衍生多肽；當(dāng)r1為oh，r2為oh，r3為h時，所述的式(v)化合物為原人參三醇(ppt)，所述的多肽選自seqidnos.:22、24或41或其衍生多肽；當(dāng)r1為oh，r2為oh，r3為葡萄糖基時，所述的式(v)化合物為人參皂苷f1，所述的多肽選自seqidnos.:22或24或其衍生多肽；當(dāng)r1為h，r2為oh，r3為為h時，所述的式(v)化合物為達(dá)瑪烯二醇(dm)所述的多肽選自seqidnos.:22或24或其衍生多肽。(d)：其中，r1為oh或者och3；r2為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:22、24、41或43或其衍生多肽。r1-r2經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2產(chǎn)物25-oh-ppdoh糖基3-g-25-oh-ppd25-och3-ppdoch3糖基3-g-25-och3-ppd即當(dāng)r1為oh時，所述的式(vii)化合物為25-oh-ppd；r1為och時，所述的式(vii)化合物為25-och3-ppd。(e)其中，r1為糖基；r2和r3為oh或者h(yuǎn)；r4為糖基或者h(yuǎn)；r5為糖基，所述的多肽選自seqidnos.:26、28、55、57、59或61或其衍生多肽。r1-r4經(jīng)取代后的化合物如下表所示：底物r1r2r3r4產(chǎn)物rh2糖基hohhrg3f2糖基hoh糖基rd即當(dāng)r1為葡萄糖基；r2為h，r3為oh，r4為h，式(ix)化合物為rh2。r1為葡萄糖基；r2為h，r3為oh，r4為葡萄糖基，式(ix)化合物為f2。(f)所述的多肽選自seqidnos.:22或24或其衍生多肽。所述的多肽優(yōu)選序列為seqidnos.:22、24、41、26、28、43、55、57、59或61所示的多肽，該術(shù)語還包括具有與所示多肽具有相同功能的、seqidnos.:22、24、41、26、28、43、55、57、59或61序列的變異形式及衍生多肽。這些變異形式包括(但并不限于)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人egfrva蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明還提供所述多肽的類似物。這些類似物與天然人egfrva多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是flag、ha、ha1、c-myc、poly–his、poly-arg、strep-tagii、au1、ee、t7、4a6、ε、b、ge、以及ty1。這些標(biāo)簽可用于對蛋白進行純化。表1列出了其中的一些標(biāo)簽及其序列。表1為了使翻譯的蛋白分泌表達(dá)(如分泌到細(xì)胞外)，還可在所述ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4的氨基酸氨基末端添加上信號肽序列，如pelb信號肽等。信號肽在多肽從細(xì)胞內(nèi)分泌出來的過程中可被切去。本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與seqidnos.:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61的蛋白質(zhì)，但與seqidnos.:15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58或60所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件(或嚴(yán)緊條件)下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與seqidnos.:16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59或61所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如pcr)以確定和/或分離編碼ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂胮cr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。應(yīng)用pcr技術(shù)擴增dna/rna的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cdna時，可優(yōu)選使用race法(race-cdna末端快速擴增法)，用于pcr的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的dna/rna片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組dna技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4多肽。一般來說有以下步驟：(1).用本發(fā)明的編碼ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4編碼dna序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的dna序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mrna合成。這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體pl啟動子；真核啟動子包括cmv立即早期啟動子、hsv胸苷激酶啟動子、早期和晚期sv40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的ltrs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(gfp)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅s2或sf9的昆蟲細(xì)胞；cho、cos、293細(xì)胞、或bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是dna的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的sv40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細(xì)胞。用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。應(yīng)用本發(fā)明涉及的活性多肽或肽基轉(zhuǎn)移酶ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4的用途包括(但不限于)：特異和高效地催化四環(huán)三萜化合物底物的c-20位和/或c-6位和/或c-3的羥基糖基化或?qū)碜蕴腔w的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的c-3位的第一個糖基上以延伸糖鏈。特別是能夠?qū)⒃藚⒍嫁D(zhuǎn)化為具有抗癌活性的稀有人參皂苷ck和rh2，將原人參三醇轉(zhuǎn)化為具有抗衰老活性的稀有人參皂苷f1和抗過敏作用的稀有人參皂苷rh1，將rh2轉(zhuǎn)化為抗癌活性更優(yōu)良的稀有人參皂苷rg3。本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還能將達(dá)瑪稀二醇、原人參三醇、f1、25-oh-ppd、25-och3-ppd合成之前未見報道的新皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-och3-ppd。本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還能將rh2，ck，rg3轉(zhuǎn)化為人參皂苷人參皂苷f2，rd和rg1等。所述的四環(huán)三萜化合物包括(但不限于)：s構(gòu)型或r構(gòu)型的達(dá)瑪烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、環(huán)阿屯烷(環(huán)阿爾廷烷)型、葫蘆烷、楝烷型等四環(huán)三萜類化合物。本發(fā)明提供了一種工業(yè)催化方法，包括：在提供糖基供體的條件下，用本發(fā)明的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7，3gt1，3gt2，3gt3和/或3gt4活性多肽或肽基轉(zhuǎn)移酶獲得(ii)，(iv)，(vi)，(viii)，(x)和(xii)化合物。具體是，所述的(a)反應(yīng)中所用的多肽選自seqidnos.:2、16或18；所述的(b)反應(yīng)中所用的多肽選自seqidnos.:20、2、16或18；所述的(c)和(d)反應(yīng)所用的多肽選自seqidnos.:22、24、41和43；所述的(e)反應(yīng)中所用的多肽選自seqidnos.:26、28、55、57、59或61所示氨基酸序列的活性多肽；所述的(f)反應(yīng)中所用的多肽選自seqidnos.:22或24所示氨基酸序列的活性多肽；。所述的糖基供體是核苷二磷酸糖，選自下組：udp-葡萄糖，adp-葡萄糖，tdp-葡萄糖，cdp-葡萄糖，gdp-葡萄糖，udp-乙酰基葡萄糖，adp-乙酰基葡萄糖，tdp-乙?；咸烟?，cdp-乙酰基葡萄糖，gdp-乙?；咸烟?，udp-木糖，adp-木糖，tdp-木糖，cdp-木糖，gdp-木糖，udp-半乳糖醛酸，adp-半乳糖醛酸，tdp-半乳糖醛酸，cdp-半乳糖醛酸，gdp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，adp-半乳糖，tdp-半乳糖，cdp-半乳糖，gdp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，adp-阿拉伯糖，tdp-阿拉伯糖，cdp-阿拉伯糖，gdp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，adp-鼠李糖，tdp-鼠李糖，cdp-鼠李糖，gdp-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其組合。所述的糖基供體優(yōu)選是尿苷二磷酸糖，選自下組：udp-葡萄糖，udp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其組合。在所述方法中，還可以添加酶活性添加物(提高酶活性或抑制酶活性的添加物)。所述酶活性的添加物可以選自下組：ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+、或fe2+；或為可以生成ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+、或fe2+的物質(zhì)。所述方法的ph條件為：ph4.0-10.0，優(yōu)選ph6.0-ph8.5，更優(yōu)選8.5。所述方法的溫度條件為：10℃-105℃，優(yōu)選25℃-35℃，更優(yōu)選35℃。