Crk5蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CRK5蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(即CRK5蛋白)在如下a1)或a2)中的應(yīng)用：a1)提高植物抗旱性；a2)選育抗旱性提高的植物品種。CRK5基因過(guò)表達(dá)植株，相比野生型對(duì)照植株，對(duì)干旱逆境脅迫的耐受性顯著提高。本發(fā)明對(duì)植物抗干旱分子機(jī)制的研究具有重要意義；另外，該基因在培育耐旱植物品種中具有重要功能，從而為培育抗逆境作物新品種提供了重要的可能性，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
【專利說(shuō)明】
CRK5蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種CRK5蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干旱是人類面臨的主要自然災(zāi)害之一，即使在科學(xué)技術(shù)如此發(fā)達(dá)的今天，它造成 的糧食生產(chǎn)損失和經(jīng)濟(jì)損失仍然比比皆是。在全球耕地面積逐漸減少和干旱災(zāi)害發(fā)生日益 頻繁的今天，通過(guò)提高作物的抗旱性能來(lái)提高或者保持糧食產(chǎn)量具有重大意義。傳統(tǒng)的育 種技術(shù)具有周期長(zhǎng)、盲目性高和工作量大等缺點(diǎn)，而且通過(guò)傳統(tǒng)育種來(lái)提高糧食產(chǎn)量已經(jīng) 發(fā)展到一定瓶頸。近年來(lái)，隨著植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及植物抗逆分子 機(jī)制的深入研究，通過(guò)基因工程的方法向植物中導(dǎo)入抗逆相關(guān)基因來(lái)提高作物的抗逆性已 經(jīng)變得日趨成熟。
[0003] 脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是傳統(tǒng)的五大植物激素之一，它于上世紀(jì)60年代首 先在干的棉鈴殼中分離得到，因其具有促進(jìn)棉鈴脫落而命名為"脫落素"。隨后從槭樹中分 離純化到一種能促進(jìn)芽休眠的"休眠素"，經(jīng)鑒定二者為同一種化學(xué)物質(zhì)并統(tǒng)一命名為脫落 酸。ΑΒΑ可以促進(jìn)種子成熟和休眠過(guò)程以及種子成熟過(guò)程中貯藏蛋白的積累、抑制種子萌發(fā) 和幼苗生長(zhǎng)、抑制主根發(fā)育、促進(jìn)側(cè)根發(fā)育以及促進(jìn)葉片衰老和脫落等。ΑΒΑ通過(guò)促進(jìn)氣孔 關(guān)閉和抑制氣孔打開以及調(diào)節(jié)抗旱物質(zhì)的積累等過(guò)程增強(qiáng)植物對(duì)干旱的抗性。此外，ΑΒΑ還 可以增強(qiáng)植物對(duì)低溫和高鹽等逆境的適應(yīng)能力。近年來(lái)，隨著遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生 物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，人們對(duì)ΑΒΑ信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。 [0004]通過(guò)細(xì)胞表面的受體來(lái)感知外界環(huán)境的變化以及各種化學(xué)信號(hào)是所有生物最基 本的特點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物里，受體絡(luò)氨酸激酶RTK(receptor tyrosine kinases)家族就是定 位于細(xì)胞表面來(lái)介導(dǎo)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在植物里，類受體蛋白激酶的結(jié)構(gòu)及發(fā)揮功能的 作用方式跟RTK類似。類受體蛋白激酶家族是植物最大的膜受體家族，它在擬南芥和水稻中 的成員數(shù)分別超過(guò)了610和1100個(gè)。CRKs(Cysteine_rich receptor-like protein kinases)蛋白激酶是RLKs的一個(gè)亞家族，它在擬南芥中共有46個(gè)成員。除了具有RLKs的典 型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)之外，CRKs的胞外結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)拷貝的DUF26結(jié)構(gòu)域(domain of unknown function 26)，每個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域都包含3個(gè)保守的C-8X-C-2X-C結(jié)構(gòu)域，但是這些結(jié)構(gòu)域的 具體功能還未知，可能跟蛋白之間的互作有關(guān)系。CRKs廣泛參與到植物對(duì)生物脅迫和非生 物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。富含半胱氨酸的類受體蛋白激酶CRK36和類受體胞質(zhì)激酶ARCK1 (receptor-like cytosolic kinase 1)受滲透脅迫誘導(dǎo)，并且CRK36在體外可以磷酸化 ARCK1，并且形成復(fù)合體負(fù)調(diào)控ΑΒΑ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)滲透脅迫。CRK5基因在擬南芥tair網(wǎng)站 上的基因號(hào)為AT4G23130(https: //www.arabidopsis · org/) 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種CRK5蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下A或B:
[0007] A.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)（CRK5蛋白）在如下al)_a2) 任一中的應(yīng)用：
[0008] al)提高植物抗旱性；
[0009] a2)選育抗旱性提高的植物品種。
