本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特異性引物、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是影響婦女健康的最常見惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為女性疾病的第一殺手，發(fā)病率逐漸攀升，并逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2030年，我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率將比2008年上升至31％。同時(shí)，乳腺癌有明顯的家族遺傳傾向，基因突變攜帶者的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于一般人群。卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，早期診斷困難，除遺傳性卵巢癌外，沒有一級(jí)防護(hù)措施。

易感基因是指和特定疾病具有一定關(guān)聯(lián)的基因或等位基因。對(duì)乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，可得到具體的基因序列信息，進(jìn)而評(píng)估乳腺癌/卵巢癌的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，可以做到早預(yù)防、早控制，降低疾病發(fā)生幾率，提高廣大女性健康水平。大量研究表明，遺傳因素在疾病的易感性中發(fā)揮重要作用，復(fù)雜疾病的遺傳因素通過微效基因作用的累加可以形成明顯的表型綜合效應(yīng)。因此對(duì)乳腺癌卵巢癌的多個(gè)易感基因的遺傳性突變，包括點(diǎn)突變、短片段插入、缺失等進(jìn)行檢測(cè)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析注釋，評(píng)估該測(cè)試個(gè)體是否為高風(fēng)險(xiǎn)人群至關(guān)重要。

目前，檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因常見方法有Sanger法、基因芯片法、熒光定量PCR法、高通量測(cè)序法等。Sanger測(cè)序法測(cè)序每次只能對(duì)一個(gè)樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)效率低、成本高，且靈敏度低(20％)?；蛐酒ā晒舛縋CR法檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因，該方法只能針對(duì)一個(gè)或數(shù)個(gè)已知突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)檢測(cè)探針形成檢測(cè)芯片，因此無法用于檢測(cè)未知突變位點(diǎn)，檢測(cè)的結(jié)果也就不夠全面、準(zhǔn)確。高通量測(cè)序法主要是由測(cè)序儀器提供商提供的測(cè)序儀配套文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，存在試劑盒貨期長(zhǎng)、規(guī)格固定、試驗(yàn)靈活性和準(zhǔn)確性不夠等不足。一些試劑廠商根據(jù)文獻(xiàn)中分享報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行建庫(kù)，但所完成的實(shí)驗(yàn)效果參差不齊，測(cè)序質(zhì)量不高。

由此可見，現(xiàn)有技術(shù)還有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要針對(duì)上述問題提供一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特異性引物、試劑盒和檢測(cè)方法，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本多個(gè)乳腺癌/卵巢癌易感基因，且有效提高檢測(cè)效率、準(zhǔn)確率，同時(shí)降低成本、簡(jiǎn)化操作步驟等。

為達(dá)到本發(fā)明目的，采用以下技術(shù)方案：

一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特異性引物，包括100對(duì)特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示。

進(jìn)一步的，所述特異性引物為經(jīng)過修飾的引物。

進(jìn)一步的，所述特異性引物的修飾方法為硫代修飾、脫氧尿嘧啶修飾、5’反向dT修飾中的一種或幾種。

進(jìn)一步的，所述特異性引物的Tm值為58-62℃。

一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的試劑盒，包括上述引物中的至少兩對(duì)。

進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括通用引物、酶混合物、質(zhì)控品、無核酸酶水；所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。

進(jìn)一步的，所述質(zhì)控品為人正?；蚪MDNA。

進(jìn)一步的，所述特異性引物3’端和5’端分別標(biāo)記Tag1和Tag2。

進(jìn)一步的，所述特異性引物3’端Tag1序列與待測(cè)樣本目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)；特異性引物5’端Tag2與通用引物完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。

進(jìn)一步的，所述通用引物用于對(duì)特異引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增，對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接和標(biāo)記。

進(jìn)一步的，所述通用引物3’端標(biāo)記有Tag3；Tag3與特異引物Tag2完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)，長(zhǎng)度為50-70bp。

進(jìn)一步的所述特異性引物或所述試劑盒應(yīng)用于乳腺癌/卵巢癌易感基因檢測(cè)。

基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法，包括以下步驟：

S1：使用磁珠法對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取，然后將所提取的樣本核酸進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定，測(cè)定合格后進(jìn)行定量稀釋，備用；

