本發(fā)明屬于植物保護領(lǐng)域，涉及針對所有植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞桿菌Y15及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中國是農(nóng)業(yè)大國,我國作物(包括蔬菜、果樹、中藥材、糧食作物等)生產(chǎn)總面積已超過22億畝,為世界農(nóng)業(yè)發(fā)展做出了巨大貢獻。但是，我國亦是病蟲害多發(fā)、頻發(fā)和重發(fā)大國，病蟲害與水災(zāi)、旱災(zāi)并稱為我國三大自然災(zāi)害。聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，我國每年病蟲害引起的農(nóng)作物損失達700億-900億元，其中病害占33％，作物病害正日趨成為限制我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。

植物病害主要包括土傳病害以及地上部病害。植物土傳病害通常引起植物根部乃至全株性的病癥,其發(fā)生和流行通常屬于積年流行病害，如引發(fā)紋枯、枯萎、黃萎、立枯、猝倒、根腐、青枯、軟腐、根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、根腫等病害。地上部病害主要危害葉片、莖干、果實等地上部位，主要是借助氣流和人們的農(nóng)事活動從溫室外面?zhèn)魅胪?，如縮葉病、霜霉病、炭疽病、銹病、灰霉病、病毒病等。這些病害病原物都有寄主范圍廣、抗逆性強、難以根除等特點。

不良環(huán)境包括干旱、洪澇、高溫、寒冷等惡劣天氣，均會對草本作物的生長產(chǎn)生不良影響。20世紀(jì)90年代，中國平均每年受旱面積為2733萬hm²，糧食因旱減產(chǎn)量與總產(chǎn)量之比達到了4.7％。而且每年因澇漬災(zāi)害損失糧食62.3億kg,年均經(jīng)濟損失46.7億元。高溫、寒冷等天氣亦會對作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重損害。增加草本作物抵抗外界不良環(huán)境能力受到了國內(nèi)外研究者的高度重視，目前有效的方法非常少。

利用土壤有益微生物來控制病害的發(fā)生以及誘導(dǎo)提高作物抗逆能力是近些年來研究的熱點，尤其這些微生物對環(huán)境無污染，引起了科學(xué)家們利用生物防治手段控制病害、以及應(yīng)對不良環(huán)境的興趣。解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽胞桿菌能夠具有廣泛地抑制真菌和細菌的活性，或者誘導(dǎo)植物抗性。因此，近些年大量學(xué)者在對解淀粉芽胞桿菌的新發(fā)現(xiàn)與新應(yīng)用以及基因功能研究和發(fā)酵條件的優(yōu)化做了大量的探索。它可以不同方式或途徑影響植物的許多代謝過程，增加植物根長，改變植物根系形態(tài)建成，促進根系對水份和營養(yǎng)元素的吸收，解淀粉芽胞桿菌可以提高植物的抗病能力，抵抗病原菌的侵染，以及抗逆能力，增強植物應(yīng)對寒冷、鹽分、干旱等環(huán)境的脅迫。

解淀粉芽胞桿菌在自然界中分布十分廣闊，同時能夠?qū)Χ喾N真菌與細菌產(chǎn)生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產(chǎn)物。因此，在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以適當(dāng)?shù)拇鎮(zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥。同時，隨著分子研究技術(shù)的提高，解淀粉芽胞桿菌的基因功能更多地被了解，增加可應(yīng)用的可行性。以及發(fā)酵條件的優(yōu)化使得解淀粉芽胞桿菌的大規(guī)模應(yīng)用也具備了客觀條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有防治植物病害以及抵抗不良環(huán)境技術(shù)的不足，提供一種綠色環(huán)保的能提高廣譜植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞桿菌Y15。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

針對廣譜植物的防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞桿菌Y15，該菌株分類命名為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2016年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.13327。