[0010] B.由序列表中序列3所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)(CRK5蛋白）的編碼基因在如 下al)_a2)任一中的應(yīng)用：
[0011] al)提高植物抗旱性；
[0012] a2)選育抗旱性提高的植物品種。
[0013] 在本發(fā)明中，以上a2)中的所述選育抗旱性提高的植物品種的方法，具體可包括將 所述CRK5蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0015] 本發(fā)明所提供的培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：向 受體植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)（CRK5蛋白）的編碼基 因，得到轉(zhuǎn)基因植物;所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗旱性提高。
[0016] 在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的 編碼基因（即CRK5基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第1至1992位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 4)在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0021] 5)與1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0022] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0023]其中，序列1由2537個(gè)核苷酸組成，為所述CRK5基因在擬南芥基因組中序列，其中 第818-892、1034-1103、1226-1314、1526-1599、1838-1909及 2064-2138位均為內(nèi)含子序列； 序列2由2082個(gè)核苷酸組成，為所述CRK5基因的cDNA序列，其中第1-1992位為編碼序列 (0RF);序列1和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由663個(gè)氨基酸殘基組成。
[0024] 在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基 因是通過(guò)含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中的。
[0025] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA-1 300-221、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。 所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它 參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體 的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng) 型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因 1]1^911；[1:;[11啟動(dòng)子化1]13；〇、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子1(1294等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟 動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯 增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但 必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密 碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載 體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具 有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接 以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0026]在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為 35S啟動(dòng)子。
[0027] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述CRK5基因插入pCAMBIA-1300-221載體的 多克隆位點(diǎn)BamH I與Κρη I之間后得到的重組質(zhì)粒。
[0028]在上述方法中，將攜帶有所述CRK5基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物， 具體可為:通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌 介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0029] 另外，由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在如下(a) 或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0030] (a)協(xié)同ΑΒΑ促進(jìn)植物氣孔關(guān)閉；
[0031] (b)協(xié)同ΑΒΑ抑制植物氣孔開放。
[0032] 在所述應(yīng)用中，所述ΑΒΑ的使用濃度具體可為30μΜ。
[0033] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。
[0034]進(jìn)一步，所述雙子葉植物可為十字花科植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物 具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型）。
