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      一種縊蟶抗氧化肽的制備方法與流程

      文檔序號:11145611閱讀:422來源:國知局

      本發(fā)明涉及多肽的制備技術領域,具體是一種縊蟶抗氧化肽的制備方法。



      背景技術:

      海洋貝類資源豐富且富含許多生理活性物質,因而逐漸被廣泛研究和應用??O蟶(Sinonovaculaconstricta)俗名蟶子,屬瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤科、縊蟶屬,在我國沿海均有分布,產(chǎn)量較大,為我國四大養(yǎng)殖貝類之一,縊蟶肉味鮮美,營養(yǎng)豐富,富含人體生命活動所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質??O蟶性寒、可補陰去邪熱,治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱等癥,具有較高的藥用食用價值,對縊蟶肉的酶解條件進行研究,發(fā)現(xiàn)提取得到的糖胺聚糖對體外培養(yǎng)的HL-60細胞均有一定抑制作用,且隨著用量增加抑制作用增強。張永娟等,提取縊蟶多肽能促進小鼠胸腺和脾臟發(fā)育及遲發(fā)型變態(tài)反應的發(fā)生,提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平;PSD還能提高血清SOD、GSH-Px水平,降低血清MDA 含量。

      活性多肽由于具有敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少等優(yōu)點,已被用作抗腫瘤藥物開發(fā)的一個重要來源。研究已經(jīng)證實,食物蛋白通過蛋白酶酶解方式,可以得到功能多樣的活性多肽。對于縊蟶,在抗高血壓方面的研究還很少,特別是利用酶解技術提取多肽在抗腫瘤方面的研究并未見報道。

      現(xiàn)在已有很多研究采用酶解技術成功提取了動物多肽,說明從縊蟶中提取抗氧化肽可行性很高?,F(xiàn)有技術如授權公告號為CN104004808B的中國專利,公開了一種具有抗凝血與溶血栓全蝎多肽及其酶解制備方法與應用,制備方法包括:全蝎干體清洗干燥,粉粹成粉末;加入水均勻攪拌,pH 調(diào)至7~10,以100~300r/min 的速度勻速攪拌1h~3h,離心,上清液pH 調(diào)至3~7,得蛋白沉淀;將蛋白加水溶解,比例為5~20g :100mL,pH 調(diào)至7.5~10,再加入堿性蛋白酶,該酶體積與蛋白重量之比0.1~5mL :100g,溫度40~80℃,攪拌速度100~300r/min,時間1~5h ;將酶解液通過陰離子交換柱分離純化,收集干燥,得抗凝血肽粉。該方法為抗凝血類活性物質增加了新來源,實現(xiàn)原料的充分利用,具有產(chǎn)品活性高、制備過程方便可行、環(huán)保等優(yōu)點,所制得的抗凝血肽粉可作為預防血栓、溶血栓、降血稠類食品的原料。該方法制備的抗凝血肽粉中有一部分多肽在制備過程中失去了活性,且多肽提取率和純度都有待提高。



      技術實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單,提取率高,提取的抗氧化肽純度高,活性強的縊蟶抗氧化肽的制備方法。

      本發(fā)明針對背景技術提到的問題,采取的技術方案為:

      1)酶解:將縊蟶用冰水沖洗2~4次,將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈,瀝干。在鼓風機中干燥,溫度為50~70℃,干燥時間1~2h,用粉碎機粉碎,過100~400目篩,按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.2~1.8 mol/L,水浴加熱攪拌,用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復合酶制劑木瓜蛋白酶6~12份,中性蛋白酶5~10份,半胱氨酸0.5~1.2份,亞硫酸鈉0.05~0.08份,氯化鈣0.2~0.5份,聚谷氨酸0.01~0.02份和甲鈷胺0.002~0.005份和助溶劑水楊酸鈉4~12份,瓜氨酸0.05~0.08份和氨甲酰磷酸0.008~0.012份。使用上述復合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗氧化肽,不會破壞抗氧化肽的活性,而且酶解速度快,縮短反應時間。加入助溶劑能抗氧化肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加,提高抗氧化肽的提取率。酶解溫度為50~60℃,pH為6.5~7.2,酶解時間為3~5h,離心取上清液,加入析出劑硫酸銨2~5份,氯化鈉1~4份,靜置過濾得粗抗氧化肽。上述析出劑能使抗氧化肽分子周圍的水化膜減弱或消失,析出率高,而且雜質蛋白質和多肽的析出少;

      2)超濾:在步驟1得到的抗氧化肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.2~1.8 mol/L,選用3000~4500Da的超濾膜進行超濾,壓力為1000~2000Pa;

      3)制備縊蟶抗氧化肽:將步驟2得到的超濾液過HPLC柱,固定相為ZrO2/SiO2,流動相為1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩沖液,收集含抗氧化肽的洗脫液,旋轉蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗氧化肽固體,冷凍干燥,研磨,得到縊蟶抗氧化肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗氧化肽純度高,活性強,抗高血壓作用很好;使用酶解技術制備縊蟶抗氧化肽綠色安全,可放心用于抗氧化保健品或藥物的生產(chǎn)。

