本發(fā)明涉及一種回收片段化降解DNA的方法，屬于分子生物學
技術領域：
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背景技術：
：DNA是人類遺傳的物質基礎，為了弄清DNA在人類遺傳和發(fā)育過程中的功能和結構，DNA序列的檢測成為了研究DNA最重要的手段。隨著對DNA信息的海量需求，二代測序誕生了，該技術基于一項邊合成邊測序技術，代表公司有Roche(454)，Illumina(Solexa)，ABI(SOLID)。二代測序技術最基本的技術就是二代測序文庫的構建，文庫構建起始首先將待測樣本的基因組DNA進行破碎和片段化，主要手段有剪切力，超聲波，氮氣，酶切等。影響DNA片段化最關鍵的因素在于基因組DNA的完整度，完整度高的DNA會獲得較好的效果。然而很多臨床樣本大多為石蠟包埋樣本，近年來也出現(xiàn)了很多穿刺及激光微切割樣本，這些樣本的DNA量少，降解程度高。使用常規(guī)DNA片段化及回收手段處理這類樣本時，往往因為降解DNA被片段化后，片段過小導致純化過程中大幅損失，因此降解DNA的片段化回收率低成為了科研人員對這類樣本研究中的瓶頸問題。如何提高降解DNA片段化回收率及盡可能保證DNA片段均一成為亟待解決的問題。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種回收片段化降解DNA方法，以克服現(xiàn)有技術中的不足。為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案包括：本發(fā)明實施例提供一種回收片段化降解DNA的方法，其包括以下步驟：在降解DNA的溶液中加入羧基磁珠，使大片段DNA與羧基磁珠結合，而使小片段DNA保留于溶液中，所述大片段DNA的尺寸大于2000bp，所述小片段DNA的尺寸為200bp～2000bp；將結合有大片段DNA的羧基磁珠與包含小片段DNA的溶液分離；使大片段DNA與羧基磁珠分離，再對大片段DNA進行片段化處理，直至形成小片段DNA；回收所述包含小片段DNA的溶液中的小片段DNA以及由大片段DNA經片段化處理形成的小片段DNA。在一些實施方案中，所述一種回收片段化降解DNA的方法包括以下步驟：(1)取降解DNA溶于水，形成降解DNA溶液；(2)向降解DNA溶液中加入羧基磁珠，混合均勻后，在室溫下孵育，使羧基磁珠與大片段DNA充分結合；(3)利用磁場作用使羧基磁珠沉降，直至混合液澄清，再分離出羧基磁珠，并收集包含小片段DNA的澄清液；(4)對羧基磁珠進行清洗；(5)將羧基磁珠室溫干燥后，以洗脫液進行洗脫，并在室溫下放置；(6)利用磁場作用使步驟(5)所獲洗脫混合液達到澄清，再將澄清溶液分離出；(7)將步驟(6)分離出的澄清溶液轉移至片段化儀中進行片段化處理，使其中的大片段DNA被打斷為小片段DNA；(8)將步驟(7)所獲的含小片段DNA的溶液與步驟(3)所獲的包含小片段DNA的澄清液合并；(9)從步驟(8)最終所獲的含小片段DNA的溶液中分離出小片段DNA。在一些實施方案中，所述降解DNA的溶液中降解DNA的濃度為1ug/30uL～1ug/150uL。在一些實施方案中，將羧基磁珠加入降解DNA的溶液中，步驟(2)包括：將羧基磁珠加入降解DNA的溶液中，混合均勻后在室溫下孵育5min-20min，使羧基磁珠與其中的大片段DNA充分結合。其中，所述羧基磁珠為5mg/mL，用量為20uL-100uL。在一些實施方案中，步驟(4)包括：以濃度為80v/v％的乙醇溶液對羧基磁珠進行清洗。在一些實施方案中，步驟(5)包括：將羧基磁珠在室溫下干燥1min-10min，之后加入洗脫液進行洗脫。在一些實施方案中，將與降解DNA的大片段結合的羧基磁珠置于Covaris片段化儀中進行片段化處理至降解DNA的小片段。在一些實施方案中，所述的回收片段化降解DNA的方法，其特征在于，步驟(9)包括：將步驟(8)最終所獲的含小片段DNA的溶液與磷酸鹽緩沖液均勻混合后加入離心柱；向所述離心柱中加入PE緩沖液，清洗離心柱；將空的離心柱放置入離心機中全速離心2min，，并室溫晾干；向離心柱中加入洗脫液，洗脫小片段DNA。所述洗脫液為濃度為3mM-15mM的Tris緩沖鹽溶液，其pH值為7.3-8.5。在一些實施方案中，所述試劑I的配置方法為：取3mM-15mMTris緩沖液溶于超純水中，之后用HCl溶液調節(jié)溶液的pH值為7.3-8.5。在一些實施方案中，將與降解DNA的大片段結合的羧基磁珠中進行清洗處理后，在室溫下干燥1min-10min，之后加入30uL-80uL的試劑I。在一些實施方案中，待小片段DNA全部從離心柱中分離后，向離心柱中加入體積為15uL-80uL的試劑I，在20℃-70℃條件下洗脫所述離心柱。在一些實施方案中，步驟(9)中采用的洗脫溫度為20℃-70℃。