S2：用所述特異性引物或所述試劑盒對(duì)S1中所提取的核酸的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，收集擴(kuò)增產(chǎn)物備用；

S3：使用磁珠法對(duì)S2中擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸純化，進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定，然后混樣，定量，上機(jī)測(cè)序。

進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物等。

進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

98℃，激活20min；循環(huán)1次；

72℃，延伸10min；循環(huán)1次。

進(jìn)一步的，所述步驟S1中樣本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因FGFR2、BRCA1、BRCA2、PALB2、GSTM1、MTHFR、GSTM1或TGF-β1中的至少一種。

進(jìn)一步的，所述步驟S1中樣本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1(引物序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:86)、BRCA2(引物序列SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:200)。

進(jìn)一步的，步驟(2)中所述核酸的目標(biāo)區(qū)域，它們可來源于同一個(gè)乳腺癌/卵巢癌易感基因，也可來源于不同的乳腺癌/卵巢癌易感基因；包括但不限于乳腺癌/卵巢癌易感基因上的內(nèi)部序列、基因的外部調(diào)控序列；所述基因內(nèi)部序列，包括但不限于基因的內(nèi)含子區(qū)域、外顯子區(qū)域、同時(shí)含有內(nèi)含子與外顯子的區(qū)域。

進(jìn)一步的，所述檢測(cè)方法的檢測(cè)樣本包括離體的全血樣品、口腔脫落細(xì)胞樣品、組織樣品等；所述組織樣品包括石蠟包埋組織、新鮮組織和冰凍切片等。

上述高通量測(cè)序平臺(tái)包含但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life Ion Torrent/Proton平臺(tái)、華大基因BGISEQ-500/50等測(cè)序平臺(tái)。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明提供的特異性引物是針對(duì)乳腺癌/卵巢癌易感基因的全外顯子設(shè)計(jì)的引物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，覆蓋范圍廣、檢測(cè)位點(diǎn)多。每對(duì)特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域大小為450-550bp，所有引物Tm值統(tǒng)一設(shè)計(jì)為58-62℃。

本發(fā)明提供的多重PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)引進(jìn)特異性修飾，比如硫代修飾、脫氧尿嘧啶修飾、5’反向dT修飾等修飾方法，修飾后的引物不易被核酸酶降解，確保PCR擴(kuò)增特異性的同時(shí)保證其擴(kuò)增效率；且具有相對(duì)均一的Tm值，在多重?cái)U(kuò)增時(shí)表現(xiàn)出很好的特異性、穩(wěn)定性及均一性，同時(shí)不存在非特異擴(kuò)增，此方法省去多輪引物篩選的工作。具體的，硫代修飾后的引物序列寡核苷酸鏈上帶雙鍵的氧原子被硫原子取代的衍生物，能夠抵抗核酸酶的降解，增強(qiáng)引物穩(wěn)定性；脫氧尿嘧啶修飾后的引物寡核苷酸序列中每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧尿嘧啶替代，可以使雙鏈溶解溫度增長(zhǎng)1.7℃，從而增加雙鏈的穩(wěn)定性；5’反向dT修飾后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，從而形成交聯(lián)，形成的交聯(lián)可以抑制在DNA聚合酶延伸過程中的外切核酸酶的降解作用。

本發(fā)明自主研發(fā)的基于高通量測(cè)序技術(shù)的針對(duì)乳腺癌/卵巢癌發(fā)病率較高的易感基因的多重PCR特異性引物、試劑盒和檢測(cè)方法，能夠用一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)捕獲和擴(kuò)增多個(gè)樣本多個(gè)乳腺癌/卵巢癌易感基因，包括點(diǎn)突變、短片段插入缺失等遺傳性突變，有效提高檢測(cè)效率、準(zhǔn)確率，同時(shí)降低成本、簡(jiǎn)化操作步驟、靈活提供試劑盒包裝規(guī)格等。本發(fā)明利用高通量基因測(cè)序技術(shù)突破傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的限制，提高檢測(cè)靈敏度；同時(shí)還能檢測(cè)包括已知突變和未知突變位點(diǎn)的變異情況，得到全面準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。通過對(duì)乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，可得到具體的基因序列信息，進(jìn)而評(píng)估乳腺癌/卵巢癌的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，做到早預(yù)防、早控制，降低疾病發(fā)生幾率，提高廣大女性健康水平。