本發(fā)明所述的解淀粉芽胞桿菌Y15在制備廣譜性植物防病、促生、抗逆的制劑中的應(yīng)用；優(yōu)選在水果、蔬菜、糧油作物等農(nóng)作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的病害、促進其生長及提高品質(zhì)、提高其抗逆性的制劑中的應(yīng)用。所述的解淀粉芽孢桿菌Y15進一步優(yōu)選在防治西瓜細菌性果斑病、番茄黃化曲葉病毒病、桃樹縮葉病，或促進西瓜、番茄、黃瓜、水稻、空心菜、菊花、鐵皮石斛生長，提高其品質(zhì)；提高番茄抗旱性中的應(yīng)用。用本發(fā)明所述的針對多種植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞桿菌Y15制備的菌劑。

所述的的菌劑優(yōu)選通過以下方法制備得到：

解淀粉芽胞桿菌Y15在LB培養(yǎng)液中28℃180rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，然后6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

本發(fā)明所述的菌劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

解淀粉芽胞桿菌Y15在LB培養(yǎng)液中28℃180rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，然后6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

本發(fā)明所述菌劑在草本植物防病、促生抗逆中的應(yīng)用；優(yōu)選在水果、蔬菜、糧油作物等農(nóng)作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的病害、促進其生長及提高品質(zhì)、提高其抗逆性的制劑中的應(yīng)用。

所述的由解淀粉芽孢桿菌Y15制備的菌劑在防治西瓜細菌性果斑病、番茄黃化曲葉病毒病、桃樹縮葉病，或促進西瓜、番茄、黃瓜、水稻、空心菜、菊花、鐵皮石斛生長，提高其品質(zhì)；提高番茄抗旱性中的應(yīng)用。

所述的菌劑優(yōu)選通過灌根處理進行應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明利用對環(huán)境無毒害的微生物菌劑防治廣譜性植物土傳病害以及地上部病害(尤其是防治西瓜果斑病)，提供了一種綠色環(huán)保的解淀粉芽胞桿菌菌劑，防治優(yōu)選在水果、蔬菜、糧油作物等農(nóng)作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的土傳病害和地上部病害，促進上述各類作物的生長并提高品質(zhì)和提高其抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐熱、耐澇等，抵抗倒春寒等不良氣候)。解決了化學(xué)藥劑等其它方法效果不佳或者有殘留等問題，保護環(huán)境，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

該制劑對解淀粉芽胞桿菌Y15灌根處理后對多種植物病害生防效果達到52.17％以上，，作用十分明顯；且對植物的株高以及根長有明顯地提高，對植株具有一定的促生作用，經(jīng)Y15處理的農(nóng)田作物與對照組相比，增產(chǎn)超53.99％。該解淀粉芽胞桿菌菌劑，可室溫保存6個月-1年。解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的植物田間防病促生試驗結(jié)果表明，對病害防效高達52.17％，增產(chǎn)效果超過53.99％。

附圖說明

圖1、解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物病害的生防效果

圖2、解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物生物量的影響

圖3、解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物抗逆性的影響

生物保藏

解淀粉芽胞桿菌Y15，為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens，于2016年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.13327,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所。

具體實施方式

實施例1解淀粉芽胞桿菌菌株Y15的分子學(xué)鑒定

Y15由浙江梨園根圍土壤中分離得到。

細菌基因組試劑盒(賽百盛公司)提取細菌基因DNA后，用gyrB通用引物gyrB1(5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')；gyrB2R(5'–AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')從基因組DNA中擴增出gyrB基因片段。具體擴增體系及程序(25ul)如下：引物1、2(10μM)各1μl；Mix:12.5μl；Taq:0.5μl。ddH₂O:10μl；模板:1μl。94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，56℃退火2min，72℃延伸2min，35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，90V，30min；EB染色30min，檢測擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化于Escherichia coli DH5α，提取陽性克隆質(zhì)粒，委托TaKaRa公司測序，提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)進行比對。比對結(jié)果顯示該菌株與Bacillus amyloliquefaciens相似度為100％，故金鼎味解淀粉芽孢桿菌。

