本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
,涉及一種狗尾草農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化方法,具體是一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：C4光合作用是驅(qū)動(dòng)幾種主要糧食作物和生物能源草類(lèi)的生產(chǎn)力，包括玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、高粱(Sorghumbicolor)、芒草(Miscanthusgiganteus)和柳枝稷(Panicumvirgatum)等。狗尾草(Setariaviridis)是一個(gè)真正的二倍體，具有許多適于遺傳分析的特性，包括相對(duì)較小的基因組(510Mb)，身材矮小，生命周期短和種子量大等等，因此，狗尾草是研究C4光合作用的優(yōu)秀模型，同時(shí)也是研究非生物脅迫耐受性和生物能源原料的模型。狗尾草在形態(tài)上類(lèi)似于大多數(shù)禾本科草，包括主要生物能源作物柳枝稷(Panicumvirgatum)和芒草(Miscanthusgiganteus)等，在地理上廣泛分布，并且占據(jù)多樣化的生態(tài)位。目前，狗尾草的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要采用成熟種子發(fā)芽后，從幼芽節(jié)點(diǎn)分生組織處誘導(dǎo)胚性愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，這種方法的最大問(wèn)題是胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低，因品系和種子狀況不同，一般胚性愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)與種子數(shù)的比率都小于10％；其次是胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，從接種子到培養(yǎng)基獲得第一階段的少量胚性愈傷組織需要約一個(gè)月時(shí)間，之后需要繼代2次(每半月繼代一次)后才有足夠的胚性愈傷組織用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，整個(gè)轉(zhuǎn)化周期需要約4個(gè)月時(shí)間；同時(shí)，這種胚性愈傷組織不耐繼代，不能長(zhǎng)期繼代保存用于轉(zhuǎn)化，繼代3次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化效率明顯降低，不適合繼續(xù)用于轉(zhuǎn)化；此外，胚性愈傷組織的挑選需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。這些都降低了這套轉(zhuǎn)化技術(shù)的靈活性和簡(jiǎn)單實(shí)用性。作為重要的模式植物，為狗尾草建立更簡(jiǎn)單、靈活、周期短、高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究方向。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法，以狗尾草成熟種子為外植體，誘導(dǎo)露芽后用金剛砂進(jìn)行創(chuàng)傷處理，處理后用農(nóng)桿菌進(jìn)行浸染，經(jīng)共培養(yǎng)、抑菌、篩選與植株再生得到轉(zhuǎn)基因植株，具有簡(jiǎn)單、靈活、快速、高效等特點(diǎn)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法，其具體步驟如下：1、外植體的處理和活化選取經(jīng)休眠處理的狗尾草干燥成熟種子，將去除種皮后的種子裝入離心管，用有效濃度為1～3％的次氯酸鈉溶液滅菌消毒處理，無(wú)菌水清洗后，按質(zhì)量體積比：種子：芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基＝1:6～8的比例在離心管中加入芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1～7天，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，并添加激素；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。2、金剛砂創(chuàng)傷處理及農(nóng)桿菌浸染按照種子體積稱(chēng)取等量的中等目度的金剛砂(即按體積比：種子：金剛砂＝1:1)，高溫滅菌處理，倒掉離心管中的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，加入金剛砂,然后加入少量含有0.6～1.0OD600nm農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基,在渦旋振蕩器下高速處理2～3分鐘，再加入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基，使含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基的總體積為種子體積的8～12倍(即按體積比：種子：浸染農(nóng)桿菌液＝1:8～12)，低速振蕩浸染0.5～1小時(shí)，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述浸染培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，微量元素含量加倍，PH值為5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L、表面活性劑0.1～1％(如Synperonic,質(zhì)量體積比)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。3、共培養(yǎng)將浸染后的種子接到帶濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3～9天，培養(yǎng)溫度在20～28℃之間(可根據(jù)使用的不同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行調(diào)整)。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。4、抑菌和篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的種子接到抑菌和篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，篩選分兩個(gè)階段：第一階段，先在抑菌和篩選培養(yǎng)基中添加篩選劑的半致死計(jì)量，篩選1周；第二階段，將經(jīng)過(guò)第一階段篩選的種子繼代到添加篩選劑全致死計(jì)量的抑菌和篩選培養(yǎng)基中，篩選3～4周。培養(yǎng)條件：先暗培養(yǎng)，最后1～2周光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述抑菌和篩選培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，添加激素、抑制農(nóng)桿菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。5、抗性愈傷成苗培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)篩選階段誘導(dǎo)的胚性愈傷組織繼代到成苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃，培養(yǎng)時(shí)間2～4周。所述成苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中有機(jī)元素和微量元素含量加倍，蔗,15～20g/L，pH值為5.0～6.0，添加激素、抑制農(nóng)桿菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)，不添加或添加篩選劑半致死計(jì)量。所述激素是2,4-D、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。6、生根培養(yǎng)將在成苗培養(yǎng)基上再生的達(dá)到1cm以上的芽單獨(dú)取出，接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃，培養(yǎng)時(shí)間1～2周。所述生根培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，蔗糖含量減半，pH值為5.0～6.0，添加篩選劑半致死計(jì)量，添加或不添加IBA，其添加量為：10mg/L以下。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，易操作，以成熟的狗尾草種子為外植體，種子經(jīng)發(fā)芽活化處理后，用金剛砂輔助造成傷口，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，大大提高了狗尾草的轉(zhuǎn)化效率，縮短了轉(zhuǎn)化周期，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)化程序，擴(kuò)大了轉(zhuǎn)化品系的范圍，為狗尾草建立了一種靈活、周期短、高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。