本發(fā)明采用磁珠純化核酸的方式，省去了傳統(tǒng)建庫(kù)中的離心柱式純化，操作簡(jiǎn)單；其次，本發(fā)明針對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)設(shè)計(jì)的引物只需要一輪PCR，通過選取溫度梯度、時(shí)間梯度、循環(huán)數(shù)經(jīng)過大量正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化PCR反應(yīng)程序，將樣品傳統(tǒng)建庫(kù)的兩次擴(kuò)增融合在一個(gè)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行，且本發(fā)明方法用引物直接在目標(biāo)基因鏈中捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行擴(kuò)增，不需要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行截?cái)嘈揎椀忍幚?，?jié)省了檢測(cè)時(shí)間和成本。

附圖說明

圖1檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法流程圖。

圖2目標(biāo)基因建庫(kù)PCR擴(kuò)增的原理圖。

圖3引物特異性驗(yàn)證結(jié)果圖；其中，M：Marker；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照；1-3：1-3號(hào)全血樣品驗(yàn)證；4-6：4-6號(hào)口腔脫落細(xì)胞樣品驗(yàn)證；7-9：7-9號(hào)石蠟組織樣品驗(yàn)證。

圖4引物靈敏度驗(yàn)證結(jié)果圖；其中，M：Marker；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照；1-3：1號(hào)全血樣品三種模板濃度靈敏度驗(yàn)證；4-6：4號(hào)口腔脫落細(xì)胞樣品三種模板濃度靈敏度驗(yàn)證；7-9：7號(hào)石蠟組織樣品三種模板濃度靈敏度驗(yàn)證。

圖5引物重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果；其中，M：Marker；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照；1-3：實(shí)驗(yàn)員A檢測(cè)2號(hào)全血樣品、5號(hào)口腔脫落細(xì)胞樣品、8號(hào)石蠟組織樣品驗(yàn)證結(jié)果；4-6：實(shí)驗(yàn)員B檢測(cè)2號(hào)全血樣品、5號(hào)口腔脫落細(xì)胞樣品、8號(hào)石蠟組織樣品驗(yàn)證結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說明的是，本發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實(shí)施例及其組合實(shí)施方式。

實(shí)施例1一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特異性引物、試劑盒及方法

1、引物的設(shè)計(jì)

所述對(duì)乳腺癌/卵巢癌易感基因序列選自于University of California Santa Cruz(UCSC)數(shù)據(jù)庫(kù)，選用Primer3引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行易感基因全外顯子引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)范圍包含了該基因中所有常見和不常見的突變熱點(diǎn)。

本發(fā)明對(duì)乳腺癌/卵巢癌易感基因全外顯子進(jìn)行的引物設(shè)計(jì)共100對(duì)，每對(duì)特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域大小為450-550bp，覆蓋范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、檢測(cè)位點(diǎn)多；特異引物設(shè)計(jì)時(shí)引進(jìn)特異性修飾，修飾后的引物不易被核酸酶降解，且具有相對(duì)均一的Tm值，統(tǒng)一設(shè)計(jì)為60℃左右(±2℃)；所述引物在多重?cái)U(kuò)增時(shí)表現(xiàn)出很好的特異性、穩(wěn)定性及均一性，同時(shí)不存在非特異擴(kuò)增。具體的，所述引物特異修飾方法為硫代修飾、脫氧尿嘧啶修飾、5’反向dT修飾中的一種或幾種。所述硫代修飾后的引物序列寡核苷酸鏈上帶雙鍵的氧原子被硫原子取代的衍生物，能夠抵抗核酸酶的降解，增強(qiáng)引物穩(wěn)定性；所述脫氧尿嘧啶修飾后的引物寡核苷酸序列中每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧尿嘧啶替代，可以增長(zhǎng)雙鏈溶解溫度1.7℃，從而增加雙鏈的穩(wěn)定性；所述5’反向dT修飾后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，從而形成交聯(lián)，形成的交聯(lián)可以抑制在DNA聚合酶延伸過程中的外切核酸酶的降解作用。

