本發(fā)明涉及多肽提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種來(lái)源于厚殼貽貝閉殼肌的降壓肽。

背景技術(shù)：

高血壓是對(duì)人類(lèi)健康危害嚴(yán)重的一種疾病，也是引起心血管疾病的主要因素，其危害是造成腦、心、腎等重要器官的損害。腦卒中和冠心病是高血壓最嚴(yán)重的并發(fā)癥。資料表明，世界各國(guó)的平均發(fā)病率為10% ～ 20%，每年因高血壓死亡的人數(shù)達(dá)1200 萬(wàn)。目前，我國(guó)現(xiàn)有高血壓患者已超過(guò)1.2 億人口。因此，治療和預(yù)防高血壓病是當(dāng)今社會(huì)十分重要的課題。

現(xiàn)階段高血壓病的醫(yī)學(xué)研究主要集中在ACE 的抑制物質(zhì)（ACEI）方面。目前，大多用化學(xué)合成的ACEI 如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴(lài)諾普利(Listinopril) 等藥物來(lái)治療高血壓。這類(lèi)藥物具有作用時(shí)間短，停藥后血壓易反彈等缺點(diǎn)，以及引起咳嗽、味覺(jué)喪失、腎臟損傷及血管神經(jīng)性水腫等副作用。血管緊張素源（RAS）和激肽源（KXS）在血壓調(diào)節(jié)方面是一對(duì)相互拮抗的體系，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）則對(duì)兩者起到調(diào)控作用，現(xiàn)在科學(xué)研究普遍認(rèn)為，ACE 過(guò)高是導(dǎo)致高血壓病的根本病因。所以要從根本上控制甚至治療高血壓病，必須要從一定程度上抑制ACE 的分泌。由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性（如高壓、低溫等），使得貽貝閉殼肌蛋白質(zhì)具有多種特異性氨基酸的組成和序列，貽貝閉殼肌蛋白質(zhì)水解后暴露出降壓的活性位點(diǎn)，從而使貽貝閉殼肌活性肽具有降壓效果。同時(shí)，貽貝閉殼肌蛋白活性肽具有低抗原性的特點(diǎn)，安全性高，無(wú)毒副作用。因此貽貝閉殼肌蛋白質(zhì)是制備降壓肽的重要藥源，貽貝閉殼肌降壓肽的開(kāi)發(fā)將成為高血壓非藥物治療的重要組成部分。

制備活性肽的方法主要有：直接提取、體外降解和利用重組DNA 技術(shù)、酶法或化學(xué)法合成活性肽。體外水解蛋白質(zhì)制備活性肽有三條工藝路線(xiàn)：酸水解、堿水解和酶法水解。前二者方法簡(jiǎn)單，但存在營(yíng)養(yǎng)和毒理方面的有害效應(yīng)，因此在食品加工中的應(yīng)用受到了極大的限制。蛋白質(zhì)的酶法水解一般不會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)方面的損失，也不會(huì)產(chǎn)生毒理上的問(wèn)題；同時(shí)酶作用具有特異性，可在溫和的條件下進(jìn)行，能耗也低，所以酶法水解在食品加工中經(jīng)常應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為CN102286590B的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了一種海蜇降壓肽的制備方法，包括：對(duì)海蜇的去金屬離子處理，并依次進(jìn)行勻漿、酶解、滅酶、濃縮、超濾及冷凍干燥等步驟，最終獲得純化的海蜇降壓肽粉末。本方法結(jié)合現(xiàn)代酶工程技術(shù)，提供了一種新的高效的海蜇降壓肽的生產(chǎn)途徑，提高了海蜇資源的利用效率，具有操作簡(jiǎn)單、提取率高、產(chǎn)物活性保存好的特點(diǎn)，海蜇降壓肽生產(chǎn)成本降低。其充分利用海蜇豐富的蛋白質(zhì)資源，通過(guò)去金屬離子處理將海蜇體內(nèi)各種金屬離子基本去除干凈，使后續(xù)酶解和應(yīng)用更加安全。用高血壓SHR 大鼠模型進(jìn)行海蜇降壓肽降壓活性試驗(yàn)結(jié)果顯示：該方法組與空白對(duì)照組相比差異有顯著性，本方法制備的海蜇降壓肽具有與陽(yáng)性對(duì)照卡托普利相似的降血壓活性。該方法只采用一種蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解不充分，且醇沉?xí)挂徊糠纸祲弘氖セ钚裕詈蟮玫降慕祲弘幕钚圆桓摺，F(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為CN102251003B的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了一種海洋生物源降壓肽的制備工藝，它包括如下步驟：（1）預(yù)處理海洋生物副產(chǎn)品，除掉海洋生物副產(chǎn)品的表面雜質(zhì)和脂肪；（2）酶法提取海洋生物源蛋白質(zhì)；（3）膜分離的工藝技術(shù)分離純化提取液，得到海洋生物源蛋白質(zhì)；（4）蛋白酶酶解海洋生物源蛋白質(zhì)，酶解結(jié)束后滅酶，得到海洋生物源降壓肽溶液；（5）噴霧干燥快速干燥海洋生物源降壓肽溶液，得到蛋白質(zhì)含量大于90％的海洋生物源降壓肽粉成品。采用上述工藝后，所制得海洋生物源降壓肽成本低、降壓活性高，平均相對(duì)分子量低、純度高，并充分利用了海洋生物副產(chǎn)品，變廢為寶，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該方法需要用到堿液和酸液，會(huì)產(chǎn)生酸堿廢水，對(duì)環(huán)境不友好；蛋白酶中沒(méi)有添加酶激活劑，酶解效率有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分子量小，純度高，活性強(qiáng)的來(lái)源于厚殼貽貝閉殼肌的降壓肽，其制備方法酶解充分，提取率高，操作簡(jiǎn)單。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：