[0035]在本發(fā)明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)均 可替換為序列3所示蛋白質(zhì)與標(biāo)簽蛋白所形成的融合蛋白，具體如在pCAMBIA-1300-221載 體的酶切位點(diǎn)BamH I和Κρη I之間插入序列2的第1-1989位所示DNA片段后所得重組質(zhì)粒表 達(dá)得到的融合蛋白。
[0036] 實(shí)驗(yàn)證明，CRK5基因過(guò)表達(dá)植株，相比野生型對(duì)照植株，對(duì)干旱脅迫的耐受性顯著 提高。本發(fā)明對(duì)植物抗干旱分子機(jī)制的研究具有重要意義;另外，該基因在培育耐旱植物品 種中具有重要功能，從而為培育抗逆境作物新品種提供了重要的可能性，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有 重大意義。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CRK5過(guò)表達(dá)材料中CRK5mRNA的表達(dá)情況。
[0038]圖2為CRK5過(guò)表達(dá)株系在ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉和ΑΒΑ抑制氣孔開放實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)情 況。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE)，不同字母代表同一ΑΒΑ濃度下各處理之間差異顯著（Ρ〈 0.05)。其中，Α為ΑΒΑ抑制氣孔開放實(shí)驗(yàn);Β為ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)。
[0039]圖3為CRK5過(guò)表達(dá)株系在干旱實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)情況及在復(fù)水后的存活率情況。Α表示 野生型Col-Ο以及CRK5基因高表達(dá)株系0E-1和0E-2分別在正常澆水、干旱處理和干旱處理 后再?gòu)?fù)水實(shí)驗(yàn)。B是對(duì)A圖中各基因型植株存活率的統(tǒng)計(jì)分析。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，不 同字母代表同一 ΑΒΑ濃度下各處理之間差異顯著(P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試 驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0043] pCAMBIA-1300-221 載體：由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):Lijing Liu，Yiyue Zhang, Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal，2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221載體中，位于多克隆位點(diǎn)(MCS)上游的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。在 pCAMBIA-1300-221載體中，含有GFP基因。口0厶1?1厶-1300-221載體相關(guān)信息：11?口：// www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
[0044] 擬南芥野生型（Col-〇生態(tài)型）：擬南芥野生型種子（Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0)，為擬南芥生物研究中心（ABRC，https ://www.arabidopsis .org/)的 產(chǎn)品。
[0045] 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，由清華大學(xué) 提供（記載文南犬：R.Berres，L.otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)〇
[0046] 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受態(tài):為全式金生物有限公司產(chǎn) 品。
[0047] 實(shí)施例1、CRK5轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定
[0048] 本實(shí)施例中所涉及的CRK5基因來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，其在擬南 芥基因組中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2537個(gè)核苷酸組成，為所述CRK5基因在 擬南芥基因組中序列，其中第818-892、1034-1103、1226-1314、1526-1599、1838-1909及 2064-2138位均為內(nèi)含子序列；所述CRK5基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由 2082個(gè)核苷酸組成，為所述CRK5基因的cDNA序列，其中第1-1992位為編碼序列(0RF);序列1 和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由663個(gè)氨基酸殘基組成。
[0049] 一、重組表達(dá)載體 pCAMBIA-1300-221-CRK5 的構(gòu)建
[0050]提取擬南芥野生型(Col生態(tài)型）的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以所得cDNA為模板， 通過(guò)引物1與引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，表明擴(kuò)增得到約2000bp片 段，測(cè)序表明，該片段具有自序列表中的序列2自5'端起第1-1989位核苷酸序列。
[0051 ]引物1:5' -CGGGATCCATGTCTGCTTATACCTCATTAAAC-3 '（下劃線部分為BamH I的識(shí)別 位點(diǎn)，該序列的第9-32位為序列2的第1-24位）；
[0052]引物2:5 ' -GGGGTACCACGAGGAGCTAAAATAGTAATCG-3 '（下劃線部分為Κρη I的識(shí)別位 點(diǎn)，該序列的第9-31位為序列2的第1967-1989位的反向互補(bǔ)序列）。