本發(fā)明的測(cè)序引物在確保PCR擴(kuò)增特異性的同時(shí)還能保證其擴(kuò)增效率。

2、檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因試劑盒

本發(fā)明的檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因方法的試劑盒，包括：

特異性引物：用于擴(kuò)增待測(cè)樣品核酸中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域，擴(kuò)增范圍至少覆蓋目標(biāo)基因的全外顯子區(qū)域；

通用引物：用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中，對(duì)特異引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增，對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而區(qū)分不同樣品；

PCR反應(yīng)液：包括酶混合物、無核酸酶水；所述酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用量為1.25U/反應(yīng))、PCR Buffer(用量為1×)、dNTP混合物(用量為200μM/種/反應(yīng))；

質(zhì)控品：人正?；蚪MDNA，來源于正常人全血樣本；本發(fā)明質(zhì)控品來源于市售。

3、基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法

包括以下步驟：

S1：利用納米級(jí)超順磁性羧基磁珠在不同鹽濃度及疏水環(huán)境下與核酸分子可逆吸附的原理，特異吸附核酸分子，通過后續(xù)地洗滌及洗脫步驟，獲得高純度的核酸樣本，使用Qubit或NanoDrop進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的核酸樣本濃度結(jié)果，使用10mM Tris將核酸樣本稀釋至50-250ng/μL，優(yōu)選的50-100ng/μL作為擴(kuò)增建庫(kù)的起始濃度。

使用1％瓊脂糖凝膠電泳40min，對(duì)稀釋后核酸的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的均一性及完整性判斷提取核酸的質(zhì)量，核酸完整性好或發(fā)生輕微降解不影響建庫(kù)效果。所提取的核酸濃度、純度測(cè)定及1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后入組并分別進(jìn)行標(biāo)記。所述樣本合格的標(biāo)準(zhǔn)為核酸濃度＞50ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品條帶完整、均一，無明顯拖尾。

S2：用本發(fā)明的特異性引物或試劑盒對(duì)S1中待測(cè)樣品核酸中的易感基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，收集擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為特異引物擴(kuò)增片段與通用引物之和。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：特異引物混合物2μL；通用引物2μL；模板/質(zhì)控品200ng；酶混合物12.5μL；無核酸酶水將體積補(bǔ)足至25μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

98℃，激活20min；循環(huán)1次；

72℃，延伸10min；循環(huán)1次。

當(dāng)待測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因有多個(gè)時(shí)，同一待測(cè)樣品的不同乳腺癌/卵巢癌易感基因的擴(kuò)增可同時(shí)進(jìn)行或部分同時(shí)進(jìn)行。在具體的實(shí)驗(yàn)過程中，可根據(jù)需要選用上述任一種方案進(jìn)行。若分別進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，需要保證用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量是一致的。當(dāng)待測(cè)樣品有多個(gè)時(shí)，不同樣品的乳腺癌/卵巢癌易感基因的擴(kuò)增必須分別進(jìn)行。

S3：利用純化磁珠分別對(duì)各樣品的建庫(kù)產(chǎn)物進(jìn)行純化。去除PCR產(chǎn)物中剩余的引物及dNTP等，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；進(jìn)行濃度、純度測(cè)定及1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品質(zhì)量，所述樣本合格的標(biāo)準(zhǔn)為核酸濃度＞2ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品條帶完整、均一，無明顯拖尾。將所有合格核酸樣品(不超過96個(gè))濃度分別稀釋至2nmol/L，并等體積混樣，統(tǒng)一上機(jī)測(cè)序。

對(duì)照試驗(yàn)：

陽性對(duì)照反應(yīng)體系包括：特異引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；質(zhì)控品200ng；無核酸酶水將體積補(bǔ)足至25μL。陽性對(duì)照用于檢查反應(yīng)體系的擴(kuò)增能力是否正常和樣本是否異常。