一種來(lái)源于厚殼貽貝閉殼肌的降壓肽，具體操作步驟：

1）預(yù)處理：將厚殼貽貝閉殼肌取出，用清水清洗3~5次，高速勻漿，按料液體積比1:20~40加入去離子水，浸泡時(shí)間為0.5~1.2h，攪拌，攪拌速率為200~400r/min，過(guò)濾。通過(guò)高速勻漿將厚殼貽貝閉殼肌細(xì)胞破壞，讓細(xì)胞中的物質(zhì)流出。無(wú)機(jī)鹽、金屬離子和其他小分子溶于水的雜質(zhì)溶解在去離子水中，油脂漂浮在水面上，通過(guò)過(guò)濾，將這些雜志去除；

2）酶解：在沉淀中加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑按與底物質(zhì)量比1:200~1:400加入，復(fù)合酶制劑成份及其重量份為：10~15份胰蛋白酶，6~10份中性蛋白酶，5~8份木瓜蛋白酶，0.002~0.008份氯化鈣，0.001~0.005份半胱氨酸，0.0004~0.0009份棕櫚炔酸，0.0008~0.0014份十二烷基硫酸鈉和10~20份蒸餾水。酶解溫度為40~55℃，pH為6.2~7.8，酶解時(shí)間為0.8~2.5h。不使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酶解條件溫和，節(jié)省能源，不會(huì)破壞降壓肽活性；酶解具有高效性和專(zhuān)一性的特點(diǎn)，大大縮短了制備時(shí)間，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)流失；采用復(fù)合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人體吸收。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，滅酶時(shí)間為5~15min，過(guò)濾；

3）超濾：將得到的濾液注入離心超濾管，離心超濾管上的超濾膜為2000~4000Da，離心，離心速度為4000~8000r/min，取出內(nèi)管的目的蛋白。使用離心超濾管不會(huì)有濃度梯度，分離速度快，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的流失，脫鹽效果好，降壓肽提取率高；

4）純化：在得到的目的蛋白中按料液體積比1:10~20加入蒸餾水，超濾，超濾膜為30~50KD，施加的壓力為0.2~0.6Mpa?？捎行コ肿恿看笥?0~50KD的其他蛋白質(zhì)，對(duì)降壓肽進(jìn)一步純化，得到的降壓肽純度高；