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的本發(fā)明的活性多肽或肽基轉(zhuǎn)移酶ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7，3gt1，3gt2，3gt3和3gt4，以及食品學(xué)上或工業(yè)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。所述的組合物中還可添加調(diào)節(jié)本發(fā)明的ggt25酶活性的物質(zhì)。任何具有提高酶活性功能的物質(zhì)均是可用的。較佳地，所述的提高本發(fā)明的ggt25酶活性的物質(zhì)選自巰基乙醇。此外，很多物質(zhì)可以降低酶活性，包括但不限于：ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+和fe2+；或在添加至底物后可水解形成ca2+、co2+、mn2+、ba2+、al3+、ni2+、zn2+和fe2+的物質(zhì)。在獲得了本發(fā)明的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4后，本領(lǐng)域人員可以方便地應(yīng)用該酶來發(fā)揮轉(zhuǎn)糖基的作用，特別是對達(dá)瑪稀二醇、原人參二醇和原人參三醇的轉(zhuǎn)糖基作用。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，還提供了二種形成稀有人參皂苷的方法，該方法之一包含：用本發(fā)明所述的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7，3gt1和/或3gt2酶處理待轉(zhuǎn)糖基的底物，所述的底物包括達(dá)瑪稀二醇、原人參二醇和原人參三醇及其衍生物等四環(huán)三萜類化合物。較佳地，在ph3.5-10條件下，用所述的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4酶處理待轉(zhuǎn)糖基的底物。較佳地，在溫度30-105℃條件下，用所述的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4、ggt29-3，3gt1和/或3gt2酶處理待轉(zhuǎn)糖基的底物。該方法之二包含：將本發(fā)明所述的ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4基因轉(zhuǎn)入可以合成達(dá)瑪稀二醇、原人參二醇或原人參三醇的工程菌(例如，酵母或大腸桿菌工程菌)中，或者，將ggt25、ggt13、ggt30、ggt25-1、ggt25-3、ggt25-5，ggt29，ggt29-3，ggt29-4，ggt29-5，ggt29-6，ggt29-7以及3gt1、3gt2、3gt3、3gt4基因與達(dá)瑪稀二醇、原人參二醇和原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因于宿主細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞或大腸桿菌)中共表達(dá)，獲得直接生產(chǎn)稀有人參皂苷ck，rh2，rg3，rh1或f1的重組菌。所述的達(dá)瑪稀二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因。在另一優(yōu)選例中，所述的原人參二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因、和p450cyp716a47的還原酶基因，或其組合。或者以上各種酶的同功酶及其組合。其中，達(dá)瑪烯二醇合成酶將環(huán)氧角鯊烯(釀酒酵母自身合成)轉(zhuǎn)化為達(dá)瑪烯二醇，細(xì)胞色素p450cyp716a47及其還原酶再將達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化為原人參二醇。(hanet.al，plant&cellphysiology，2011，52.2062-73)在另一優(yōu)選例中，所述的原人參三醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因包括(但不限于)：達(dá)瑪烯二醇合成酶基因、細(xì)胞色素p450cyp716a47基因、p450cyp716a47的還原酶基因、及細(xì)胞色素p450cyp716a53v2基因，或其組合。或者以上各種酶的同功酶及其組合。其中，達(dá)瑪烯二醇合成酶將環(huán)氧角鯊烯(釀酒酵母自身合成)轉(zhuǎn)化為達(dá)瑪烯二醇，細(xì)胞色素p450cyp716a47及其還原酶再將達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化為原人參二醇，細(xì)胞色素p450cyp716a53v2(jx036031)及p450cyp716a47的還原酶再進一步將原人參二醇轉(zhuǎn)化為原人參三醇。(hanet.al，plant&cellphysiology，2012，53.1535-45)本發(fā)明的主要優(yōu)點：(1)本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶可以特異性和高效地將四環(huán)三萜化合物底物的c-20位和/或c-6位和/或c-3位羥基上轉(zhuǎn)入葡萄糖；(2)本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29和ggt29-3可以將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的c-3位的第一個糖基上以延伸糖鏈(3)本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶特別能夠分別將原人參二醇和原人參三醇轉(zhuǎn)化為具有抗癌活性的稀有人參皂苷ck、rh2或rg3和具有抗衰老活性的稀有人參皂苷f1、具有抗過敏作用的稀有人參皂苷rh1；(4)本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶還能將達(dá)瑪稀二醇、原人參三醇、f1、25-oh-ppd、25-och3-ppd合成之前未見報道的新化合物20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd、3-o-β-d-glucopyranosyl)-25-och3-ppd、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-lanosterol。(5)3gt1，3gt2，ggt29，ggt29-3和ggt25-5的催化活性并不受四環(huán)三萜化合物上20位羥基或者糖基空間構(gòu)型的影響，既可以催化20(s)構(gòu)型的人參皂苷(皂苷元)也可以催化20(r)構(gòu)型的人參皂苷(皂苷元)。(6)在酵母中構(gòu)建了人參皂苷元(達(dá)瑪稀二醇、原人參二醇和原人參三醇)的合成途徑，從而實現(xiàn)以葡萄糖等單糖為底物，用酵母來發(fā)酵生產(chǎn)新化合物20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1、3-o-β-(d-glucopyranosyl)-lanosterol等以及稀有人參皂苷ck、f1、rh1、rh2和rg3，這不但可以解決皂苷生產(chǎn)的原料來源問題，而且可以大幅降低稀有皂苷ck、f1、rh1、rh2和rg3的生產(chǎn)成本。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因的分離從發(fā)表的人參屬植物表達(dá)譜數(shù)據(jù)提取了100多條預(yù)測糖基轉(zhuǎn)移酶的cdna序列，從中克隆了60條cdna全長序列并對它們進行了表達(dá)及轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)分析，其中有11種表達(dá)產(chǎn)物對人參皂苷元及皂苷具有轉(zhuǎn)糖基活性。提取人參rna并進行反轉(zhuǎn)錄，獲得人參的cdna。以該cdna為模板進行pcr擴增，使用其中引物對1(seqidnos.:7、8)；引物對2(seqidnos.:9、10)；引物對3(seqidnos.:11，12)；引物對5(seqidnos.:34、35)；引物對7(seqidnos.:46、47)；引物對8(seqidnos.:62、63)；引物對9(seqidnos.:64、65)全部獲得擴增產(chǎn)物。dna聚合酶選用寶生物工程有限公司的高保真的koddna聚合酶。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1,19(c)和31)。在紫外下照射，切下目標(biāo)dna條帶。然后采用axygengelextractionkit(aeygen公司)從瓊脂糖凝膠中回收dna即為擴增出的dna片段。將此dna片段用寶生物工程有限公司的rtaqdna聚合酶在末端加a后與市售的克隆載體pmd18-tvector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化市售的大腸桿菌epi300感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌液涂布在添加氨芐青霉素50ug/ml、iptg0.5mm、x-gal25μg/ml的lb平板上，并進一步通過pcr和酶切驗證重組克隆。分別選取其中一個克隆提取重組質(zhì)粒后進行測序。用bestorf軟件尋找開放閱讀框(orf)。通過序列比對，orf編碼了糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域，表明是糖基轉(zhuǎn)移酶基因。用引物對1(seqidnos.:7、8)獲得的基因具有seqidnos.:1、15、17和19所示的核苷酸序列，分別命名為ggt25，ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5。自序列表中seqidno.:1的5’端第1至1425位核苷酸為ggt25的蛋白編碼序列(cds)，自seqidno.:1的5’端的第1-3位核苷酸為ggt25基因的起始密碼子atg。序列表中seqidno.:15的5’端第1至1428位核苷酸為ggt25-1的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:15的5’端的第1-3位核苷酸為ggt25-1基因的起始密碼子atg，自seqidno.:15的5’端的第1426至1428位核苷酸為ggt25-1基因的終止密碼子taa。自序列表中seqidno.:17的5’端第1至1428位核苷酸為ggt25-3的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:17的5’端的第1-3位核苷酸為ggt25-3基因的起始密碼子atg，自seqidno.:17的5’端的第1426至1428位核苷酸為ggt25-3基因的終止密碼子taa。自序列表中seqidno.:19的5’端第1至1419位核苷酸為ggt25-5的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:19的5’端的第1-3位核苷酸為ggt25-5基因的起始密碼子atg，自seqidno.:19的5’端的第1426至1428位核苷酸為ggt25-5基因的終止密碼子taa。