陰性對(duì)照反應(yīng)體系包括：特異引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；無核酸酶水將體積補(bǔ)足至25μL。陰性對(duì)照用于檢查反應(yīng)體系是否存在核酸物質(zhì)污染。

陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的反應(yīng)程序同步驟S2的擴(kuò)增反應(yīng)程序。

實(shí)施例2引物特異性驗(yàn)證

利用實(shí)施例1中S1方法從全血樣品(編號(hào)：1-3)、口腔脫落細(xì)胞樣品(編號(hào)：4-6)、石蠟組織樣品(編號(hào)：7-9)中提取核酸，進(jìn)行濃度、純度測(cè)定后，取合格樣品使用10mMTris將每例樣品稀釋至100ng/μL，利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)每例樣品質(zhì)量(合格標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1中S1步驟)，合格后入組并分別進(jìn)行標(biāo)記。利用實(shí)施例1中S2方法對(duì)上述9例合格樣本進(jìn)行擴(kuò)增，上樣量為各2μL，擴(kuò)增后產(chǎn)物純化后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(合格標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1中S3步驟)。9例樣本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特異引物擴(kuò)增及檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照試驗(yàn)同實(shí)施例一，檢測(cè)方法與樣本檢測(cè)方法相同。檢測(cè)結(jié)果見圖3。

檢測(cè)結(jié)果表示，陰性對(duì)照除殘留引物外，無任何非特異條帶，說明反應(yīng)體系是無污染；陽性對(duì)照條帶明亮，大小正確，說明反應(yīng)體系的擴(kuò)增能力正常。9例樣本最終擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在600bp，無其他非特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，同時(shí)引物二聚體含量極少，且引物二聚體大小與擴(kuò)增目標(biāo)片段差異明顯。由此可以看出，本發(fā)明的PCR擴(kuò)增引物及檢測(cè)方法能突破傳統(tǒng)方法產(chǎn)生大量引物二聚體的限制，增強(qiáng)了引物特異性。

實(shí)施例3引物檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證

利用實(shí)施例1中S1方法從質(zhì)檢合格的全血樣品(編號(hào)：1)、口腔脫落細(xì)胞樣品(編號(hào)：4)、石蠟組織樣品(編號(hào)：7)提取樣品核酸進(jìn)行引物檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證。每例樣品起始濃度為100ng/μL，按照5倍、10倍、20倍濃度梯度稀釋，稀釋后每例樣品濃度分別為20ng/μL、10ng/μL和5ng/μL，并分別進(jìn)行樣品名稱及濃度標(biāo)記。利用實(shí)施例1中S2方法對(duì)上述9例合格稀釋樣本進(jìn)行擴(kuò)增，上樣量為各2μL，9例樣本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特異引物擴(kuò)增及檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照試驗(yàn)同實(shí)施例一，檢測(cè)方法與樣本檢測(cè)方法相同。檢測(cè)結(jié)果見圖4。

檢測(cè)結(jié)果表示，陰性對(duì)照除殘留引物外，無任何非特異條帶，說明反應(yīng)體系是無污染；陽性對(duì)照條帶明亮，大小正確，說明反應(yīng)體系的擴(kuò)增能力正常。9例樣本最終擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在600bp，無其他非特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，引物二聚體含量極少，且引物二聚體大小與擴(kuò)增目標(biāo)片段差異明顯，易分辨。同時(shí)，即使模板含量低至10ng，依然能夠成功擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，由此可以看出，本發(fā)明的PCR擴(kuò)增引物及檢測(cè)方法能突破傳統(tǒng)方法的限制，提高了檢測(cè)靈敏度。

實(shí)施例4引物檢測(cè)重復(fù)性驗(yàn)證

利用實(shí)施例1中S1方法從質(zhì)檢合格的全血樣品(編號(hào)：2)、口腔脫落細(xì)胞樣品(編號(hào)：5)、石蠟組織樣品(編號(hào)：8)提取樣品核酸進(jìn)行引物檢測(cè)重復(fù)性驗(yàn)證。由2名不同的操作員在2個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)按照實(shí)施例1中S2方法對(duì)上述3例樣品分別進(jìn)行擴(kuò)增，上樣量為各2μL，3例樣本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特異引物由不同操作員在不同實(shí)驗(yàn)室得到的6個(gè)擴(kuò)增及檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照試驗(yàn)同實(shí)施例一，檢測(cè)方法與樣本檢測(cè)方法相同。檢測(cè)結(jié)果見圖5。