附圖說(shuō)明圖1是用于轉(zhuǎn)化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)質(zhì)粒載體圖。圖2是狗尾草不同品系(A10,ME34)種子金剛砂(emery)輔助處理時(shí)共培養(yǎng)不同階段(3天，5天，7天，9天)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)差異圖。A10、ME34品系左邊的都為不使用金剛砂輔助的轉(zhuǎn)化效果，右邊都為使用金剛砂輔助效果；使用金剛砂輔助種子轉(zhuǎn)化的效率明顯高于不使用的：當(dāng)共培養(yǎng)3天時(shí)，金剛砂處理的種子幼芽都已GUS染色，轉(zhuǎn)化基因的瞬時(shí)表達(dá)效果非常強(qiáng)，而沒(méi)有金剛砂處理的種子幼芽幾乎沒(méi)有被染色，瞬時(shí)表達(dá)效果很差，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，非處理的種子瞬時(shí)表達(dá)情況有增加，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如金剛砂處理的表達(dá)效果。圖3是pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化苗GUS染色情況。從圖可以看出，經(jīng)金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子后篩選出的抗性苗幾乎都是純合的轉(zhuǎn)基因苗，整株都能被GUS染色。圖4是狗尾草成熟種子金剛砂輔助農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化的優(yōu)化基本程序。種子活化(activeseeds)5天，浸染和共培養(yǎng)(transformation)5天,低濃度篩選(selection1)1周,高濃度暗篩選(selection2)2周，高濃度光篩選(selection3)2周，成苗培養(yǎng)(regeneration)2周。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例1、外植體的處理和活化選取經(jīng)休眠處理的狗尾草品系A(chǔ)10和ME34干燥成熟種子，去除種皮后將各約1克種子分別裝入兩個(gè)14ml離心管，用有效濃度1％的次氯酸鈉溶液滅菌消毒處理，無(wú)菌水清洗后，在離心管中加入約一半體積的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)5天，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(微量元素含量加倍)，pH為5.8，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT。2、金剛砂創(chuàng)傷處理及農(nóng)桿菌浸染按照種子體積比(1:1)稱(chēng)取金剛砂(120目和320目各一半重量)，高溫滅菌處理，倒掉離心管中的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，加入金剛砂。加入少量含有0.6OD600nm農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基(液體),在渦旋振蕩器下高速處理2分鐘，然后再加入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基，使浸染培養(yǎng)基的總體積為10mL，低速振蕩浸染40分鐘，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。浸染培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素含量減半，微量元素含量加倍)，pH值為5.2，添加2mg/L2,4-D，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L，添加表面活性劑Synperonic0.1％(質(zhì)量體積比)。農(nóng)桿菌為AGL1菌株，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)見(jiàn)圖1(GUS標(biāo)記)，用帶50mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基涂板，在20℃暗培養(yǎng)3～5天后取菌塊用浸染培養(yǎng)基重懸為0.6OD600nm，農(nóng)桿菌液輕搖活化2～3小時(shí)后用于轉(zhuǎn)化。3、共培養(yǎng)將浸染后的種子接到帶濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3～9天，培養(yǎng)溫度為20℃。共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，大量元素含量減半，微量元素含量加倍，pH值為5.2，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L。分別在不同共培養(yǎng)階段(3天、5天、7天、9天)取A10、ME34種子做GUS染色瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，從圖2可見(jiàn)用金剛砂(emery)輔助處理轉(zhuǎn)化的種子GUS瞬時(shí)表達(dá)明顯比不輔助處理的強(qiáng)，因此金剛砂輔助處理能明顯提高活化種子的轉(zhuǎn)化效率。4、抑菌和篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)5天后的種子接到抑菌和篩選培養(yǎng)基上，抑菌和篩選培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，微量元素含量加倍，pH值為5.8，添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加抑制農(nóng)桿菌的抗生素150mg/L特美丁(Timentin)，添加篩選劑25mg/L潮霉素(Hygromycin)。1周后繼代到潮霉素提高到45mg/L的抑菌和篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周。培養(yǎng)條件：先暗培養(yǎng)，后2周光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。觀(guān)察抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)抗性胚性愈傷組織數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表1，抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(抗性胚性愈傷組織數(shù)/出芽種子數(shù))A10達(dá)49％，ME34達(dá)34％。表1抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況狗尾草品系出芽種子數(shù)抗性胚性愈傷組織數(shù)誘導(dǎo)率A1050024549％ME3450017034％5、抗性愈傷成苗培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)篩選階段誘導(dǎo)的抗性胚性愈傷組織，繼代到成苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。成苗培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有機(jī)和微量元素含量加倍，蔗糖20g/L，pH值為5.8，添加1.5mg/LKT，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培養(yǎng)時(shí)間2周。觀(guān)察抗性愈傷成苗培養(yǎng)情況，統(tǒng)計(jì)叢芽數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表2，基本每塊抗性愈傷都能誘導(dǎo)出叢芽。表2植株再生情況狗尾草品系抗性胚性愈傷組織數(shù)愈傷再生叢芽數(shù)誘導(dǎo)率A1015014798％ME3415013892％6、生根培養(yǎng)將在成苗培養(yǎng)基上再生的達(dá)到約1cm以上的芽單獨(dú)取出，接到生根培養(yǎng)基上生根，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。生根培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，大量元素含量減半，蔗糖含量減半，pH值為5.8，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培養(yǎng)時(shí)間1～2周。觀(guān)察生根培養(yǎng)情況，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，計(jì)算生根率，結(jié)果見(jiàn)表3。將經(jīng)過(guò)篩選再生的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行GUS染色檢測(cè)，染色情況見(jiàn)圖3。表3生根培養(yǎng)情況狗尾草品系叢芽數(shù)叢芽生根數(shù)生根率A1012011394.1％ME3412010285％以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3