農(nóng)桿菌介導(dǎo)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子菌株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物育種領(lǐng)域，尤其涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)英白黑粉菌（ escWeflia )轉(zhuǎn)化子菌株及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茭白是我國特有的水生蔬菜，在我國的絕大部分省份均有種植，生產(chǎn)經(jīng)濟效益很 高。作為蔬菜的英白主要是受英白黑粉菌escwAwia)侵染而膨大為肉質(zhì)莖?，F(xiàn) 有研究表明，自然界中，植物芽變的頻率是非常低的，而茭白可以在很小的群體內(nèi)分離出較 多較大的穩(wěn)定變異，因此，雖然目前對于黑粉菌侵染茭白的機理尚未完全闡明，但可以據(jù)此 推測茭白的變異主要不是來自茭白植株的芽變，而是來自茭白黑粉菌的遺傳變異。
[0003] -般認為，黑粉菌是重要的植物病原菌，由黑粉菌引起的植物病害稱為黑粉病。 危害玉米的黑粉病主要有絲孢堆黑粉菌和玉米黑粉菌（大麥堅黑粉菌 Aorofei)則引起大麥、燕麥、筱麥和青稞黑粉病。但是，英白黑粉菌則有所不同， 在茭白黑粉菌特異性地侵染茭白后，宿主以及真菌本身產(chǎn)生大量的植物激素(吲哚乙酸)， 使得莖部膨大長出可食用的瘤。因此，茭白黑粉菌的遺傳調(diào)控是茭白育種的關(guān)鍵之一，由于 茭白黑粉菌便于實驗室操作，一旦在遺傳操作上有所突破，它必將是茭白育種中的一個新 的重要突破口，不僅為闡明茭白黑粉菌侵染機理提供技術(shù)支撐，從而有利于實現(xiàn)茭白黑粉 菌向茭白植株的成功接種，而且可以在此基礎(chǔ)上通過黑粉菌的不同菌株和茭白的不同品種 植株進行接種組合，可獲得所需要的茭白品種類型，從而建立更好的茭白育種平臺。
[0004] 對于真菌中常用的轉(zhuǎn)化方法有基于原生質(zhì)體制備和再生的PEG-CaClJi、電轉(zhuǎn)化 法、基因槍法、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合（REMI)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(ATMT) 15PEG-CaCU法是目前 應(yīng)用最為廣泛的方法，可以將單個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，也可以兩個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體， 即共轉(zhuǎn)化。但是原生質(zhì)體制備和再生的過程復(fù)雜、重復(fù)性差，這就造成了 PEG-CaCl2法操作 繁瑣、轉(zhuǎn)化效率低。雖然電轉(zhuǎn)化法、基因槍法可以用分生孢子作為受體，但是這類方法的轉(zhuǎn) 化效率也很低。REMI是一種將線性化的質(zhì)粒DNA隨機插入到生物體基因組DNA中從而產(chǎn)生 插入突變的技術(shù)，但該技術(shù)產(chǎn)生的突變體有30%-50%不是插入突變引起的，假陽性高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)茭白黑粉菌 轉(zhuǎn)化子菌株，本發(fā)明的第二個目的是提供上述的茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子菌株的制備方法，本發(fā) 明的第三個目的是提供上述的茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子菌株的應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 農(nóng)桿菌介導(dǎo)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子菌株，該轉(zhuǎn)化子菌株的農(nóng)桿菌感染受體為茭白黑粉菌 iUstilago esculenta、。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的農(nóng)桿菌采用農(nóng)桿菌菌株AGL-1，農(nóng)桿菌菌株GV3101或農(nóng)桿菌菌 株EHA105。最優(yōu)選，農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的農(nóng)桿菌的基因表達載體采用植物pCAMBIA1301表達載體，并用 來自構(gòu)巢曲霉gpda(glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase,三憐酸甘油醒脫氫酶 基因）啟動子和hsp70 (heat-shock protein 70-encoding gene,熱激蛋白基因）啟動子 中的一種或兩種替換植物表達載體中的35S啟動子?；蛘?，農(nóng)桿菌的基因表達載體以pPK2 載體為骨架，通過Infusion的同源重組方法插入各種目的片段構(gòu)建所需表達載體。