用引物對2(seqidnos.:9、10)獲得的基因具有seqidno.:3所示的核苷酸序列，命名為ggt13。自序列表中seqidno.:3的5’端第1至1431位核苷酸為ggt13的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:3的5’端的第1-3位核苷酸為ggt13基因的起始密碼子atg，自seqidno.:1的5’端的第1429至1431位核苷酸為ggt13基因的終止密碼子taa。用引物對3(seqidnos.:11、12)獲得的基因具有seqidno.:5所示的核苷酸序列，命名為ggt30。自序列表中seqidno.:5的5’端第1至1353位核苷酸為ggt30的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:5的5’端的1-3位位核苷酸為ggt30基因的起始密碼子atg，自seqidno.:5的5’端的第1351至1353位核苷酸為gg30基因的終止密碼子taa。用引物對5(seqidnos.:34，35)獲得基因具有seqidnos.:25，27所示的核苷酸序列，分別命名為ggt29和ggt29-3。自序列表中seqidno.:25的5’端第1至1329位核苷酸為ggt29的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:25的5’端的1-3位位核苷酸為ggt29基因的起始密碼子atg，自seqidno.:25的5’端的第1327至1329位核苷酸為gg29基因的終止密碼子tag。自seqidno.:27的5’端的1-3位位核苷酸為ggt29-3基因的起始密碼子atg，自seqidno.:27的5’端的第1327至1329位核苷酸為ggt29-3基因的終止密碼子tag。用引物對6(seqidnos.:46、47)獲得基因具有seqidno.:42所示的核苷酸序列，命名為3gt4。自序列表中seqidno.:42的5’端第1至1374位核苷酸為3gt4的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:42的5’端的1-3位核苷酸為3gt4基因的起始密碼子atg，自seqidno.:42的5’端的第1372至1374位核苷酸為3gt4基因的終止密碼子tag。用引物對7(seqidnos.:62、63)獲得基因具有seqidno.54、56、58所示的核苷酸序列，命名為ggt29-4、ggt29-5和ggt29-6。自序列表中seqidno.:54的5’端第1至1341位核苷酸為ggt29-4的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:54的5’端的1-3位核苷酸為ggt29-4基因的起始密碼子atg，自seqidno.:54的5’端的第1339至1341位核苷酸為ggt29-4基因的終止密碼子tag。自序列表中seqidno.:56的5’端第1至1341位核苷酸為ggt29-5的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:56的5’端的1-3位核苷酸為ggt29-5基因的起始密碼子atg，自seqidno.:56的5’端的第1339至1341位核苷酸為ggt29-5基因的終止密碼子tag。自序列表中seqidno.:58的5’端第1至1341位核苷酸為ggt29-6的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:58的5’端的1-3位核苷酸為ggt29-6基因的起始密碼子atg，自seqidno.:58的5’端的第1339至1341位核苷酸為ggt29-6基因的終止密碼子tag。用引物對8(seqidnos.:64、65)獲得基因具有seqidno.60所示的核苷酸序列，命名為ggt29-7。自序列表中seqidno.:60的5’端第1至1341位核苷酸為ggt29-7的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:60的5’端的1-3位核苷酸為ggt29-7基因的起始密碼子atg，自seqidno.:60的5’端的第1339至1341位核苷酸為ggt29-7基因的終止密碼子tag。人工合成具有seqidnos.:21、23和40所示的核苷酸序列，分別命名為3gt1，3gt2和3gt3。自序列表中seqidno.:21的5’端第1至1488位核苷酸為3gt1的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:21的5’端的第1-3位核苷酸為3gt1基因的起始密碼子atg，自seqidno.:21的5’端的第1486至1488位核苷酸為3gt1基因的終止密碼子taa。自序列表中seqidno.:23的5’端第1至1488位核苷酸為3gt2的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:23的5’端的第1-3位核苷酸為3gt2基因的起始密碼子atg，自seqidno.:23的5’端的第1486至1488位核苷酸為3gt2基因的終止密碼子taa。自序列表中seqidno.:40的5’端第1至1494位核苷酸為3gt3的開放閱讀框(orf)，自seqidno.:40的5’端的第1-3位核苷酸為3gt3基因的起始密碼子atg，自seqidno.:40的5’端的第1492至1494位核苷酸為3gt3基因的終止密碼子taa。用引物對4(seqidnos.:29，30)對其中兩條人工合成的基因(seqidno.:21和seqidno.:23)進行pcr擴增，獲得的pcr產(chǎn)物具有seqidno.:21和seqidno.:23所示的核苷酸序列(圖19(a))；用引物對6(seqidnos.:44、45)對另外一條人工合成的基因(seqidno.:40)進行pcr擴增，獲得的pcr產(chǎn)物具有seqidno.:40所示的核苷酸序列(圖19(b))。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25編碼一個含有475個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt25，具有序列表中seqidno.:2所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為53kda，等電點pi為5.14。自seqidno.:2的氨基端的第344-387位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列一致性低于52％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25-1編碼一個含有475個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt25-1，具有序列表中seqidno.:16所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為53kda，等電點pi為4.91。自seqidno.:16的氨基端的第344-387位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列一致性低于52％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25-3編碼一個含有475個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt25-3，具有序列表中seqidno.:18所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為53kda，等電點pi為5.05。自seqidno.:18的氨基端的第344-387位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列一致性低于52％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25-5編碼一個含有472個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt25-5，具有序列表中seqidno.:20所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為53kda，等電點pi為4.98。自seqidno.:20的氨基端的第343-386位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列一致性低于52％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt13編碼一個含有476個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt13，具有序列表中序列seqidno.:4所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為53kda，等電點pi為4.91。自seqidno.:4的氨基端的第343-386位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列一致性最高為99.5％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt30編碼一個含有451個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt30，具有序列表中seqidno.:6所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為51kda，等電點pi為6.79。自seqidno.:6的氨基端的第318-361位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶同釀酒葡萄(vitisvinifera)的糖基轉(zhuǎn)移酶(xp_002271587)相似性最高(53％)，表明該糖基轉(zhuǎn)移酶為新酶。糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt1編碼一個含有495個氨基酸的蛋白質(zhì)3gt1，具有序列表中seqidno.:22所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為56kda，等電點pi為5.52。自seqidno.:22的氨基端的第355-398位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與歐洲山芥(barbareavulgaris)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt73c10同源性>99％糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt2編碼一個含有495個氨基酸的蛋白質(zhì)3gt2，具有序列表中seqidno.:24所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為56kda，等電點pi為5.62。