實施例2

解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑的制備方法如下：

解淀粉芽胞桿菌Y15在LB培養(yǎng)液中28℃180rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，然后6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

實施例3解淀粉芽胞桿菌Y15溫室促生試驗

方法：將參試西瓜、番茄、黃瓜種子用10％H₂O₂表面消毒10min，無菌水洗凈后晾干備用。每個營養(yǎng)缽播種10粒種子。正常澆水管理4周后，將長勢一致的苗移栽至330ml塑料杯中，移栽時將懸浮好的解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×10⁷CFU/mL的濃度灌根施用于作物根部，每株30mL量。然后置于溫室中培養(yǎng)，28℃，70％相對濕度。以清水處理作為對照，每組處理48株苗，隨機放置，共重復(fù)三次。30d后測定西瓜、番茄、黃瓜植株株高、莖粗、鮮重、干重等生物量。

將參試水稻、空心菜種子用10％H₂O₂表面消毒10min，無菌水洗凈后晾干備用。將水稻、空心菜種子用1.0×10⁷CFU/mL的濃度的解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑浸種5min。再在每個營養(yǎng)缽(高13cm，直徑9cm)播種4粒種子，出苗后(7d)，將懸浮好的解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×10⁷CFU/mL的濃度灌根施用于作物根部，每株30mL量。以清水處理作為對照。每組處理48株苗，隨機放置，共重復(fù)三次。接種30d后測定水稻、空心菜植株株高、莖粗、鮮重、干重等生物量。

將參試的菊花從宿根(老根)萌發(fā)的新枝上剪取長12cm的嫩梢作為插條，從節(jié)基部削平，切去基部的兩片大葉，再將上部的葉子修去一半(減少水分蒸發(fā)，防止插條萎蔫)即可扦插至盆缽中(直徑9cm，高13cm)。將懸浮好的解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×10⁷CFU/mL的濃度灌根施用于作物根部，每株30mL量。以清水處理作為對照。每組處理48株苗，隨機放置，共重復(fù)三次。接種30d后測定植株株高、莖粗、鮮重、干重等生物量。

生物量增加(％)＝(處理組植株干重-對照植株干重)/對照植株干重×100％

如表1、2、3、4、5、6所示，解淀粉芽胞桿菌Y15能夠顯著促進茄科番茄、葫蘆科西瓜、黃瓜，水稻，葉類蔬菜空心菜，菊花的生長，表現(xiàn)在作物的鮮重干重，莖長，莖粗與對照相比，都有顯著的增加，結(jié)果計算得解淀粉芽胞桿菌Y15對茄科番茄、葫蘆科西瓜、黃瓜，水稻，葉類蔬菜空心菜，菊花的生物量增加分別達到27.87％、12.93％、29.70％、40.00％、23.08％、43.90％。

表1解淀粉芽胞桿菌Y15對西瓜生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表2解淀粉芽胞桿菌Y15對番茄生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表3解淀粉芽胞桿菌Y15對黃瓜生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表4解淀粉芽胞桿菌Y15對水稻生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表5解淀粉芽胞桿菌Y15對空心菜生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表6解淀粉芽胞桿菌Y15對菊花生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

實施例4解淀粉芽胞桿菌Y15溫室大棚對細菌性病害防效試驗

方法：將參試西瓜種子用10％H₂O₂表面消毒10min，無菌水洗凈后晾干備用。

將催芽后的西瓜種子播種于裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播種前保持土壤較為干燥。待西瓜長到6葉期時，將懸浮好的解淀粉芽胞桿菌Y15生防菌劑以1.0×10⁷CFU/mL的濃度灌根施用于作物根部，隨后置于溫室中培養(yǎng)，28℃，70％相對濕度以上，16/8h光周期。待接種生防菌5天后，進行病原菌的接種，接種濃度為10⁷CFU/ml，采用手動式噴器將該菌成霧狀噴施于葉片的表面，使葉片濕潤而菌液又恰好不流下來，接種前所有植株均未發(fā)病，接種病原菌3天后，開始發(fā)病并統(tǒng)計其發(fā)病率，并計算防效。