[0053]用限制性內(nèi)切酶BamH I和Κρη I雙酶切以上所得PCR產(chǎn)物，膠回收酶切片段，與經(jīng) 過(guò)同樣雙酶切的PCAMBIA-1300-221載體骨架相連，得到重組質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒送樣測(cè) 序，將經(jīng)測(cè)序表明在pCAMBIA-1300-221載體的酶切位點(diǎn)BamH I和Κρη I之間插入序列2的第 1-1989位所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為？041?14-1300-221-0狀5。在重組表達(dá)載體 PCAMBIA-1300-221-CRK5中，啟動(dòng)所述CRK5基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。
[0054] 在重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-CRK5的構(gòu)建過(guò)程中，也可以人工合成的序列 表的序列2所示的CRK5基因?yàn)槟０濉?br>[0055] 二、CRK5轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定 [0056] 1、CRK5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得
[0057] 將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-CRK5導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受 態(tài)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物1和引物2(同上)組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。將經(jīng)鑒定 表明含有CRK5基因（PCR目的條帶大小為2000bp左右）的農(nóng)桿菌GV3101命名為GV3101/ pCAMBIA-1300-221-CRK5〇
[0058] 采用用農(nóng)桿菌花序侵染的方法（SJ Clough，AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal，1998，16(6): 735-743 ·)將上述所得的重組農(nóng)桿菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK5轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col生態(tài)型）。
[0059]轉(zhuǎn)化后進(jìn)行潮霉素抗性篩選，在含40mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集具有潮 霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子，獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因苗，即轉(zhuǎn)入PCAMBIA-1300-221-CRK5的擬南芥植株(1^代）。
[0060] 在以往的研究中，向擬南芥野生型（Col生態(tài)型）中轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體 的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)以及植物抗干旱的能力均不產(chǎn)生任何影響， 其表現(xiàn)型與野生型一致，所以本實(shí)驗(yàn)以野生型Col-Ο作為了實(shí)驗(yàn)的對(duì)照部分。
[0061 ] 2、CRK5轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定
[0062] (1)遺傳學(xué)分離比方法鑒定插入拷貝數(shù)
[0063]根據(jù)遺傳學(xué)原理，單拷貝插入之后自交后代會(huì)產(chǎn)生3:1的分離比。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)的方 法，統(tǒng)計(jì)抗生素培養(yǎng)基上抗性苗和非抗性苗的數(shù)量。用分離比方法鑒定出轉(zhuǎn)基因植株為單 拷貝插入的株系(單拷貝CRK5轉(zhuǎn)基因擬南芥），從而用于純合體的篩選。
[0064] (2)轉(zhuǎn)基因擬南芥0E-1和0E-2純合系的篩選
[0065]經(jīng)上述鑒定分析后，從中隨機(jī)選擇二個(gè)單拷貝CRK5轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，分別記為 0E-1和OEKlMf)。播種于含40mg/L潮霉素 MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)連續(xù)2代篩選，以所有自交后 代均能正常生長(zhǎng)（即所有后代均具潮霉素抗性)的親本植株為純合系，最終獲得T 3代轉(zhuǎn)基因 擬南芥0E-1和0E-2的純合系植株，作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。
[0066] 三、轉(zhuǎn)基因擬南芥0E-1和0E-2純合系中CRK5基因表達(dá)量分析
[0067] 提取擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型）和過(guò)表達(dá)植株(0E-1和0E-2)的總RNA，利用實(shí)時(shí) 熒光定量PCR檢測(cè)材料中CRK5基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)情況。具體如下：
[0068] 1、轉(zhuǎn)錄水平分析(RNA表達(dá)量）
[0069]以上述獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(0E-1和0E-2)及擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型）為 實(shí)驗(yàn)材料。取生長(zhǎng)4周左右的擬南芥幼苗，提取RNA并且反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法分析CRK5基因在各實(shí)驗(yàn)材料中的表達(dá)情況。