在一些實施方案中，步驟(9)中采用的洗脫緩沖液用量為100uL。在一些實施方案中，所述緩沖液包括緩沖液PB(德國凱杰)，所述緩沖液的用量為0.5mL-3mL。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：本發(fā)明提供的回收片段化降解DNA方法大大提高了片段化降解DNA純化回收率，較現(xiàn)有的DNA片段化回收方法而言，設計了針對降解DNA的片段化回收方法，為該類樣本用于下游分子生物學研究提供了有效保障，且該方法所用試劑成分簡單，操作方便，成本低廉，不需特殊設備，并能提高片段化降解DNA回收率。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1～實施例4以及對比例中DNA用量對比圖。圖2是本發(fā)明實施例1～實施例4以及對比例中DNA回收率對比圖。具體實施方式鑒于現(xiàn)有技術中的不足，本案發(fā)明人經長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明的技術方案。如下將對該技術方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。本發(fā)明實施例提供一種回收片段化降解DNA的方法，其包括以下步驟：在降解DNA的溶液中加入羧基磁珠，使大片段DNA與羧基磁珠結合，而使小片段DNA保留于溶液中，所述大片段DNA的尺寸大于2000bp，所述小片段DNA的尺寸為200bp～2000bp；將結合有大片段DNA的羧基磁珠與包含小片段DNA的溶液分離；使大片段DNA與羧基磁珠分離，再對大片段DNA進行片段化處理，直至形成小片段DNA；回收所述包含小片段DNA的溶液中的小片段DNA以及由大片段DNA經片段化處理形成的小片段DNA。在一些實施方案中，所述一種回收片段化降解DNA的方法包括以下步驟：(1)取降解DNA溶于水，形成降解DNA溶液；(2)向降解DNA溶液中加入羧基磁珠，混合均勻后，在室溫下孵育，使羧基磁珠與大片段DNA充分結合；(3)利用磁場作用使羧基磁珠沉降，直至混合液澄清，再分離出羧基磁珠，并收集包含小片段DNA的澄清液；(4)對羧基磁珠進行清洗；(5)將羧基磁珠室溫干燥后，以洗脫液進行洗脫，并在室溫下放置；(6)利用磁場作用使步驟(5)所獲洗脫混合液達到澄清，再將澄清溶液分離出；(7)將步驟(6)分離出的澄清溶液轉移至片段化儀中進行片段化處理，使其中的大片段DNA被打斷為小片段DNA；(8)將步驟(7)所獲的含小片段DNA的溶液與步驟(3)所獲的包含小片段DNA的澄清液合并；(9)從步驟(8)最終所獲的含小片段DNA的溶液中分離出小片段DNA。在一些實施方案中，所述降解DNA的溶液中降解DNA的濃度為1ug/30uL～1ug/150uL。在一些實施方案中，將羧基磁珠加入降解DNA的溶液中，步驟(2)包括：將羧基磁珠加入降解DNA的溶液中，混合均勻后在室溫下孵育5min-20min，使羧基磁珠與其中的大片段DNA充分結合。其中，所述羧基磁珠的用量為20uL-100uL。在一些實施方案中，步驟(4)包括：以濃度為80v/v％的乙醇溶液對羧基磁珠進行清洗。在一些實施方案中，步驟(5)包括：將羧基磁珠在室溫下干燥1min-10min，之后加入洗脫液進行洗脫。在一些實施方案中，所述的回收片段化降解DNA的方法，其特征在于，步驟(9)包括：將步驟(8)最終所獲的含小片段DNA的溶液與磷酸鹽緩沖液均勻混合后加入離心柱；向所述離心柱中加入PE緩沖液，清洗離心柱；將空的離心柱放置入離心機中全速離心2min，并室溫晾干；向離心柱中加入洗脫液，洗脫小片段DNA。所述洗脫液為濃度為3mM-15mM的Tris緩沖鹽溶液，其pH值為7.3-8.5。在一些實施方案中，所述試劑I的配置方法為：取3mM-15mMTris緩沖液溶于超出水中，之后用HCl溶液調節(jié)溶液的pH值為7.3-8.5。在一些實施方案中，將與降解DNA的大片段結合的羧基磁珠中進行清洗處理后，在室溫下干燥1min-10min，之后加入30uL-80uL的試劑I。在一些實施方案中，步驟(9)中采用的洗脫溫度為20℃-70℃。在一些實施方案中，步驟(9)中采用的蛋白酶K用量為100uL。在一些實施方案中，所述緩沖液包括緩沖液PB，所述緩沖液的用量為0.5mL-3mL。在一些實施方案中，將與降解DNA的大片段結合的羧基磁珠置于Covaris片段化儀中進行片段化處理至降解DNA的小片段。在一些實施方案中，待小片段DNA全部從離心柱中分離后，向離心柱中加入體積為15uL-80uL的試劑I，在20℃-70℃條件下洗脫所述離心柱。在一些實施方案中，所述回收片段化降解DNA的方法具體包括以下步驟：(1)取1ug降解DNA補水至合適體積。(2)向DNA中加入一定體積的羧基磁珠，混勻后室溫放置合適時間。