自seqidno.:24的氨基端的第355-398位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與歐洲山芥(barbareavulgaris)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt73c12同源性>99％糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29編碼一個含有442個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29，具有序列表中seqidno.:26所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為49kda，等電點pi為5.93。自seqidno.:26的氨基端的第317-360位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與釀酒葡萄(vitisvinifera)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于56％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-3編碼一個含有442個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29-3，具有序列表中seqidno.:28所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為49kda，等電點pi為5.48。自seqidno.:28的氨基端的第317-360位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與釀酒葡萄(vitisvinifera)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于56％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt3編碼一個含有個497氨基酸的蛋白質(zhì)3gt3，具有序列表中seqidno.:41所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為55kda，等電點pi為5.50。自seqidno.:41的氨基端的第350-393位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶同源性>99％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt4編碼一個含有458個氨基酸的蛋白質(zhì)3gt4，具有序列表中seqidno.:43所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為51kda，等電點pi為5.10。自seqidno.:43的氨基端的第333-376位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與釀酒葡萄(vitisvinifera)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列同源性低于50％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-4編碼一個含有446個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29-4，具有序列表中seqidno.:55所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為50kda，等電點pi為5.78。自seqidno.:55的氨基端的第321-364位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與北柴胡(bupleurumchinense)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于57％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-5編碼一個含有446個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29-5，具有序列表中seqidno.:57所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為50kda，等電點pi為5.93。自seqidno.:57的氨基端的第321-364位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與北柴胡(bupleurumchinense)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于58％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-6編碼一個含有446個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29-6，具有序列表中seqidno.:59所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為50kda，等電點pi為6.03。自seqidno.:59的氨基端的第321-364位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與北柴胡(bupleurumchinense)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于59％。糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-7編碼一個含有446個氨基酸的蛋白質(zhì)ggt29-7，具有序列表中seqidno.:61所示的的氨基酸序列。用軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量為50kda，等電點pi為5.80。自seqidno.:61的氨基端的第321-364位為糖基轉(zhuǎn)移酶第1家族保守功能域。該糖基轉(zhuǎn)移酶與北柴胡(bupleurumchinense)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列相似性低于57％。表2實施例2糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5的酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建以實施例1構(gòu)建的含有g(shù)gt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5基因的質(zhì)粒ggt25-pmd18t，ggt25-1-pmd18t，ggt25-3-pmd18t和ggt25-5-pmd18t為模板擴增目標(biāo)基因。所用正向引物均為：5’-gccggagctcatgaagtcagaattgatattc-3’(seqidno.:13)，其5’端添加saci識別位點：gagctc；所用反向引物均為：5’-gccgctcgagttaatgatgatgatgatgatgcataatttcctcaaatagcttc-3’(seqidno.:14)，其5’端添加xholi識別位點：ctcgag，反向引物引入6×histag以便進行westernblot檢測表達(dá)和純化。利用上述引物和模板通過pcr方法擴增ggt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5基因。dna聚合酶選用toyobo公司的高保真dna聚合酶kod，參考其說明書設(shè)定pcr程序：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃1.5min，共30個循環(huán)；68℃10min；10℃保溫。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光下，切下與目標(biāo)dna大小一致的條帶。然后采用axygen公司的axyprepdnagelextractionkit從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。用takara公司的的quickcut限制性內(nèi)切酶kpni和xbai雙酶切回收的dna片段30min，用axygen公司的axypreppcrcleanupkit對酶切產(chǎn)物進行清潔回收。利用neb公司的t4dna連接酶將酶切產(chǎn)物與釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pyes2(同樣以kpni和xbai酶切并割膠回收)25℃連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colitop10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上。通過菌落pcr驗證陽性轉(zhuǎn)化子，并測序進一步驗證，結(jié)果表明表達(dá)質(zhì)粒gt25-pyes2，gt25-1-pyes2，gt25-3-pyes2和gt25-5-pyes2構(gòu)建成功。實施例3糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5在釀酒酵母中的表達(dá)通過電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒gt25-pyes2轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中，涂布于篩選平板sc-ura(0.67％酵母無氨基酸基本氮源，2％葡萄糖)。通過菌落pcr驗證酵母重組子。挑酵母重組子菌落于10mlsc-ura(2％葡萄糖)培養(yǎng)基中，30℃200rpm培養(yǎng)20h。4℃3500g離心收集菌體，用無菌去離子水清洗菌體兩次，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基sc-ura(2％半乳糖)重懸菌體，并接種到50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使od600在0.4左右，30℃200rpm開始誘導(dǎo)表達(dá)。4℃3500g離心收集誘導(dǎo)表達(dá)12h的菌體，用無菌去離子水清洗菌體兩次，重懸于酵母裂解緩沖液中，使od600在50-100之間。用fastprep細(xì)胞破碎儀震蕩破碎酵母細(xì)胞，4℃12000g離心10min去除細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞裂解液上清。取適量裂解液上清進行sds-page電泳檢測，與pyes2空載體的重組子相比，gt25-pyes2，gt25-1-pyes2，gt25-3-pyes2，gt25-5-pyes2重組子沒有明顯的條帶特征，如圖2。