[0070]其中，擴(kuò)增CRK5基因的引物序列為：
[0071 ] CRK5RT-F1:5' -TTCAACAAAGTTGGAGGAAGA-3'（序列2的第664-684位）；
[0072] CRK5RT-R1:5'-ACACAAATAAGAACTGAGATAGCG-3'（序列2的第867-890位的反向互補(bǔ) 序列）。
[0073]以Actin2/8作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增內(nèi)參Actin的引物序列為：
[0074] Actin-F:5 '-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3 '；
[0075] Actin-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'。
[0076]上述引物的反應(yīng)條件如下：
[0077] (1)反應(yīng)體系的建立
[0078]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
[0080] (2)三個(gè)重復(fù)，輕甩混勻，用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0081] (3)反應(yīng)程序的設(shè)定：
[0082] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序
[0084] (4)數(shù)值分析，以作為衡量基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)差值，對(duì)各株系中CRK5基因的 表達(dá)進(jìn)行分析比較。Ct值為PCR反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，△ Ct值為特異引物 Ct值與Act in引物Ct值之差。
[0085] CRK5相關(guān)遺傳材料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，CRK5基因的表達(dá)均為 相對(duì)值，以擬南芥野生型（Co 1 -0)中CRK5基因的表達(dá)為1。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥 0E-1和0E-2中CRK5mRNA表達(dá)量均顯著高于野生型(Col-Ο)中CRK5mRNA表達(dá)量(P〈0.05)。 [0086]實(shí)施例2、CRK5轉(zhuǎn)基因植物抗干旱性分析試驗(yàn)
[0087] ΑΒΑ是植物抵抗外界逆境脅迫的重要信號(hào)分子。在干旱條件下，ΑΒΑ能夠通過(guò)調(diào)節(jié) 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的離子通道促進(jìn)氣孔關(guān)閉以減少水分流失。鈣離子、蛋白激酶、磷酸酶等均參 與ΑΒΑ介導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及ΑΒΑ相關(guān)抗逆基因的信號(hào)調(diào)控。因此利用ΑΒΑ誘導(dǎo)氣孔運(yùn) 動(dòng)實(shí)驗(yàn)和干旱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRK5在ΑΒΑ調(diào)控植株干旱脅迫響應(yīng)的過(guò)程中是否發(fā)揮作用。
[0088] -、ΑΒΑ抑制氣孔開放和ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)
[0089] (l)ABA抑制氣孔開放實(shí)驗(yàn)
[0090]以擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型），實(shí)施例1得到的兩個(gè)T3代純合體CRK5轉(zhuǎn)基因株系 0Ε-1和0Ε-2為實(shí)驗(yàn)材料。將各實(shí)驗(yàn)材料的種子分別播種在MS培養(yǎng)基上(每種實(shí)驗(yàn)材料播種 80-100粒）。4°(：下低溫層積3天后移入光照培養(yǎng)箱中。取生長(zhǎng)4周左右各基因型植物黑暗下 放置24h以確保氣孔關(guān)閉；然后取狀態(tài)一致的葉片浸泡在無(wú) ΑΒΑ和含有30μΜ ΑΒΑ的表皮條緩 沖液(配方：50mM KCl、10mM MES-K0H，pH 6.15)中；最后，在冷光源下照射211后觀察并記錄 氣孔孔徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 5次，結(jié)果一致，每個(gè)樣本均記錄約60個(gè)氣孔孔徑，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤 差(SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ濃度下各處理之間差異顯著(P〈0.05)。
[0091] 結(jié)果如圖2中A所示，從圖中可以看出，黑暗處理24小時(shí)后，野生型Col-Ο和CRK5轉(zhuǎn) 基因株系（0E-1和0E-2)氣孔關(guān)閉的程度基本一致(P>0.05);光照2小時(shí)后，不含ΑΒΑ組中， CRK5轉(zhuǎn)基因株系0Ε-1和0Ε-2氣孔的孔徑與野生型Col-Ο基本一致(Ρ>0.05)，但是ΑΒΑ處理組 中，CRK5轉(zhuǎn)基因株系0Ε-1和0Ε-2氣孔孔徑相對(duì)于野生型Col-Ο變得更小(Ρ〈0.05)，即0Ε-1和 0Ε-2氣孔開放較Co 1-0受到顯著抑制，對(duì)ΑΒΑ抑制氣孔開放過(guò)程更加敏感，表現(xiàn)出對(duì)ΑΒΑ超敏 的表型。
[0092] (2)ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)
[0093]以擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型），實(shí)施例1得到的兩個(gè)Τ3代純合體CRK5轉(zhuǎn)基因株系 0Ε-1和0Ε-2為實(shí)驗(yàn)材料。將各實(shí)驗(yàn)材料的種子分別播種在MS培養(yǎng)基上(每種實(shí)驗(yàn)材料播種 80-100粒）。4°(：下低溫層積3天后移入光照培養(yǎng)箱中。取生長(zhǎng)4周左右各基因型植物的葉片 浸泡在表皮條緩沖液(配方:50mM KCl、10mM MES-K0H，pH 6.15)中，在冷光源下照射311以使 氣孔完全打開;然后再分別用〇μΜ和30μΜ ΑΒΑ處理葉片2h;最后，在冷光源下觀察并記錄氣 孔孔徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 5次，結(jié)果一致，每個(gè)樣本均記錄約60個(gè)氣孔孔徑，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ濃度下各處理之間差異顯著(P〈0.05)。