5）干燥：將得到的濾出液真空冷凍干燥，真空冷凍干燥分為五個(gè)階段，第一階段，正常大氣壓，溫度為1~5℃，時(shí)間為2~8h；第二階段，真空度為0.002~0.005Kpa，溫度為-10~-3℃，時(shí)間為3~6h；第三階段，真空度為-0.008~-0.002Kpa，溫度為-50~-60℃，時(shí)間為10~20h；第四階段，真空度為0.004~0.006 Kpa，溫度為-2~4℃，時(shí)間為5~12h；第五階段，真空度為0.03~0.08 Kpa，溫度為6~12℃，時(shí)間為1~4h。將得到的塊狀物質(zhì)粉碎成粉末，得到純度高，活性強(qiáng)的降壓肽粉末。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)去離子水浸泡，去除無(wú)機(jī)鹽、金屬離子、其他小分子溶于水的雜質(zhì)和油脂；不使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酶解條件溫和，節(jié)省能源，不會(huì)破壞降壓肽活性；酶解具有高效性和專(zhuān)一性的特點(diǎn)，大大縮短了制備時(shí)間，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)流失；采用復(fù)合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人體吸收；使用離心超濾管提取降壓肽，不會(huì)有濃度梯度，分離速度快，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的流失，脫鹽效果好，降壓肽提取率高；再次超濾，可有效去除分子量大于30~50KD的其他蛋白質(zhì)，對(duì)降壓肽進(jìn)一步純化，得到的降壓肽純度高；本發(fā)明操作步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，產(chǎn)品質(zhì)量可控，成本低廉，經(jīng)濟(jì)效益高。

具體實(shí)施例

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1：

一種來(lái)源于厚殼貽貝閉殼肌的降壓肽，具體操作步驟：

1）預(yù)處理：將厚殼貽貝閉殼肌取出，用清水清洗3~5次，高速勻漿，按料液體積比1:20~40加入去離子水，浸泡時(shí)間為0.5~1.2h，攪拌，攪拌速率為200~400r/min，過(guò)濾。通過(guò)高速勻漿將厚殼貽貝閉殼肌細(xì)胞破壞，讓細(xì)胞中的物質(zhì)流出。無(wú)機(jī)鹽、金屬離子和其他小分子溶于水的雜質(zhì)溶解在去離子水中，油脂漂浮在水面上，通過(guò)過(guò)濾，將這些雜志去除；

2）酶解：在沉淀中加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑按與底物質(zhì)量比1:200~1:400加入，復(fù)合酶制劑成份及其重量份為：10~15份胰蛋白酶，6~10份中性蛋白酶，5~8份木瓜蛋白酶，0.002~0.008份氯化鈣，0.001~0.005份半胱氨酸，0.0004~0.0009份棕櫚炔酸，0.0008~0.0014份十二烷基硫酸鈉和10~20份蒸餾水。酶解溫度為40~55℃，pH為6.2~7.8，酶解時(shí)間為0.8~2.5h。不使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酶解條件溫和，節(jié)省能源，不會(huì)破壞降壓肽活性；酶解具有高效性和專(zhuān)一性的特點(diǎn)，棕櫚炔酸、十二烷基硫酸鈉提高了酶解效果，大大縮短了制備時(shí)間，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)流失，提高產(chǎn)率；采用復(fù)合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人體吸收。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，滅酶時(shí)間為5~15min，過(guò)濾；

3）超濾：將得到的濾液注入離心超濾管，離心超濾管上的超濾膜為2000~4000Da，離心，離心速度為4000~8000r/min，取出內(nèi)管的目的蛋白。使用離心超濾管不會(huì)有濃度梯度，分離速度快，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的流失，脫鹽效果好，降壓肽提取率高；

4）純化：在得到的目的蛋白中按料液體積比1:10~20加入蒸餾水，超濾，超濾膜為30~50KD，施加的壓力為0.2~0.6Mpa?？捎行コ肿恿看笥?0~50KD的其他蛋白質(zhì)，對(duì)降壓肽進(jìn)一步純化，得到的降壓肽純度高；