檢測(cè)結(jié)果表示，陰性對(duì)照除殘留引物外，無任何非特異條帶，說明反應(yīng)體系是無污染；陽性對(duì)照條帶明亮，大小正確，說明反應(yīng)體系的擴(kuò)增能力正常。3例樣品共6個(gè)最終擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在600bp，無其他非特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，同時(shí)引物二聚體含量極少，且引物二聚體大小與擴(kuò)增目標(biāo)片段差異明顯。同時(shí)，不同的操作員及不同的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果無明顯差異。由此可以看出，本發(fā)明的PCR擴(kuò)增引物及檢測(cè)方法重復(fù)性好。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

<110> 廣州奇輝生物科技有限公司

<120> 基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特異性引物、試劑盒及

方法

<160> 200

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatccagagc cccgagag 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagagcatc acttgggc 18

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgtattatt ctaaaacctt ccaaatc 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcatttgcat aggagataat catagg 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaatattgaa cgaacttgag gc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtgtttcct gggttatgaa g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcatggctat ttgccttttg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtggttgctt ccaacctagc 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaaggttga taatcacttg ctgag 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gagttttcat ggacagcact tg 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtcttaaca caacaaagag catac 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggactgct tctagcctgg 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gccaacaatt gcttgactg 19

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttggcaaaac tataagataa ggaatc 26

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctagcattgt acctgccaca g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgcacataca tccctgaacc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tggtcatttg acagttctgc 20

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgtatctac ccactctctt ttcag 25

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gttgatttcc acctccaagg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgtttcctta cttccagccc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcacaaatac tcatgccagc 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cagctacttt ggcatttgat tc 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgttccttgg ataacactaa atagc 25

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tggctcagta acaaatgctc c 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgaaagagtt cactccaaat cag 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agctttcgtt ttgaaagcag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

caagaaagca gatttggcag 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tgcctgactg gcatttgg 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggaggaagtc ttctaccagg c 21

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttctcttgga aggctaggat tg 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cagcgatact ttcccagagc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cttggggttt tcaaatgctg 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcagtatttc attggtacct gg 22

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gacccagagt gggcagag 18

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acattcaagg tttcaaagcg 20

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttgtaaaagt ccatgtttat ttggag 26

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccagttgata atgccaaatg tag 23

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagcccactt cattagtact gg 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

acagtgagca caattagccg 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gcatgactac ttcccatagg c 21

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cctggaagta attgtaagca tcc 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aacaagtgtt ggaagcaggg 20

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcaaaagcgt ccagaaagg 19

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tgtgaagaaa acaagctagc ag 22

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cttaaatgac tgcagtaacc agg 23

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcacttctat aaatagactg gggc 24

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cagcaagttg cagcgtttat ag 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gcaaaggaca ccacacacac 20

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

acttgtagtt ccatactagg tgatttc 27

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ttacccatgt gctgagcaag 20

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ttgtgtatca tagattgatg cttttg 26

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gcaataaaag tgtataaatg cctg 24

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gtcctttcac aattggtggc 20

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cagagtaaaa tcaaagtgtt tgttcc 26

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tgtaattcaa cattcatcgt tgtg 24

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tccattgcat tatacccagc 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ctgaagacag agccccagag 20

<210> 58

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

tgacaatacc tacataaaac tctttcc 27

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tctgagctgt gtgctagagg taac 24

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tttatgcagc agatgcaagg 20

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cacttcctga ttttgttttc aac 23