目前直 接能用于真菌的載體很少，所以本發(fā)明通過改造植物PCAMBIA1301表達載體來進行茭白黑 粉菌的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)然，采用現(xiàn)有的真菌表達載體也可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的植物PCAMBIA1301表達載體插入適用于真菌系統(tǒng)的SGFP報告基 因或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II位點。為了便于后續(xù)表達的檢測，本發(fā)明可以插入適用于真菌系 統(tǒng)的SGFP報告基因；另外，本發(fā)明的主要有潮霉素抗性基因 hyg，可以用潮霉素進行有效篩 選，以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II位點，可以用G418 (遺傳霉素）進行篩選。
[0010] 為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 上述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子菌株的一種制備方法，該方法包括以下的步驟： 1) 制備真菌表達載體； 2) 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備； 3) 電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌； 4) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得所述的轉(zhuǎn)化子。
[0011] 作為優(yōu)選，上述的步驟1)包括以下的步驟： ① 將gpdA和hsp70啟動子序列從現(xiàn)有其它基因載體中PCR擴增出來，在5'加上BstXI 位點，在3'加上ApaI位點，克隆至T載體； ② 將pCambial301載體上含AatII的片段PCR擴增出來，在5'加上ApaI位點，在3' 加上其他合適的T載體上有的酶切位點，然后克隆至T載體或直接酶切； ③ 將含有啟動子的T載體用ApaI和KpnI酶切，將含有AatII片段的PCR產(chǎn)物或T載 體用ApaI和KpnI酶切，將這兩者連接，得到含有啟動子和AatII片段的質(zhì)粒；用BstXI和 AatII將啟動子和AatII片段切出，連接至用BstXI和AatII酶切過的pCambial301載體； ④ 接著要將多克隆位點的EcoRI和SacI位點之間插入真菌Hsp70啟動子片段或gpda 啟動子片段，在HindIII和PstI位點之間插入真菌的終止子trpc片段；在啟動子hsp70和 pgpda的5'端加上EcoRI酶切位點，在3'端加上SacI酶切位點；在終止子Ttrpc的5'端 加上PstI酶切位點，Ttrpc的3'端加上HindIII酶切位點；將phsp70和pgpda啟動子，兩 端酶切位點EcoRI與SacI，擴增連接到pmdl9-T simple載體后用EcoRI與SacI雙酶切，與 第一目標(biāo)中的載體EcoRI與SacI雙酶切片段連接后轉(zhuǎn)化；新得到載體多克隆位點加入了真 菌啟動子，將gpda啟動子和hsp70啟動子中的一種或兩種，兩端酶切位點HindIII與PstI， 擴增連接到pmdl9-T simple載體后用HindIII與PstI雙酶切，與多克隆位點已經(jīng)插入啟 動子的載體HindIII與PstI雙酶切后的片段連接后，最終轉(zhuǎn)化得到包含真菌啟動子并包含 潮霉素抗性位點的真菌表達載體。
[0012] 作為優(yōu)選，上述的步驟2)包括以下的步驟： ① 將-80°C保存的甘油菌株在LB平板上劃線，在28°C下過夜培養(yǎng)活化； ② 挑選平板上的單克隆，轉(zhuǎn)入5ml的LB管中搖菌過夜； ③ 轉(zhuǎn)移5ml小搖菌液至100ml LB的搖菌瓶中，28°C下250rpm振蕩培養(yǎng)4-5小時，定 時測定菌液〇D_值，培養(yǎng)2小時后每30min測定一次，當(dāng)OD _值達到0. 3-0. 4時，從搖床中 取出搖瓶，置于冰上充分冷卻； ④ ）菌液轉(zhuǎn)到預(yù)冷的50ml離心管中，4°C 4000g以下離心15分鐘；小心地倒掉上清，用 20ml預(yù)冷的無菌水洗滌重懸菌體，此步驟有時可以重復(fù)一次； ⑤ 4°C 4000g以下離心20分鐘后，用IOml預(yù)冷的10%甘油重懸浮菌體； ⑥ 4°C 4000g以下離心20分鐘后，用2-3ml預(yù)冷的10%甘油重懸浮菌體； ⑦ 按100 μ 1等份裝入預(yù)冷的I. 5ml離心管中，于-80°C保存。
[0013] 作為優(yōu)選，上述的步驟3)包括以下的步驟： ① 于-80°C冰箱中取出電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞IOOul，冰浴化凍； ② 取2ul純化好的載體質(zhì)粒，載體質(zhì)粒濃度為lOpg/ul，加入感受態(tài)細胞，冰浴5min，轉(zhuǎn) 入預(yù)冷的電極杯中，2500V電擊； ③ 加入500ul的LB培養(yǎng)基在28°C搖床中200rpm恢復(fù)培養(yǎng)2小時； ④ 4000g以下離心5分鐘，在超凈臺內(nèi)將離心管中500ul上清去掉，剩余菌液用槍頭吹 打均勻，涂在LB平板上，L