本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及重組菌株及其制備方法和生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：L-纈氨酸(L-valine)，化學(xué)名稱為L(zhǎng)-α-氨基異戊酸，分子式為C5H11NO2，相對(duì)分子質(zhì)量為117.15。呈白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，味苦，在水中溶解度：25℃為88.5g/L，50℃為96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等電點(diǎn)為5.96，熔點(diǎn)315℃。L-纈氨酸是人體八種必需氨基酸之一，又是三種支鏈氨基酸(包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地位。可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等。醫(yī)藥工業(yè)中，可作氨基酸輸液、綜合氨基酸制劑的主要成分，可治療肝功能衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，如缺乏可引起神經(jīng)障礙、停止發(fā)育、體重下降、貧血等。食品工業(yè)中，可用作食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)液及風(fēng)味劑等；米制糕餅中添加纈氨酸(1g/kg)，產(chǎn)品有芝麻香，用于面包亦能改善風(fēng)味；L-纈氨酸也可用作氨基酸功能性飲料與運(yùn)動(dòng)員飲料，有形成肌肉、強(qiáng)化肝功能、減輕肌肉疲勞等作用。飼料工業(yè)中，對(duì)動(dòng)物的乳腺組織分泌乳汁有重要的促進(jìn)作用，將其用于雛雞飼料中，可提高雛雞對(duì)雞新城疫病毒的免疫能力；而且L-纈氨酸是動(dòng)物飼料中的一種限制性氨基酸，所以L-纈氨酸可作為飼料添加劑改善動(dòng)物日糧中氨基酸含量的不足。L-纈氨酸的生產(chǎn)方法有三種：提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于原料來(lái)源受限制、生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)L-纈氨酸最主要的方法。通過(guò)菌株的選育，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和阻遏，達(dá)到過(guò)量積累L-纈氨酸的目的，是微生物發(fā)酵法工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的手段。棒桿菌是用于生產(chǎn)L-氨基酸的代表性微生物，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)和黃色短桿菌(Breviabacteriumflavum)。為了改善這些微生物的L-纈氨酸生產(chǎn)能力，可以通過(guò)傳統(tǒng)誘變和代謝工程等方法對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行不斷地改造。但傳統(tǒng)誘變育種由于隨機(jī)突變?cè)斐删晟L(zhǎng)緩慢及產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，不易獲得高產(chǎn)菌株。2010年徐大慶報(bào)道了一株黃色短桿菌基因工程菌株，其L-纈氨酸的產(chǎn)量為5.0g/L，副產(chǎn)物丙氨酸為3.55g/L。對(duì)于L-纈氨酸產(chǎn)量高、副產(chǎn)物少的基因工程菌株仍有需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了重組菌株及其制備方法和生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。本發(fā)明提供的重組菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，L-纈氨酸的產(chǎn)量可達(dá)12.2g/L，丙氨酸的濃度低至0.6g/L。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種重組菌株，以棒狀桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行改造，其改造包括：將ilvN基因進(jìn)行點(diǎn)突變和敲除avtA基因。在本發(fā)明中，點(diǎn)突變具體為：將乙酰羥酸合成酶的第20位的甘氨酸被天冬氨酸替代，第21位的異亮氨酸被天冬氨酸替代，以及第22位的異亮氨酸被苯丙氨酸替代。在本發(fā)明中，出發(fā)菌株為棒狀桿菌ATCC14067。在本發(fā)明提供的具體實(shí)施例中，重組菌株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.13406。本發(fā)明還提供了一種重組菌株的構(gòu)建方法，包括：以棒狀桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行改造，其改造包括：將ilvN基因進(jìn)行點(diǎn)突變和敲除avtA基因。在本發(fā)明中，改造采用sacB方法對(duì)棒狀桿菌基因組進(jìn)行遺傳改造。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)L-纈氨酸的方法，采用本發(fā)明提供的重組菌株或本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組菌株為發(fā)酵菌株。作為優(yōu)選，生產(chǎn)L-纈氨酸的方法為：將重組菌株接種到種子活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后接種到種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，最后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。