      與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明的優(yōu)點在于:采用復合酶制劑木瓜蛋白酶,中性蛋白酶,半胱氨酸,亞硫酸鈉,氯化鈣,聚谷氨酸和甲鈷胺酶解縊蟶,不僅能得到抗氧化肽,不會破壞抗氧化肽的活性,而且酶解速度快,縮短反應時間;加入助溶劑水楊酸鈉,瓜氨酸和氨甲酰磷酸能抗氧化肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加,提高抗氧化肽的提取率;析出劑硫酸銨,氯化鈉能使抗氧化肽分子周圍的水化膜減弱或消失,析出率高,而且雜質蛋白質和多肽的析出少;制備的縊蟶抗氧化肽純度高,活性強,抗氧化作用很好;使用酶解技術制備縊蟶抗氧化肽綠色安全,可放心用于抗氧化保健品或藥物的生產(chǎn);操作步驟簡單,成本低廉,適合大規(guī)模生產(chǎn)。

      具體實施例

      下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明:

      實施例1:

      一種縊蟶抗氧化肽的制備方法,具體操作步驟為:

      1)酶解:將縊蟶用冰水沖洗2~4次,將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈,瀝干。在鼓風機中干燥,溫度為50~70℃,干燥時間1~2h,用粉碎機粉碎,過100~400目篩,按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.2~1.8 mol/L,水浴加熱攪拌,用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復合酶制劑木瓜蛋白酶6~12份,中性蛋白酶5~10份,半胱氨酸0.5~1.2份,亞硫酸鈉0.05~0.08份,氯化鈣0.2~0.5份,聚谷氨酸0.01~0.02份和甲鈷胺0.002~0.005份和助溶劑水楊酸鈉4~12份,瓜氨酸0.05~0.08份和氨甲酰磷酸0.008~0.012份。使用上述復合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗氧化肽,不會破壞抗氧化肽的活性,而且酶解速度快,縮短反應時間。加入助溶劑能抗氧化肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加,提高抗氧化肽的提取率。酶解溫度為50~60℃,pH為6.5~7.2,酶解時間為3~5h,離心取上清液,加入析出劑硫酸銨2~5份,氯化鈉1~4份,靜置過濾得粗抗氧化肽。上述析出劑能使抗氧化肽分子周圍的水化膜減弱或消失,析出率高,而且雜質蛋白質和多肽的析出少;

      2)超濾:在步驟1得到的抗氧化肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.2~1.8 mol/L,選用3000~4500Da的超濾膜進行超濾,壓力為1000~2000Pa;

      3)制備縊蟶抗氧化肽:將步驟2得到的超濾液過HPLC柱,固定相為ZrO2/SiO2,流動相為1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩沖液,收集含抗氧化肽的洗脫液,旋轉蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗氧化肽固體,冷凍干燥,研磨,得到縊蟶抗氧化肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗氧化肽純度高,活性強,抗氧化作用很好;使用酶解技術制備縊蟶抗氧化肽綠色安全,可放心用于抗氧化保健品或藥物的生產(chǎn)。

      實施例2:

      一種縊蟶抗氧化肽的制備方法,最優(yōu)選操作步驟為:

      1)酶解:將縊蟶用冰水沖洗3次,將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈,瀝干。在鼓風機中干燥,溫度為65℃,干燥時間1.5h,用粉碎機粉碎,過200目篩,按料液體積比為1:25加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.5mol/L,水浴加熱攪拌,用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復合酶制劑木瓜蛋白酶7份,中性蛋白酶7份,半胱氨酸0.5份,亞硫酸鈉0.07份,氯化鈣0.4份,聚谷氨酸0.02份和甲鈷胺0.004份和助溶劑水楊酸鈉8份,瓜氨酸0.06份和氨甲酰磷酸0.01份。使用上述復合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗氧化肽,不會破壞抗氧化肽的活性,而且酶解速度快,縮短反應時間。加入助溶劑能抗氧化肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加,提高抗氧化肽的提取率。酶解溫度為55℃,pH為7.0,酶解時間為4h,離心取上清液,加入析出劑硫酸銨3份,氯化鈉2.5份,靜置過濾得粗抗氧化肽。上述析出劑能使抗氧化肽分子周圍的水化膜減弱或消失,析出率高,而且雜質蛋白質和多肽的析出少;

      2)超濾:在步驟1得到的抗氧化肽中按體積比1:14加入Tris—HCl緩沖液,濃度為1.5 mol/L,選用4000Da的超濾膜進行超濾,壓力為1500Pa;

      3)制備縊蟶抗氧化肽:將步驟2得到的超濾液過HPLC柱,固定相為ZrO2/SiO2,流動相為1.5mol/L 的Tris—HCl緩沖液,收集含抗氧化肽的洗脫液,旋轉蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗氧化肽固體,冷凍干燥,研磨,得到縊蟶抗氧化肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗氧化肽純度高,活性強,抗氧化作用很好;使用酶解技術制備縊蟶抗氧化肽綠色安全,可放心用于抗氧化保健品或藥物的生產(chǎn)。

      以上實施方式僅用于說明本發(fā)明,而并非對本發(fā)明的限制,本領域的普通技術人員,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,還可以做出各種變化和變型。因此,所有等同的技術方案也屬于本發(fā)明的范疇,本發(fā)明的專利保護范圍應由權利要求限定。

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