西瓜細菌性果斑病葉片分級標(biāo)準(zhǔn):(Ofir Bahar(2009))

發(fā)病率統(tǒng)計(病情統(tǒng)計)：

0級:不發(fā)病；

1級:病葉上有零星病斑，病斑占葉面積的10％以下；

2極:病葉上有少量病斑，病斑占葉面積的11％～25％；

3級:病葉上病斑數(shù)量中等，病斑占葉面積的26％～50％；

4級:病葉上病斑數(shù)量較多，病斑占葉面積的51％～75％；

5級:病葉上有許多病斑，病斑占葉面積的76％～90％；

6級：病葉上有大量病斑，病斑占葉面積90％以上；

病害嚴(yán)重度％＝[Σ(病級株數(shù)×代表級數(shù))/植株總數(shù)×最高代表級值]×100％；

防效％＝(對照發(fā)病率－處理防病率)/對照發(fā)病率×100％.

試驗結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低西瓜細菌性果斑病的發(fā)病率，其平均防效達50.17％。

表7.解淀粉芽胞桿菌Y15對西瓜細菌性果斑病的防效

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

實施例5解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的防治病毒病試驗

方法：將番茄種子(上海合作903)表面消毒(70％無水乙醇浸泡1～2min，0.05％次氯酸鈉溶液浸泡10min，滅菌水沖洗6次)，播種于育苗穴盤中并放置于28℃，16/8h光周期、70％相對濕度的溫室中進行培育。待番茄苗長到3～4葉期時(25d)進行移栽。將番茄苗移栽至裝滿基質(zhì)的盆缽中，每缽一株，置于條件為28℃、16/8h光周期、70％相對濕度的溫室內(nèi)培育。番茄移栽當(dāng)日進行生防菌第一次灌根處理，灌根處理菌液濃度約為5×10⁷CFU/mL，每株苗用量為30mL，緩慢澆灌于番茄根部，同時進行噴霧處理，菌液濃度為5×10⁷CFU/mL，按照0.01％的終濃度加入表面活性劑吐溫-20，對番茄葉片均勻噴霧。番茄移栽7d后進行病毒接種。接種方法為：將沒有攜帶TYLCV的煙粉虱在表現(xiàn)TYLCD癥狀的番茄植株上飼養(yǎng)48h，然后將待接種的健康植株移至粉虱溫室內(nèi)，每株番茄30頭左右，接種3d后使用吡蟲啉除去煙粉虱，將各處理移至防蟲溫室(28℃，16/8h光周期，70％相對濕度)中(Sade D,Eybishtz A,Gorovits R,et al.A developmentally regulated lipocalin-like gene is overexpressed in tomato yellow leaf curl virus-resistant tomato plants upon virus inoculation，and its silencing abolishes resistance[J].Plant Molecular Biology.2012,80:273-287.)。以清水處理作為空白對照，每個處理48株苗，3次重復(fù)。病毒接種40d左右，統(tǒng)計病情。

番茄黃化曲葉病毒病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)(Friedmann M,Lapidot M,Cohen S,et al.A novel source of resistance to tomato yellow leaf curl virus exhibiting a symptomLess reaction to viral infection[J].Journal of the American Society for Horticultural Science.1998,123:1004-1007.)：