作為優(yōu)選，以質(zhì)量百分含量計(jì)，種子活化培養(yǎng)基包括：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，葡萄糖0.5％，瓊脂2％，pH7.2。作為優(yōu)選，種子培養(yǎng)基包括：玉米漿2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.04％，磷酸二氫鉀0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2。作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基包括：玉米漿0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸銨4.0％，硫酸鎂0.04％，磷酸二氫鉀0.1％，CaCO34％，VH50μg/L，VB1·HCl100μg/L，pH7.2。作為優(yōu)選，種子培養(yǎng)的溫度為33℃，轉(zhuǎn)速為220r/min，時(shí)間為16～22h。作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為33℃，轉(zhuǎn)速為220r/min，時(shí)間為72h。本發(fā)明提供了重組菌株及其制備方法和生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。該重組菌株以棒狀桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行改造，其改造包括：將ilvN基因進(jìn)行點(diǎn)突變和敲除avtA基因。本發(fā)明至少具有如下有益效果之一：1、本發(fā)明對(duì)纈氨酸代謝路徑中的ilvN進(jìn)行點(diǎn)突變，將編碼轉(zhuǎn)氨酶的avtA基因敲除，得到重組菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，L-纈氨酸的產(chǎn)量可達(dá)12.2g/L。2、本發(fā)明構(gòu)建得到的重組菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中大大減少了副產(chǎn)物丙氨酸的生成。生物保藏說(shuō)明分類命名：谷氨酸棒桿菌，Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13406。附圖說(shuō)明圖1示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvNM13；圖2示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔavtA。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了重組菌株及其制備方法和生產(chǎn)L-纈氨酸的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。乙酰羥酸合酶(AHAS)是L-纈氨酸合成路徑中的第一個(gè)酶，也是關(guān)鍵酶，催化2分子丙酮酸脫羧合成1分子乙酰乳酸。乙酰羥酸合酶由大小兩個(gè)亞基組成，大亞基由ilvB基因編碼，具有催化活性；小亞基由ilvN基因編碼，起到反饋抑制的調(diào)控作用。該酶受到纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸的反饋抑制，其中纈氨酸的半抑制濃度為0.9mmol/L，由此可見(jiàn)，胞內(nèi)高濃度的纈氨酸會(huì)降低該酶的活性，從而不利于菌體積累纈氨酸。纈氨酸合成路徑的前體物為丙酮酸，丙酮酸在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化速度非?？?，可以經(jīng)過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的催化生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的催化以谷氨酸或者纈氨酸為氨基供體生成丙氨酸。在谷氨酸棒桿菌中，編碼該轉(zhuǎn)氨酶的基因有2個(gè)，分別為avtA和alaT。三羧酸循環(huán)為生物體的生長(zhǎng)提供充足的前體物質(zhì)，丙酮酸到丙氨酸的代謝通路由兩個(gè)酶催化，因此弱化丙酮酸到丙氨酸的代謝通路，為纈氨酸的合成提供充足的前體物，有利于提高纈氨酸的產(chǎn)量。根據(jù)棒狀桿菌中L-纈氨酸的代謝路徑，本發(fā)明以野生型ATCC14067為出發(fā)菌株，在其基因組上進(jìn)行相關(guān)改造，對(duì)纈氨酸代謝路徑中的ilvN進(jìn)行點(diǎn)突變，使得乙酰羥酸合成酶的第20位的甘氨酸被天冬氨酸替代，第21位的異亮氨酸被天冬氨酸替代以及第22位的異亮氨酸被苯丙氨酸替代，解除L-纈氨酸對(duì)乙酰羥酸合酶的反饋抑制。在此基礎(chǔ)上將編碼轉(zhuǎn)氨酶的avtA基因敲除，弱化其競(jìng)爭(zhēng)途徑，使得更多的丙氨酸流向纈氨酸的合成通路，降低副產(chǎn)物丙氨酸的積累。棒狀桿菌ATCC14067工程菌株的從頭構(gòu)建工作，利用了sacB方法對(duì)棒狀桿菌基因組進(jìn)行遺傳改造。以下實(shí)施例中使用引物序列見(jiàn)下表：表1引物序列引物名稱SEQIDNO.序列ilvNM13-f11cggggatcctctagaaacaacggaaacctilvNM13-r12cgtcgggtgaacatacctgatacgcgggaaaagtcatcgtctacgtcctgaacgagtacilvNM13-f23gatgacttttcccgcgtatcaggtatgtilvNM13-r24gccaagctttgcaattagacggtgtttgaavtA-f15cggggatccttgtctcttatgaagccaagavtA-r16cgtcatggagaagtacttggacaaggtaccccggggtaggcattgccacaavtA-f27ggtaccttgtccaagtacttavtA-r28gccaagctttctccgattttgcgcacacc本發(fā)明中涉及的基因名稱解釋如下：ilvBN：乙酰羥酸合酶；avtA：轉(zhuǎn)氨酶；VH：生物素；VB1·HCl：鹽酸硫胺素，化學(xué)式為C12H17ClN4OS·HCl。