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

aggtgttaaa gggaggaggg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

atctccgtga aaagagcacg 20

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

atgactgaat gaatatctct ggttag 26

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ctctttctct tatcctgatg gg 22

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tgcaaagggg agtggaatac 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

tttccttctc tccattcccc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

taagacaaag gctggtgctg 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

ggtagagggc ctgggttaag 20

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

gaatattgtg tcctccctct ctg 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

tcctactttg acactttgaa tgc 23

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

aaacccatgc aaaaggacc 19

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tccaggagaa tgaattgaca c 21

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

agccagaagt ccttttcagg 20

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

ggaccccaag aatgagctta c 21

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

tctgtgcttc cagccctaag 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

ttaaacgcca ccaattgagc 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

atgcccaggt ttcaagtttc 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

tgcttgggat cgattatgtg 20

<210> 80

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

cccgggctga agtgattc 18

<210> 81

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

caaggtgggc agatcactg 19

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gaatggatta tataccagag ctacaac 27

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

agcctgggtg acagtgagac 20

<210> 84

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

ccaacagcta taaacagtcc tgg 23

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

caccaggaag gaagctgttg 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

aaagtcggct ggcctaagtc 20

<210> 87

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

ctgacttccg ggtggtg 17

<210> 88

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gactgggact gcggaagac 19

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

caaattttcc agcgcttctg 20

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

agcaacactg tgacgtactg g 21

<210> 91

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

tgtctgtcac tggttaaaac taagg 25

<210> 92

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

aacacaggtt tgcctaaatt cc 22

<210> 93

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

ttctcattcc cagtatagag gagac 25

<210> 94

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

aagatcttct accaggctct tagc 24

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

ccagcagctg aaatttgtga g 21

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tctcagggca aaggtataac g 21

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

tccttaatga tcagggcatt tc 22

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

tgacaattat caacctcatc tgc 23

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

ttcactgtgt tgattgacct ttc 23

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

gacagcagag tttcacagga ag 22

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

tggacctagg ttgattgcag 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

aggcagaggt tgcggtaaac 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

caggagaagg ggtgactgac 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

accattcaca ggccaaagac 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

tggaaagtca atgccaaatg 20

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

ggctagaaat acgtggcaaa g 21

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

gttgtaccgt ctttggcctg 20

<210> 108

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

cttgcattga aagtctcttt agg 23

<210> 109

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

tgaagagcag catcttgaat c 21

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

aaacctgcat tcttcaaagc 20

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

tgtttgctca cagaaggagg 20

<210> 112

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

cagaaggaat cgtcatctat aaaac 25

<210> 113

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

gtgattgatg gtactttaat tttgtc 26

<210> 114

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

atgctgcagc caagacctc 19

<210> 115

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

cagttattta ttaccccaga agctg 25

<210> 116

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gcacatacat cttgattctt ttcc 24