0級：無癥狀；

1級：頂部葉片輕度黃化，葉邊緣輕度卷曲，花期花輕度脫落；

2級：頂部葉片中度黃化，葉邊緣中度卷曲褶皺，花期花輕度脫落，結(jié)果期產(chǎn)量輕度減產(chǎn)；

3級：葉片嚴(yán)重黃化，卷曲，褶皺，花期花中度脫落，結(jié)果期產(chǎn)量中度減產(chǎn)；

4級：大面積葉片嚴(yán)重畸形縮小，植株生長緩慢，明顯矮化，花期花嚴(yán)重脫落，結(jié)果期產(chǎn)量嚴(yán)重減收或絕產(chǎn)。

病害嚴(yán)重度％＝[∑(發(fā)病植株數(shù)×病級數(shù))/(總植株數(shù)×最高病級數(shù))]×100；

生防效果％＝[(對照病害嚴(yán)重度－處理病害嚴(yán)重度)/對照病害嚴(yán)重度]×100

試驗結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)病率，其平均防效達47.05％。

表8解淀粉芽胞桿菌Y15對番茄黃化曲葉病毒病的防效

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

實施例6解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的防治果樹病害及提高果實產(chǎn)量試驗

方法：選擇3年生桃樹，于上年秋季施基肥時，當(dāng)年初春長出新葉時以及開花前采用1.0×10⁷CFU/mL濃度的解淀粉芽孢桿菌Y15菌劑澆灌于處理組根部，共3次。每處理選擇100顆桃樹，同時設(shè)置清水對照組。于當(dāng)年夏季桃樹采收期對桃樹縮葉病發(fā)病率進行統(tǒng)計，并對果實產(chǎn)量以及品質(zhì)進行調(diào)查。

發(fā)病率％＝[發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查總植株數(shù)]×100；

生防效果％＝[(對照病發(fā)病率－處理發(fā)病率)/對照病發(fā)病率]×100

試驗結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低桃樹縮葉病的病害嚴(yán)重度，其平均防效達57.40％；并且能夠顯著提高產(chǎn)量以及品質(zhì)。

表9解淀粉芽胞桿菌Y15對桃樹縮葉病的防效

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

表10解淀粉芽胞桿菌Y15對桃樹果實生物量的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

實施例7解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的中藥材溫室促生長試驗

選取前期準(zhǔn)備的已生長約45d的鐵皮石斛組培苗為材料。在無菌的超凈臺內(nèi),在每株鐵皮石斛組培苗基部接種1.0×10⁷CFU/mL濃度的解淀粉芽孢桿菌Y15菌劑1mL,所有實驗組培苗進行(25±1)℃恒溫光照培養(yǎng),每天連續(xù)光照12h,光照強度為2000lx。定期觀察各組培苗的生長狀況,90d后,觀察組培苗的葉片數(shù)、株高、莖粗等,比較實驗組與對照組的組培苗生長長勢,判斷菌株的促生效果。

結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌Y15能夠顯著促進鐵皮石斛的生長并且提高其有效成分含量。

表11解淀粉芽胞桿菌Y15對鐵皮石斛生長的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。

實施例8解淀粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的誘導(dǎo)抗逆性試驗

方法：將參試番茄種子用10％H₂O₂表面消毒10min，無菌水洗凈后晾干備用。

將催芽后的番茄種子播種于裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播種前保持土壤較為干燥。待番茄長到6葉期時，將懸浮好的解淀粉芽胞桿菌Y15生防菌劑以1.0×10⁷CFU/mL的濃度灌根施用于作物根部，隨后置于溫室中培養(yǎng)，1個月后進行斷水干旱，干旱脅迫持續(xù)15d，干旱脅迫后正常澆水，觀察番茄幼苗的恢復(fù)生長情況。每組處理48株苗，隨機放置，共重復(fù)3次。在溫室中按照完全隨機區(qū)組設(shè)計擺放。

澆水進行恢復(fù)生長1d后，解淀粉芽胞桿菌Y15處理組植株恢復(fù)正常生長，而對照組植株全部死亡。

表12解淀粉芽胞桿菌Y15對番茄耐旱性的影響

注：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。