以下實(shí)施例中，所用試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。本發(fā)明提供的L-纈氨酸生產(chǎn)菌種的親代菌株為ATCC14067，菌種的拉丁學(xué)名是CorynebacteriumglutamicumATCC14067。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvNM13的構(gòu)建及在ATCC14067中引入點(diǎn)突變(1)pK18mobsacB-ilvNM13質(zhì)粒的構(gòu)建以ATCC14067基因組為模板，以ilvNM13-f1/ilvNM13-r1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到上游片段ilvNM13-up。以ATCC14067基因組為模板，以ilvNM13-f2/ilvNM13-r2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到下游片段ilvNM13-dn。以ilvNM13-up、ilvNM13-dn兩片段混合物為模板，以ilvNM13-f1/ilvNM13-r2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變的ilvNM13片段。ilvNM13片段用BamHI、HindIII進(jìn)行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙酶切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvNM13(圖1)。(2)ATCC14067中引入點(diǎn)突變按照谷棒經(jīng)典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制備ATCC14067感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvNM13以電穿孔方法轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，并在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中感興趣的基因由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)于普通液體腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的序列，核苷酸測(cè)序分析，獲得目的突變菌株，命名為MHZ-1012-1。實(shí)施例2：重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔavtA的構(gòu)建及在MHZ-1012-1中敲除avtA(1)pK18mobsacB-ΔavtA質(zhì)粒的構(gòu)建以ATCC14067基因組為模板，以avtA-f1/avtA-r1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到上游片段avtA-up。以ATCC14067基因組為模板，以avtA-f2/avtA-r2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到下游片段avtA-dn。以avtA-up、avtA-dn兩片段混合物為模板，以avtA-f1/avtA-r2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到avtA敲除片段。avtA敲除片段用BamHI、HindIII進(jìn)行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙酶切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔavtA(圖2)。(2)MHZ-1012-1中敲除avtA按照谷棒經(jīng)典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制備MHZ-1012-1感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔavtA以電穿孔方法轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，并在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中感興趣的基因由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)于普通液體腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的序列，核苷酸測(cè)序分析，獲得目的突變菌株，命名為MHZ-1012-2(保藏編號(hào)為CGMCCNo.13406)。實(shí)施例3：L-纈氨酸基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸1.培養(yǎng)基種子活化培養(yǎng)基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，葡萄糖0.5％，瓊脂2％，pH7.2。種子培養(yǎng)基：玉米漿2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.04％，磷酸二氫鉀0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸銨4.0％，硫酸鎂0.04％，磷酸二氫鉀0.1％，CaCO34％，VH50μg/L，VB1·HCl100μg/L,pH7.2。