[0094] 結(jié)果如圖2中B所示，在冷光源照射3h后，CRK5轉(zhuǎn)基因株系0E-1和0E-2氣孔的起始 孔徑與野生型Col-Ο基本一致(P>0.05)，但是30μΜ ΑΒΑ繼續(xù)處理2小時(shí)后，CRK5轉(zhuǎn)基因株系 0Ε-1和0Ε-2氣孔孔徑相對(duì)于野生型Col-Ο變得更小(Ρ〈0.05)，即0Ε-1和0Ε-2氣孔關(guān)閉的程 度大于Col-Ο，對(duì)ΑΒΑ誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉更加敏感，表現(xiàn)出對(duì)ΑΒΑ超敏的表型;表明CRK5在ΑΒΑ誘導(dǎo) 氣孔關(guān)閉過(guò)程中具有正調(diào)節(jié)作用。
[0095]綜合以上結(jié)果，相對(duì)于野生型Col-Ο，實(shí)施例1得到的Τ3代純合體CRK5轉(zhuǎn)基因株系 (0Ε-1和0Ε-2)在ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉和ΑΒΑ抑制氣孔開放過(guò)程中氣孔關(guān)閉的程度均高于野生 型Co 1 -0，表現(xiàn)出對(duì)ΑΒΑ超敏的表型，說(shuō)明CRK5在ΑΒΑ誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和ΑΒΑ抑制氣孔開放過(guò)程 中具有正調(diào)節(jié)作用。
[0096] 二、干旱實(shí)驗(yàn)
[0097]以擬南芥野生型（Col-Ο生態(tài)型）及實(shí)施例1得到的兩個(gè)Τ3代純合體CRK5轉(zhuǎn)基因株 系(0Ε-1和0Ε-2)為實(shí)驗(yàn)材料。將生長(zhǎng)兩周的各基因型植株的幼苗由培養(yǎng)皿移至土中之后， 干旱實(shí)驗(yàn)組一直保持不澆水，對(duì)照組正常澆水。等出現(xiàn)表型后拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后復(fù) 水。復(fù)水24h后，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且統(tǒng)計(jì)存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 5次，每個(gè)基因型每次均用 至少30株，結(jié)果一致，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ濃度下各處理之間 差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0098]結(jié)果如圖3中Α所示，在正常澆水的對(duì)照組中，各植株生長(zhǎng)沒有明顯差異。而干旱組 中，CRK5轉(zhuǎn)基因株系0E-1和0E-2植株較Col-Ο生長(zhǎng)相對(duì)正常，對(duì)干旱脅迫的敏感性降低，表 現(xiàn)出抗旱性。如圖3中B所示，干旱組復(fù)水24小時(shí)后，CRK5轉(zhuǎn)基因株系0E-1和0E-2存活率顯著 高于野生型Col-0(P〈0.05)。因此，高表達(dá)CRK5使得植物的抗旱性增強(qiáng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)-a2)任一中的應(yīng)用： al)提高植物抗旱性； a2)選育抗旱性提高的植物品種。2. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)_a2)任一 中的應(yīng)用： al)提高植物抗旱性； a2)選育抗旱性提高的植物品種。3. 培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：向受體植物中導(dǎo)入由序列表 中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物;所述轉(zhuǎn)基因植物與 所述受體植物相比抗旱性提高。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子： 1) 編碼序列為序列表中序列2自5'末端第1至1992苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 序列表中序列1所示的DNA分子； 4) 在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 5) 與1)_4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:在所述方法中，所述由序列表中序列3 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過(guò)含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表 達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編 碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。7. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在如下(a)或(b)中 的應(yīng)用： (a) 協(xié)同ABA促進(jìn)植物氣孔關(guān)閉； (b) 協(xié)同ABA抑制植物氣孔開放。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或 單子葉植物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述雙子葉植物為十字花科植物。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105950583SQ201610382213
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】張大鵬, 路凱, 王小芳
【申請(qǐng)人】清華大學(xué)