采用anti-6×histagwesternblot檢測表達(dá)情況，如圖3所示，表達(dá)ggt25，ggt25-1,ggt25-3和ggt25-5的釀酒酵母重組子顯示很強的westernblot信號，表明ggt25，ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5在酵母中可溶表達(dá)，而轉(zhuǎn)pyes2空載體的重組子則沒有anti-6×histagwesternblot信號。實施例4酵母表達(dá)產(chǎn)物ggt25,ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和產(chǎn)物鑒定以表達(dá)ggt25，ggt25-1，ggt25-3和ggt25-5的重組酵母裂解上清做為酶液來催化底物原人參二醇(protopanoxadiolppd)，原人參三醇(protopanaxatriolppt)和達(dá)瑪烯二醇(dammarenediolii，dm)的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，表達(dá)空載體的重組酵母裂解上清為對照。100μl反應(yīng)體系如表3：表39％吐溫2011.1μl50mmudp-葡萄糖10μl1mtris-hclph8.55μl100mm底物(乙醇溶解)0.5μl酶液73.4μl反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物先用薄層層析(tlc)進行檢測，表達(dá)ggt25或ggt25-1或ggt25-3的重組酵母裂解上清酶液可以在原人參二醇和原人參三醇的20位羥基糖基化，分別轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷ck和f1(圖6和圖7)；3位羥基已糖基化的原人參二醇型皂苷(rh2和rg3)，可以在ggt25，ggt25-1和ggt25-3的催化下，將20位羥基繼續(xù)糖基化，分別生成f2和rd(圖6)；ggt25，ggt25-1和ggt25-3不但可以將ppt的20位羥基糖基化生成f1，還能進一步在6位羥基繼續(xù)糖基化形成rg1(圖7)；ggt25，ggt25-1和ggt25-3還能將ppd的前體物達(dá)瑪烯二醇的20位羥基糖基化，得到一種未見報道的皂苷20-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarendiolii(圖8)。但是，6位羥基已經(jīng)糖基化的原人參三醇型皂苷(rh1，rg2和rf)則不能在ggt25，ggt25-1和ggt25-3的催化下將20位羥基糖基化。同時，ggt25，ggt25-1和ggt25-3也不能催化糖鏈的延伸。ggt25-5與ggt25，ggt25-1和ggt25-3的催化活性存在差別，它不能像ggt25，ggt25-1和ggt25-3一樣，在ppd，ppt或者達(dá)瑪烯二醇的20位羥基糖基化，它只能將ppt的6位羥基糖基化，轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷rh1(圖7)。進一步對ggt25的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用hplc進行鑒定(圖10和圖11)。在圖10中，有三個峰出現(xiàn)，其中峰2與標(biāo)樣樣品中ck的保留時間一致，峰3與原人參二醇的峰一致。峰3已經(jīng)很小，這說明原人參二醇基本都被轉(zhuǎn)換為了ck。峰1，在負(fù)對照的圖譜中也出現(xiàn)，所以應(yīng)該與原人參二醇的轉(zhuǎn)化無關(guān)。在圖11中，也有三個峰出現(xiàn)，峰1與標(biāo)樣樣品中f1的保留時間一致，峰3與原人參三醇的峰一致。峰3已經(jīng)很小，這說明原人參三醇基本都被轉(zhuǎn)換為了f1。峰2，在負(fù)對照的圖譜中也出現(xiàn)，所以應(yīng)該與原人參三醇的轉(zhuǎn)化無關(guān)。最后用lc/ms對產(chǎn)物做更近一步的鑒定(圖12和圖13)。圖12是對原人參二醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中ck峰(圖10中峰2)的質(zhì)譜圖，它與標(biāo)準(zhǔn)ck樣品的質(zhì)譜圖完全一致。圖13是對原人參三醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中f1峰(圖11中峰1)的質(zhì)譜圖，它與標(biāo)準(zhǔn)樣品f1的質(zhì)譜圖完全一致。這些結(jié)果進一步證實了原人參二醇和三醇的ggt25轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別為ck和f1。實施例5糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt13和ggt30的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)用與實施例2同樣的方法，獲得了ggt13和ggt30的克隆，構(gòu)建了它們的酵母重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入釀酒酵母。按照實施例3相同的步驟誘導(dǎo)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，雖然在sds-page膠上沒有明顯的目的蛋白的條帶(圖4)，但是westernblot檢測到明顯的雜交信息，這表明ggt13和ggt30均已在酵母中表達(dá)(圖5)。用與實施例4同樣的方法，利用表達(dá)ggt13和ggt30的重組酵母細(xì)胞裂解液分別催化原人參二醇(ppd)和原人參三醇(ppt)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ggt13和ggt30的蛋白表達(dá)產(chǎn)物都無法轉(zhuǎn)化ppd或ppt(圖9)；并且ggt13和ggt30也都無法轉(zhuǎn)化原人參二醇型皂苷rh2、ck、f2和rg3以及原人參三醇型f1、rh1和rg1。以上結(jié)果表明，盡管ggt13與人參轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測的人參皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的一致性很高(99.5％)，但是ggt13和ggt30對上述的底物都沒有轉(zhuǎn)糖基作用。實施例6糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt25在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)以實施例1構(gòu)建的含有g(shù)gt25基因的質(zhì)粒ggt25-pmd18t為模板擴增目標(biāo)基因ggt25，并將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pet28a(購自merck公司)中，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體gt25-pet28a，轉(zhuǎn)化到市售的e.colibl21中。接種一個重組子到lb培養(yǎng)基中，30℃200rpm培養(yǎng)至od600約0.6-0.8，使菌液降溫至4℃，加入終濃度為50μm的iptg，18℃200rpm誘導(dǎo)表達(dá)15h。4℃離心收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，4℃12000g離心收集細(xì)胞裂解液上清，取樣品進行sds-page電泳。westernblot(圖14)表明，在50μmiptg誘導(dǎo)條件下，糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25在大腸桿菌中也可以表達(dá)。以該重組大腸桿菌的細(xì)胞裂解液上清為粗酶液來進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，反應(yīng)的條件與實施例4中相同。反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物先用薄層層析(tlc)進行檢測，圖15中可見ggt25粗酶液可將ppd轉(zhuǎn)化為ck。實施例7產(chǎn)ck酵母工程菌的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定在pesc-his質(zhì)粒((stratagene，agilent)上，同時組裝達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediolsynthase)(acz71036.1)(gal1/gal10gal10側(cè)啟動子，adh1終止子)、細(xì)胞色素p450cyp716a47(aey75213.1)(fba1啟動子，cyc1終止子)以及糖基轉(zhuǎn)移酶gt25(gal1/gal10gal1側(cè)啟動子，tdh2終止子)，構(gòu)成游離型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母by4742，并將擬南芥來源的細(xì)胞色素p450還原酶atr2-1(np_849472.2)整合于釀酒酵母by4742染色體中染色體trp1基因位點(gal1啟動子，利用trp1原有終止子)，構(gòu)建了重組酵母a。同樣方法，構(gòu)建了重組酵母b，區(qū)別在于將擬南芥來源還原酶atr2-1整合于含有達(dá)瑪烯二醇合成酶、細(xì)胞色素p450cyp716a47及糖基轉(zhuǎn)移酶gt25的重組質(zhì)粒上，atr2-1有啟動子與終止子分別tef2啟動子和tpi1終止子，其他3個基因的啟動子與終止子與重組菌a的對應(yīng)基因相同。用與重組酵母菌b相同的方法構(gòu)建了重組酵母菌c，但重新規(guī)劃了各個基因的啟動子與終止子，如表4。表4主要酶啟動子與終止子構(gòu)成：重組酵母菌株a,b,c在sc-ura(0.67％酵母無氨基酸基本氮源，2％半乳糖)培養(yǎng)基中發(fā)酵，各重組菌需要額外添加的氨基酸或尿嘧啶見表5，取50ml重組酵母的發(fā)酵液，離心后沉淀的菌體用5ml酵母裂解緩沖液(50mmtris-hcl、1mmedta、1mmpmsf、5％甘油，ph7.5)重懸后，用fastprep震蕩裂解酵母，設(shè)置功率6m/s，震蕩7～8次使酵母充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移到2mlep管中，每個管裝1ml，加入等體積(1ml)的正丁醇抽提約30min后12000g離心10min。吸取上清至一新的ep管中。45℃并真空條件下使正丁醇蒸干。用100μl甲醇溶解后用于hplc檢測。通過hplc分析，重組酵母a的細(xì)胞裂解液中含有達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇(ppd)及人參皂苷活性代謝物ck(圖16)，酵母a合成ck的產(chǎn)量達(dá)到0.6mg/l。hplc分析同樣發(fā)現(xiàn)重組酵母b和c的細(xì)胞裂解液含有微量ck。