5）干燥：將得到的濾出液真空冷凍干燥，真空冷凍干燥分為五個(gè)階段，第一階段，正常大氣壓，溫度為1~5℃，時(shí)間為2~8h；第二階段，真空度為0.002~0.005Kpa，溫度為-10~-3℃，時(shí)間為3~6h；第三階段，真空度為-0.008~-0.002Kpa，溫度為-50~-60℃，時(shí)間為10~20h；第四階段，真空度為0.004~0.006 Kpa，溫度為-2~4℃，時(shí)間為5~12h；第五階段，真空度為0.03~0.08 Kpa，溫度為6~12℃，時(shí)間為1~4h。將得到的塊狀物質(zhì)粉碎成粉末，得到純度高，活性強(qiáng)的降壓肽粉末。

實(shí)施例2：

一種來(lái)源于厚殼貽貝閉殼肌的降壓肽，最優(yōu)選操作步驟：

1）預(yù)處理：將厚殼貽貝閉殼肌取出，用清水清洗4次，用粉碎機(jī)粉碎，高速勻漿，速率為3000r/min。按料液體積比1:30加入去離子水，浸泡時(shí)間為1.0h，攪拌，攪拌速率為280r/min，過(guò)濾。通過(guò)高速勻漿將厚殼貽貝閉殼肌細(xì)胞破壞，讓細(xì)胞中的物質(zhì)流出。無(wú)機(jī)鹽、金屬離子和其他小分子溶于水的雜質(zhì)溶解在去離子水中，油脂漂浮在水面上，通過(guò)過(guò)濾，將這些雜質(zhì)去除；

2）酶解：在沉淀中加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑按與底物質(zhì)量比1:250加入，復(fù)合酶制劑成份及其最優(yōu)選重量份為：14份胰蛋白酶，8份中性蛋白酶，6份木瓜蛋白酶，0.006份氯化鈣，0.004份半胱氨酸，0.0006份棕櫚炔酸，0.0012份十二烷基硫酸鈉和15份蒸餾水。酶解溫度為50℃，pH為7.0，酶解時(shí)間為1.5h。不使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酶解條件溫和，節(jié)省能源，不會(huì)破壞降壓肽活性；酶解具有高效性和專(zhuān)一性的特點(diǎn)，大大縮短了制備時(shí)間，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)流失；采用復(fù)合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人體吸收。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，滅酶時(shí)間為10min，過(guò)濾；

3）超濾：將得到的濾液注入離心超濾管，離心超濾管上的超濾膜為3000Da，離心，離心速度為5000r/min，取出內(nèi)管的目的蛋白。使用離心超濾管不會(huì)有濃度梯度，分離速度快，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的流失，脫鹽效果好，降壓肽提取率高；

4）純化：在得到的目的蛋白中按料液體積比1:15加入蒸餾水，超濾，超濾膜為40KD，施加的壓力為0.4Mpa。可有效去除分子量大于40KD的其他蛋白質(zhì)，對(duì)降壓肽進(jìn)一步純化，得到的降壓肽純度高；

5）干燥：將得到的濾出液真空冷凍干燥，真空冷凍干燥分為五個(gè)階段，第一階段，正常大氣壓，溫度為4℃，時(shí)間為6h；第二階段，真空度為0.004Kpa，溫度為-8℃，時(shí)間為5h；第三階段，真空度為-0.006Kpa，溫度為-55℃，時(shí)間為18h；第四階段，真空度為0.005 Kpa，溫度為-1℃，時(shí)間為9h；第五階段，真空度為0.07 Kpa，溫度為10℃，時(shí)間為2h。將得到的塊狀物質(zhì)粉碎成粉末，得到純度高，活性強(qiáng)的降壓肽粉末。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

步驟2中復(fù)合酶制劑與底物質(zhì)量比不僅限于1:200~1:400，還包括1:205或1:210或1：215，……，或1:390或1:395或1:400。

步驟3中離心超濾管的超濾膜規(guī)格不僅限于2000~4000Da，還包括2005 Da或2010 Da或2015 Da，……，或3990 Da或3995 Da或4000 Da。

步驟4中超濾膜的規(guī)格不僅限于30~50KD，還包括30.005 KD或30.01 KD或30.015 KD，……，或49.990 KD或49.995 KD或50.000 KD。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類(lèi)似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。