<210> 117

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

tcctacttcc aaggatgttc tg 22

<210> 118

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

aagcaagatt attcctttca ttagc 25

<210> 119

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

caattcaacc aaaacacaaa tc 22

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

ttggacctaa gagtcctgcc 20

<210> 121

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

ttggtttatg ttcttgcaga gg 22

<210> 122

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

aggcttgctc agtttctttt g 21

<210> 123

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

aacataacat taagaagagc aaaatg 26

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

catctggttt tcaggcactt c 21

<210> 125

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

aacacctagc caaaaggcag 20

<210> 126

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

tgcagagctt cagtagaaac attc 24

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

ttaaacggaa gtttgctggc 20

<210> 128

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

tttctactgg cagcagtata tttg 24

<210> 129

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

ttcaagtaaa tgtcatgatt ctgttg 26

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

cttgagcttt cgcaacttcc 20

<210> 131

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

ttcataaaga tgaaacggac ttg 23

<210> 132

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

tgtttcctca taacttagaa tgtcc 25

<210> 133

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

aaaatattag tgtcgccaaa gagtc 25

<210> 134

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

tttagggtct ttgcccattg 20

<210> 135

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

aacccgaacg tgatgaaaag 20

<210> 136

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

gatttgtgta acaagttgca ggac 24

<210> 137

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

agctgcccca aagtgtaaag 20

<210> 138

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

tcagaatggt aggaatagct gttag 25

<210> 139

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

ttcagtcatt gaaaattcag cc 22

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

cagtttgtgg gtatgcattt g 21

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

cttgattctg gtattgagcc ag 22

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

aatgcctcgt aacaacctgc 20

<210> 143

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

tggtaaaatc gtttgtgttt cac 23

<210> 144

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

gactgactta tgaagcttcc ctatac 26

<210> 145

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

tgaatgtagc acgcattcac 20

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

aaacttgctt tccacttgct g 21

<210> 147

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

aagatagtac caagcaagtc ttttcc 26

<210> 148

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

ttttctgaag aaccaccttc aac 23

<210> 149

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 149

ttaagggagt gttagaggaa tttg 24

<210> 150

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 150

gcaatttcta ctgcttctgt ttc 23

<210> 151

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 151

ttgggaaaag aacaggcttc 20

<210> 152

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 152

tctgtatatc aaaccatact cccc 24

<210> 153

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 153

tgaagactga ctttactctt tcaaac 26

<210> 154

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 154

taggcacagt ggctcatgtc 20

<210> 155

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 155

tgctgatttc tgttgtatgc ttg 23

<210> 156

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 156

caatttcctt aattcctctc aacc 24

<210> 157

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 157

agggtctgca acaaaggc 18

<210> 158

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 158

cttttgtctg ttttcctcca ag 22

<210> 159

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 159

tttcaggaca tccattttat caag 24

<210> 160

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 160

catcaggaca ttatttaaca acgg 24

<210> 161

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 161

gtgagccact gtgcctgg 18

<210> 162

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 162

ccattcctgc actaatgtgt tc 22

<210> 163

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 163

tttggtaaat tcagttttgg tttg 24

<210> 164

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 164

gagaagaaag agggatgagg g 21

<210> 165

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 165

accatgctca gcaatgaag 19

<210> 166

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 166

cactgacaac tggcttgtgc 20

<210> 167

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

tctagagtca cacttcctaa aatatgc 27

<210> 168

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

gaggggagga tctaactggg 20

<210> 169

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

gcgcaaatat atctgaaact tctagc 26

<210> 170

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

tctagaattt aactgaatca atgactg 27

<210> 171

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

ggcagttcta gaagaatgaa aactc 25

<210> 172

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

ggcaagagac cgaaactcc 19

<210> 173

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

tccactaatc tcagcctccc 20

<210> 174

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

tgtcccttgt tgctattctt tg 22

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

tttgggtgtt ttatgcttgg 20

<210> 176

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

cctgtgatgg ccagagagtc 20

<210> 177

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

tgtcctgttt aaagccatct agttac 26

<210> 178

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

tggattttgc ttctctgata taaac 25

<210> 179

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

gataatcact tcttccattg catc 24

<210> 180

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

tggagattcc ataaactaac aagc 24

<210> 181

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

gataagtgct tgttagttta tggaatc 27

<210> 182

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

tggtagctcc aactaatcat aagag 25

<210> 183

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

ggcatattag agtttccttt cttgc 25

<210> 184

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

aagctatttc cttgatactg gactg 25

<210> 185

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

ggcatgtttg acaattggta tc 22

<210> 186

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

aacagaatat acgatggcct cc 22

<210> 187

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 187

taggggaggg agactgtgtg 20

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 188

actccttggt ggctgaaatg 20

<210> 189

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 189

gaagagcctt ggatttcttg ag 22

<210> 190

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 190

tcttctgaac tggtgggagc 20

<210> 191

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 191

gctgacgaag aacttgcatt g 21

<210> 192

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 192

ccgatacaca aacgctgagg 20

<210> 193

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 193

aaaataagca ggacacaatt acaac 25

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 194

actcctccca cctcagcttc 20

<210> 195

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 195

ttgcccgatt ccgtattg 18

<210> 196

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 196

gctaaactaa aaggaattat ctgcatc 27

<210> 197

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 197

ggcaacatag ggagacccc 19

<210> 198

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 198

aaaggaatta gagttacact gaggg 25

<210> 199

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 199

ttccatcctg ttcaaaagtc ag 22

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 200

gctctgggtc ctgtgatagc 20