表5重組酵母菌需補加的相應(yīng)氨基酸或尿嘧啶重組酵母菌株補加氨基酸或尿嘧啶a0.01％色氨酸(tryptophan)，亮氨酸(leucine)，賴氨酸(lysine)b0.01％尿嘧啶(uracil)，亮氨酸(leucine)，賴氨酸(lysine)c0.01％尿嘧啶(uracil)，亮氨酸(leucine)，賴氨酸(lysine)實施例8產(chǎn)rh1酵母工程菌的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定在pesc-his質(zhì)粒((stratagene，agilent)上，同時組裝達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediolsynthase)(acz71036.1)(gal1/gal10gal10側(cè)啟動子，adh1終止子)、細(xì)胞色素p450cyp716a47(aey75213.1)(fba1啟動子，cyc1終止子)、細(xì)胞色素p450cyp716a53v2基因(eno2啟動子，cyc1終止子)以及糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25-5(gal1/gal10gal1側(cè)啟動子，tdh2終止子)，構(gòu)成游離型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母by4742，并將擬南芥來源的細(xì)胞色素p450還原酶atr2-1(np_849472.2)整合于釀酒酵母by4742染色體中染色體trp1基因位點(gal1啟動子，利用trp1原有終止子)，構(gòu)建了重組酵母a3。重組酵母菌需補加的相應(yīng)氨基酸或尿嘧啶見表5。將重組酵母a3裂解液轉(zhuǎn)移到2mlep管中，每個管裝1ml，加入等體積(1ml)的正丁醇抽提約30min后12000g離心10min。吸取上清至一新的ep管中。45℃并真空條件下使正丁醇蒸干。用100μl甲醇溶解后用于hplc檢測。通過hplc分析，重組酵母a3的細(xì)胞裂解液中含有原人參三醇(ppt)及人參皂苷活性代謝物rh1(圖41)。實施例9糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt1，3gt2，3gt3和3gt4的大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建以實施例1構(gòu)建的含有3gt1和3gt2基因的質(zhì)粒3gt1-pmd18t，3gt2-pmd18t，為模板擴增目標(biāo)基因。3gt1和3gt2所用正向引物均為seqidno.:31，其5’端添加bamhi識別位點：ggatcc；3gt1所用反向引物為seqidno.:32，其5’端添加sali識別位點：ctcgag；3gt2所用反向引物為seqidno.:33，其5’端添加sali識別位點：ctcgag。利用上述引物和模板通過pcr方法擴增3gt1和3gt2基因。dna聚合酶選用toyobo公司的高保真dna聚合酶kod，參考其說明書設(shè)定pcr程序：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃1.5min，共35個循環(huán)；68℃10min；10℃保溫。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光下，切下與目標(biāo)dna大小一致的條帶。然后采用axygen公司的axyprepdnagelextractionkit從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。用takara公司的的quickcut限制性內(nèi)切酶kpni和xbai雙酶切回收的dna片段30min，用axygen公司的axypreppcrcleanupkit對酶切產(chǎn)物進行清潔回收。利用neb公司的t4dna連接酶將酶切產(chǎn)物與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pet28a(同樣以bamhi和sali酶切并割膠回收)16℃連接4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.coliepi300感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加50μg/ml卡那霉素的lb平板上。通過菌落pcr驗證陽性轉(zhuǎn)化子，并測序進一步驗證表達(dá)質(zhì)粒3gt1-pet28a和3gt2-pet28a構(gòu)建成功。以實施例1構(gòu)建的含有3gt3和3gt4基因的質(zhì)粒3gt3-pmd18t，3gt4-pmd18t，為模板擴增目標(biāo)基因。3gt3所用的正向引物如seqidno.:48所示，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：actttaagaaggagatatacc；3gt3所用反向引物為如seqidno.:49所示，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：ctcgagtgcggccgcaagctt。3gt4所用正向引物為seqidno.:50，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：actttaagaaggagatatacc；3gt4所用反向引物為seqidno.:51，其5’端添加了與載體pet28a同源的18個堿基片段：ctcgagtgcggccgcaagctt。利用上述引物通過pcr方法擴增3gt3和3gt4的基因。擴增基因選用neb公司的q5高保真dna聚合酶，參考其說明書設(shè)定pcr程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃2min；10℃保溫。同時，使用seqidno.:52和seqidno.:53分別作為正向和反向引物擴增載體pet28a，獲得線性化的載體pet28a。擴增pet28a線性化載體也選用neb公司的q5高保真dna聚合酶，參考其說明書設(shè)定pcr程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃3min，共35個循環(huán)；72℃2min；10℃保溫。上述3gt3和3gt4基因pcr產(chǎn)物以及線性化的載體pet28a，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外光下切下與目標(biāo)dna大小一致的條帶。然后采用axygen公司的axyprepdnagelextractionkit從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。參考諾晶生物科技有限公司的bgclonart無縫克隆試劑盒說明書，將回收的線性化的pet28a載體片段，回收的3gt3或者3gt4基因片段及諾晶生物科技有限公司的bgclonart無縫克隆反應(yīng)液以適當(dāng)比例進行混合，共20μl?；靹蚝笤?0℃孵育30分種，然后將混合反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到冰上。使用5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化e.coliepi300感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加50μg/ml卡那霉素的lb平板上。通過菌落pcr驗證陽性轉(zhuǎn)化子，并測序進一步驗證表達(dá)質(zhì)粒3gt3-pet28a和3gt4-pet28a構(gòu)建成功。實施例10糖基轉(zhuǎn)移酶基因3gt1，3gt2，3gt3和3gt4在大腸桿菌中的表達(dá)以實施例9構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體3gt1-pet28a，3gt2-pet28a，3gt3-pet28a和3gt4-pet28a，轉(zhuǎn)化到市售的e.colibl21中。接種一個重組子到lb培養(yǎng)基中，30℃200rpm培養(yǎng)至od600約0.6-0.8，使菌液降溫至4℃，加入終濃度為50μm的iptg，18℃200rpm誘導(dǎo)表達(dá)15h。4℃離心收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，4℃12000g離心收集細(xì)胞裂解液上清，取樣品進行sds-page電泳(圖20)。與pet28a空載體的重組子相比，3gt1-pet28a，3gt2-pet28a，3gt3-pet28a和3gt4-pet28a重組子有明顯的條帶(大約55kd)表征3gt1，3gt2，3gt3和3gt4。從westernblot的結(jié)果看(圖21)，也證明目標(biāo)蛋白3gt1，3gt2，3gt3和3gt4在宿主中實現(xiàn)了可溶表達(dá)。實施例11大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物3gt1，3gt2，3gt3和3gt4轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和產(chǎn)物的鑒定以表達(dá)3gt1，3gt2，3gt3和3gt4的重組大腸桿菌裂解上清為粗酶液來催化人參皂苷和皂苷元的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，表達(dá)空載體的重組大腸桿菌裂解上清為對照。100μl反應(yīng)體系如表3所示。反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物先用薄層層析(tlc)進行檢測(圖22-28)，用3gt1，3gt2，3gt3和3gt4的粗酶液可以將原人參二醇(ppd)的c3位羥基糖基化，分別轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷rh2(圖22，27(a)和28(a))；20位羥基已糖基化的原人參二醇型皂苷(ck)，可以在3gt1，3gt2和3gt4粗酶液的催化下，將3位羥基繼續(xù)糖基化，分別生成f2(圖22和28(b))；糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和3gt2還可以分別將達(dá)瑪烯二醇dm的c3位羥基糖基化，轉(zhuǎn)化為新化合物3-o-β-(d-glucopyranosyl)-dammarenediolii(圖23)；糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt2，3gt3和3gt4可以將25-oh-ppd的c3位羥基糖基化，轉(zhuǎn)化為新化合物3-o-β-(d-glucopyranosyl)-25-oh-ppd。(圖23，圖27(c)和圖28(c))；3gt1，3gt2和3gt3還可以將原人參三醇(ppt)的c3位羥基糖基化，轉(zhuǎn)化為之前沒有報道過的新皂苷3-o-β-(d-glucopyranosyl)-ppt(圖24和27(b))；3gt1和3gt2還可以將f1的c3位羥基糖基化，轉(zhuǎn)化為之前沒有報道過的新皂苷3-o-β-(d-glucopyranosyl)-f1(圖24)；3gt1和3gt2還可以將羊毛甾醇(lanosterol)的c3位羥基糖基化轉(zhuǎn)化為新化合物3-o-β-(d-glucopyranosyl)-lanosterol(圖26)。