2.MHZ1012-1搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸(1)種子培養(yǎng)：挑取ATCC14067、MHZ1012-1、斜面種子1環(huán)接至裝有20mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養(yǎng)16-22h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)：將2mL種子液接種至裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養(yǎng)72h。(3)取1mL發(fā)酵液離心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC檢測(cè)工程菌與對(duì)照菌發(fā)酵液中的L-纈氨酸及丙氨酸含量，其濃度如下表所示。表2L-纈氨酸的產(chǎn)量及丙氨酸濃度菌株名稱L-纈氨酸濃度g/LL-丙氨酸濃度g/LATCC14067(出發(fā)菌)0.5-MHZ-1012-1(工程菌)6.32.4如上表中所示，出發(fā)菌株ATCC14067L-纈氨酸的積累量?jī)H為0.5g/L，而本發(fā)明的工程菌MHZ-1012-1的L-纈氨酸產(chǎn)量為6.3g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高12.6倍，實(shí)現(xiàn)了纈氨酸產(chǎn)量從無(wú)到有的突破。由此可見(jiàn)ilvN編碼的蛋白質(zhì)的20位甘氨酸被天冬氨酸替代，21位的異亮氨酸被天冬氨酸替代以及22位的異亮氨酸被苯丙氨酸替代即可解除纈氨酸對(duì)該蛋白的反饋抑制。MHZ-1012-1不僅積累了6.3g/L纈氨酸，副產(chǎn)物丙氨酸的積累量達(dá)到了2.4g/L，副產(chǎn)物丙氨酸的積累說(shuō)明乙酰羥酸合酶在解除纈氨酸反饋抑制的同時(shí)，其酶活有所下降，使得纈氨酸合成路徑的前體物丙酮酸積累，丙酮酸通過(guò)avtA、alaT編碼的轉(zhuǎn)氨酶的催化下生成丙氨酸，造成發(fā)酵液中有2.4g/L的丙氨酸的積累。在基因組上對(duì)ilvN進(jìn)行改造，解除纈氨酸對(duì)乙酰強(qiáng)酸合酶的反饋抑制與將該基因整合在質(zhì)粒上相比，避免了質(zhì)粒穩(wěn)定性對(duì)纈氨酸產(chǎn)量的影響，同時(shí)也不需要誘導(dǎo)，降低了生產(chǎn)的成本，簡(jiǎn)化了工業(yè)發(fā)酵的工藝流程，菌株纈氨酸的生產(chǎn)能力更加穩(wěn)定。3.MHZ1012-2搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸(1)種子培養(yǎng)：挑取ATCC14067、MHZ1012-1、MHZ1012-2、斜面種子1環(huán)接至裝有20mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養(yǎng)16-22h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)：將2mL種子液接種至裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養(yǎng)72h。(3)取1mL發(fā)酵液離心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC檢測(cè)工程菌與對(duì)照菌發(fā)酵液中的L-纈氨酸及丙氨酸含量，其濃度如下表所示。表3L-纈氨酸的產(chǎn)量及丙氨酸濃度菌株名稱L-纈氨酸濃度g/LL-丙氨酸濃度g/LATCC14067(出發(fā)菌)0.5-MHZ-1012-1(工程菌)6.32.4MHZ-1012-2(工程菌)12.20.6如上表中所示本發(fā)明的工程菌MHZ-1012-2的L-纈氨酸產(chǎn)量為12.2g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高24.4倍；與MHZ-1012-1相比，其纈氨酸的產(chǎn)量是MHZ-1012-1的1.9倍，副產(chǎn)物丙氨酸的濃度由2.4g/L下降到0.6g/L。由此可見(jiàn)avtA的敲除弱化了丙酮酸到丙氨酸的代謝通路，降低了該代謝通路對(duì)纈氨酸合成代謝通路的競(jìng)爭(zhēng)，使得更多地丙酮酸流向纈氨酸合成代謝通路。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司<120>重組菌株及其制備方法和生產(chǎn)L-纈氨酸的方法<130>MP1623789<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>1cggggatcctctagaaacaacggaaacct29<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>2cgtcgggtgaacatacctgatacgcgggaaaagtcatcgtctacgtcctgaacgagtac59<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3gatgacttttcccgcgtatcaggtatgt28<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gccaagctttgcaattagacggtgtttga29<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>5cggggatccttgtctcttatgaagccaag29<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>6cgtcatggagaagtacttggacaaggtaccccggggtaggcattgccaca50<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ggtaccttgtccaagtactt20<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8gccaagctttctccgattttgcgcacacc29當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3