同時，3gt1和3gt2的催化活性并不受20位羥基或者糖基空間構(gòu)型的影響，例如既可以催化20(s)-ppd，也可以催化20(r)-ppd生成稀有人參皂苷20(r)-人參皂苷rh2(圖25)。雖然3gt1，3gt2，3gt3和3gt4四種糖基轉(zhuǎn)移酶都可以在四環(huán)三萜皂苷元的3位加入糖基，但是它們可以催化的底物譜有很大的差別。如表6所示，3gt1和3gt2可以催化的底物最多，3gt3可催化的底物最少，但是3gt4的專一性最好，它只能催化原人參二醇及原人參二醇型(ck)皂苷。進一步用hplc對3gt1，3gt3和3gt4催化ppd的產(chǎn)物進行檢測(圖29)。在圖29中，糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt3和3gt4催化ppd的產(chǎn)物中都出現(xiàn)了保留時間相同的峰(p1，p2和p3)，它們與標(biāo)樣中人參皂苷rh2的保留時間一致，說明糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt3和3gt4催化ppd生成了人參皂苷rh2。最后，用lc/ms對圖29中p1，p2和p3三個樣品峰作了質(zhì)譜鑒定(圖30)，它們與標(biāo)準(zhǔn)樣品人參皂苷rh2的質(zhì)譜完全一致，這進一步說明了糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt3和3gt4催化ppd生成的產(chǎn)物為rh2。糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1，3gt2，3gt3和3gt4可催化底物的比較如表6所示：表6實施例12產(chǎn)rh2酵母工程菌的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定12.1在pesc-his質(zhì)粒((stratagene，agilent)上，同時組裝達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediolsynthase)(acz71036.1)(gal1/gal10gal10側(cè)啟動子，adh1終止子)、細(xì)胞色素p450cyp716a47(aey75213.1)(fba1啟動子，cyc1終止子)以及糖基轉(zhuǎn)移酶3gt4(gal1/gal10gal1側(cè)啟動子，tdh2終止子)，構(gòu)成游離型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母by4742，并將擬南芥來源的細(xì)胞色素p450還原酶atr2-1(np_849472.2)整合于釀酒酵母by4742染色體中染色體trp1基因位點(gal1啟動子，利用trp1原有終止子)，構(gòu)建了重組酵母a1。重組酵母菌需補加的相應(yīng)氨基酸或尿嘧啶見表5。將重組酵母a1裂解液轉(zhuǎn)移到2mlep管中，每個管裝1ml，加入等體積(1ml)的正丁醇抽提約30min后12000g離心10min。吸取上清至一新的ep管中。45℃并真空條件下使正丁醇蒸干。用100μl甲醇溶解后用于hplc檢測。通過hplc分析(圖39)，重組酵母a1的細(xì)胞裂解液中含有達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇(ppd)及人參皂苷活性代謝物rh2。12.2方法同12.1，區(qū)別在于用糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1代替3gt4，得到重組酵母a5。結(jié)果見圖43，通過hplc分析，重組酵母a5的細(xì)胞裂解液中含有達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇(ppd)及人參皂苷活性代謝物rh2。實施例13糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29和ggt29-3的酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建分別以實施例1構(gòu)建的含有g(shù)gt29和ggt29-3基因的質(zhì)粒ggt29-pmd18t和ggt29-3-pmd18t為模板擴增目標(biāo)基因。ggt29所用正向引物均為(seqidno.:36)，其5’端添加kpni識別位點：ggatcc；所用反向引物均為(seqidno.:37)，其5’端添加xhoi識別位點：ctcgag，反向引物引入6×histag以便進行westernblot檢測表達(dá)和純化。ggt29-3所用正向引物均為(seqidno.:38)，其5’端添加kpni識別位點：ggatcc；所用反向引物均為(seqidno.:39)，其5’端添加xhoi識別位點：ctcgag，反向引物引入6×histag以便進行westernblot檢測表達(dá)和純化。以質(zhì)粒ggt29-pmd18t和ggt29-3-pmd18t為模板，利用上述引物通過pcr方法擴增ggt29和ggt29-3的基因。dna聚合酶選用toyobo公司的高保真dna聚合酶kod，參考其說明書設(shè)定pcr程序：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃1.5min，共30個循環(huán)；68℃10min；10℃保溫。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光下，切下與目標(biāo)dna大小一致的條帶。然后采用axygen公司的axyprepdnagelextractionkit從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。用takara公司的的quickcut限制性內(nèi)切酶kpni和xbai雙酶切回收的dna片段30min，用axygen公司的axypreppcrcleanupkit對酶切產(chǎn)物進行清潔回收。利用neb公司的t4dna連接酶將酶切產(chǎn)物與釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pyes2(同樣以kpni和xbai酶切并割膠回收)25℃連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colitop10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上。通過菌落pcr驗證陽性轉(zhuǎn)化子，并測序進一步驗證表達(dá)質(zhì)粒ggt29-pyes2和ggt29-3-pyes2構(gòu)建成功。實施例14糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29和ggt29-3在釀酒酵母中的表達(dá)通過電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒ggt29-pyes2和ggt29-3-pyes2轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中，涂布于篩選平板sc-ura(0.67％酵母無氨基酸基本氮源，2％葡萄糖)。通過菌落pcr驗證酵母重組子。挑酵母重組子菌落于10mlsc-ura(2％葡萄糖)培養(yǎng)基中，30℃200rpm培養(yǎng)20h。4℃3500g離心收集菌體，用無菌去離子水清洗菌體兩次，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基sc-ura(2％半乳糖)重懸菌體，并接種到50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使od600在0.4左右，30℃200rpm開始誘導(dǎo)表達(dá)。4℃3500g離心收集誘導(dǎo)表達(dá)12h的菌體，用無菌去離子水清洗菌體兩次，重懸于酵母裂解緩沖液中，使od600在50-100之間。用fastprep細(xì)胞破碎儀震蕩破碎酵母細(xì)胞，4℃12000g離心10min去除細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞裂解液上清。取適量裂解液上清進行sds-page電泳檢測，與pyes2空載體的重組子相比，ggt29-pyes2和ggt29-3-pyes2重組子沒有明顯的條帶表征(圖32)。采用anti-6×histagwesternblot檢測表達(dá)情況，表達(dá)ggt29和ggt29-3的釀酒酵母顯示很強的westernblot信號，表明ggt29和ggt29-3在酵母中均可溶表達(dá)，而轉(zhuǎn)pyes2空載體的重組子則沒有anti-6×histagwesternblot信號(圖33)。實施例15酵母表達(dá)產(chǎn)物ggt29和ggt29-3轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和產(chǎn)物鑒定以表達(dá)ggt29和ggt29-3的重組酵母裂解上清做為酶液來催化人參皂苷rh2和f2的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，表達(dá)空載體的重組酵母裂解上清為對照。100μl反應(yīng)體系如表3所示。反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物先用薄層層析(tlc)進行檢測，表達(dá)ggt29和ggt29-3的酵母宿主裂解上清酶液可以在人參皂苷rh2和f2的3位糖基再延伸一個糖基，轉(zhuǎn)化為人參皂苷rg3和rd(圖34)。ggt29和ggt29-3的催化活性不受人參皂苷20位糖基或者羥基構(gòu)型的影響，可以將20(r)-rh2轉(zhuǎn)化為20(r)-rg3(圖36)。實施例16糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1/3gt4和ggt29的聯(lián)合轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和產(chǎn)物鑒定以表達(dá)3gt1或3gt4的大腸桿菌宿主裂解上清和以表達(dá)ggt29的酵母宿主裂解上清做為酶液來共同催化原人參二醇(ppd)。100μl反應(yīng)體系如表3所示。73.4μl的酶液中40μl為3gt1的大腸宿主裂解上清，剩余33.4μl為表達(dá)ggt29的酵母宿主裂解上清。反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物先用薄層層析(tlc)進行檢測(圖35)，可以看到糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和ggt29或者3gt4和ggt29聯(lián)合使用都可將ppd轉(zhuǎn)化為rg3。糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1和ggt29或者3gt2和ggt29聯(lián)合使用都可以催化20(r)-ppd，生成20(r)-rg3(圖36)。實施例17產(chǎn)rg3酵母工程菌的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定17.1在pesc-his質(zhì)粒((stratagene，agilent)上，同時組裝達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediolsynthase)(acz71036.1)(gal1/gal10gal10側(cè)啟動子，adh1終止子)、細(xì)胞色素p450cyp716a47(aey75213.1)(fba1啟動子，cyc1終止子)以及糖基轉(zhuǎn)移酶3gt4和ggt29(gal1/gal10gal1側(cè)啟動子，tdh2終止子)，構(gòu)成游離型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母by4742，并將擬南芥來源的細(xì)胞色素p450還原酶atr2-1(np_849472.2)整合于釀酒酵母by4742染色體中染色體trp1基因位點(gal1啟動子，利用trp1原有終止子)，構(gòu)建了重組酵母a2。重組酵母菌需補加的相應(yīng)氨基酸或尿嘧啶見表5。將重組酵母a2裂解液轉(zhuǎn)移到2mlep管中，每個管裝1ml，加入等體積(1ml)的正丁醇抽提約30min后12000g離心10min。吸取上清至一新的ep管中。45℃并真空條件下使正丁醇蒸干。用100μl甲醇溶解后用于hplc檢測。通過hplc分析，重組酵母a2的細(xì)胞裂解液中含有達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇(ppd)和人參皂苷活性代謝物rg3(圖40)。17.2方法同17.1，區(qū)別在于用糖基轉(zhuǎn)移酶3gt1代替3gt4，得到重組酵母a6。通過hplc分析，重組酵母a6的細(xì)胞裂解液中也含有達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇(ppd)及人參皂苷活性代謝物rg3。實施例18產(chǎn)f1酵母工程菌的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定在pesc-his質(zhì)粒((stratagene，agilent)上，同時組裝達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediolsynthase)(acz71036.1)(gal1/gal10gal10側(cè)啟動子，adh1終止子)、糖基轉(zhuǎn)移酶ggt25(gal1/gal10gal1側(cè)啟動子，tdh2終止子)，細(xì)胞色素p450cyp716a47(aey75213.1)(fba1啟動子，fba1終止子)，細(xì)胞色素p450cyp716a53v2(eno2啟動子，cyc1終止子)。構(gòu)成游離型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母by4742，并將擬南芥來源的細(xì)胞色素p450還原酶atr2-1(np_849472.2)整合于釀酒酵母by4742染色體中染色體trp1基因位點(gal1啟動子，利用trp1原有終止子)，構(gòu)建了重組酵母a4。重組酵母菌需補加的相應(yīng)氨基酸或尿嘧啶見表5。將重組酵母a4裂解液轉(zhuǎn)移到2mlep管中，每個管裝1ml，加入等體積(1ml)的正丁醇抽提約30min后12000g離心10min。吸取上清至一新的ep管中。45℃并真空條件下使正丁醇蒸干。用100μl甲醇溶解后用于hplc檢測。通過hplc分析，重組酵母a4的細(xì)胞裂解液中含有原人參三醇(ppt)和人參皂苷活性代謝物f1(圖42)。實施例19糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7的大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建以實施例1構(gòu)建的含有g(shù)gt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7基因的質(zhì)粒ggt29-4-pmd18t，ggt29-5-pmd18t，ggt29-6-pmd18t和ggt29-7-pmd18t為模板擴增目標(biāo)基因。ggt29-5和ggt29-6基因所用的正向引物如seqidno.:66所示，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：ctggtgccgcgcggcagc；所用反向引物為如seqidno.:68所示，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：tgcggccgcaagcttgtc。ggt29-4和ggt29-7基因所用正向引物為seqidno.:67，其5’端添加了與載體pet28a同源的序列：ctggtgccgcgcggcagc；所用反向引物為seqidno.:68，其5’端添加了與載體pet28a同源的18個堿基片段：tgcggccgcaagcttgtc。利用上述引物通過pcr方法擴增ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7基因。擴增基因選用neb公司的q5高保真dna聚合酶，參考其說明書設(shè)定pcr程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃2min；10℃保溫。同時，使用seqidno.:69和seqidno.:70分別作為正向和反向引物擴增載體pet28a，獲得線性化的載體pet28a。擴增pet28a線性化載體也選用neb公司的q5高保真dna聚合酶，參考其說明書設(shè)定pcr程序：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃3min，共35個循環(huán)；72℃2min；10℃保溫。上述ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7基因pcr產(chǎn)物以及線性化的載體pet28a，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外光下切下與目標(biāo)dna大小一致的條帶。然后采用axygen公司的axyprepdnagelextractionkit從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。參考諾晶生物科技有限公司的bgclonart無縫克隆試劑盒說明書，將回收的線性化的pet28a載體片段，回收的ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-74基因片段及諾晶生物科技有限公司的bgclonart無縫克隆反應(yīng)液以適當(dāng)比例進行混合，共20μl。混勻后在50℃孵育30分種，然后將混合反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到冰上。使用5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化e.coliepi300感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加50μg/ml卡那霉素的lb平板上。通過菌落pcr驗證陽性轉(zhuǎn)化子，并測序進一步驗證表達(dá)質(zhì)粒ggt29-4-pet28a，ggt29-5-pet28a，ggt29-6-pet28a和ggt29-7-pet28a構(gòu)建成功。實施例20糖基轉(zhuǎn)移酶基因ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7在大腸桿菌中的表達(dá)以實施例19構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體ggt29-4-pet28a，ggt29-5-pet28a，ggt29-6-pet28a和ggt29-7-pet28a轉(zhuǎn)化到市售的e.colibl21中。接種一個重組子到lb培養(yǎng)基中，30℃200rpm培養(yǎng)至od600約0.6-0.8，使菌液降溫至4℃，加入終濃度為50μm的iptg，18℃200rpm誘導(dǎo)表達(dá)15h。4℃離心收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，4℃12000g離心收集細(xì)胞裂解液上清，取樣品進行sds-page電泳(圖44)。ggt29-4-pet28a，ggt29-5-pet28a，ggt29-6-pet28a和ggt29-7-pet28a重組子裂解液和總蛋白和上清中都有明顯的目的蛋白條帶(大約50kd)，分別表征糖基轉(zhuǎn)移酶ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7。從westernblot的結(jié)果看(圖45)，也證明目標(biāo)蛋白ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7在宿主中實現(xiàn)了可溶表達(dá)。實施例21大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和產(chǎn)物的鑒定以表達(dá)ggt29-4,ggt29-5,ggt29-6和ggt29-7的重組酵母裂解上清做為酶液來催化人參皂苷rh2和f2的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。100μl反應(yīng)體系如表3所示。反應(yīng)在35℃下進行12h，然后加入100μl丁醇終止反應(yīng)，并抽提產(chǎn)物。產(chǎn)物真空干燥后，用甲醇溶解。反應(yīng)產(chǎn)物用薄層層析(tlc)進行檢測，ggt29-6的粗酶液可以在人參皂苷rh2和f2的3位糖基上再延伸一個糖基，分別生成為人參皂苷rg3和rd(圖46)；ggt29-4,ggt29-5和ggt29-7的粗酶液可以在人參皂苷f2的3位糖基再延伸一個糖基生成皂苷rd,但是它們不能催化皂苷rh2(圖46)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一組糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用<130>p2017-1157<150>cn201210520787.5<151>2012-12-06<150>cn201310227689.7<151>2013-06-07<160>70<170>patentinversion3.5<210>1<211>1425<212>dna<213>人參(panaxginseng)<220><221>misc_feature<223>ggt25<400>1atgaagtcagaattgatattcttgcccgccccggccatcggacacctcgtgggaatggtg60gagatggctaaactcttcatcagtcgacatgaaaacctctcggtcaccgtcctcatcgcg120aaattctacatggatacgggggtagacaactacaataaatcactcttaacaaaccctacc180ccgcgtctcacaattgtaaatctcccggaaaccgacccccaaaactatatgc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