(3)混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(4)向羧基磁珠中加入新鮮配置的80％乙醇，清洗2次。(5)室溫干燥一段時間后，加入適當體積的溶液I進行洗脫，并放置室溫適當時間。(6)洗脫混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(7)將上一步中的離心管轉移至Covaris片段化儀中進行片段化。(8)將打斷后的DNA轉移至步驟(3)中的離心管中，充分混勻。(9)向混合后的DNA液中加入適當體積的緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中。(10)向MinEluteColumn中加入緩沖液PE，清洗離心柱。(11)空離離心柱，并室溫晾干。(12)向離心柱中加入溶液I，洗脫DNA。所述步驟(1)中加水至適合體積為30uL-150uL。所述步驟(2)中羧基磁珠用量為20uL-100uL，孵育時間為5min-20min。所述步驟(5)中室溫干燥時間為1min-10min。所述步驟(5)中試劑I的pH為7.3-8.5，溶劑是超純水，溶質為如下終濃度物質：Tris3mM-15mM，加HCl調節(jié)pH值。所述步驟(5)中試劑I的加入體積為30uL-80uL。所述步驟(9)中加入的緩沖液PB體積為0.5mL-3mL。所述步驟(12)中試劑I的加入體積為15uL-80uL，洗脫溫度為20℃-70℃。更適宜的是，所述步驟(12)中，蛋白酶K用量為100uL。優(yōu)選的，所述步驟(1)中加水至體積為100uL。優(yōu)選的，所述步驟(2)中羧基磁珠用量為60uL，孵育時間為10min。優(yōu)選的，所述步驟(5)中室溫干燥時間為3min。優(yōu)選的，所述步驟(5)中試劑I的pH為8.0，溶劑是超純水，溶質為如下終濃度物質：Tris10mM，加HCl調節(jié)pH值。優(yōu)選的，其中所述步驟(5)中試劑I的加入體積為50uL。優(yōu)選的，其中所述步驟(9)中加入的緩沖液PB體積為1.1mL。優(yōu)選的，其中所述步驟(12)中試劑I的加入體積為30uL，洗脫溫度為55℃。本發(fā)明提供的回收片段化降解DNA方法大大提高了片段化降解DNA純化回收率，為該類樣本用于下游分子生物學研究提供了有效保障。本發(fā)明的一種高效回收片段化降解DNA方法，只需使用市面現(xiàn)有羧基磁珠試劑和PCR純化試劑，材料來源簡單，操作難度低，無需專門技術培訓及特殊儀器設備。以下結合附圖和若干實施例及對比例對本發(fā)明的技術方案作進一步的解釋說明。本發(fā)明將根據(jù)具體事例做進一步的描述，但其僅為例證性的目的，并非用以限制本發(fā)明。在對實例描述前，有必要提供一些備注說明：采用不同廠家、不同批次的試劑會造成實驗結果的差異，屬于正?，F(xiàn)象。在進行小規(guī)模實驗室，為保證平行實驗間的重復性，建議配置試劑后，充分混勻并分裝，以保證每次實驗試劑的均一性。實施例1試劑準備：羧基磁珠AmpureXPBeads(Beckman)，分離柱QiaAmpMinEluteColumn(Qiagen)，緩沖液PB(Qiagen)，緩沖液PE(Qiagen)，無水乙醇(國藥)，QubitdsDNAHSAssay(LifeTechnologies)。試劑I：pH為8.0，溶劑為超純水，溶質包含以下終濃度物質，Tris緩沖液10mM(國藥)，HCl溶液調節(jié)pH用。實驗操作過程：(1)取1ug降解DNA補水至100uL；(2)向步驟(1)降解DNA中加入60uLAmpureXPBeads，混勻后室溫放置10min；(3)混合液放置磁力架上至澄清，轉移上層清液至1.5mL離心管中；(4)向步驟(3)中下層混合液中加入新鮮配置的80wt％乙醇溶液，清洗2次；(5)室溫3min，加入50uL試劑I進行洗脫，并放置室溫3min；(6)洗脫混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(7)將步驟(6)中的離心管轉移至Covaris片段化儀中進行片段化，片段化條件如下：Intensity4DutyCycle10％CycleperBurst200TreatmentTime(s)30(8)將步驟(7)打斷后的DNA轉移至步驟(3)中的離心管中，并充分混勻。(9)向步驟(8)中混合后的DNA液中加入1.1mL緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中，放入離心機中8000rpm離心30s，反復該步驟至全部DNA液全部通過MinEluteColumn。(10)向MinEluteColumn中加入700uL緩沖液PE，清洗離心柱2次。(11)空離離心柱，并室溫晾干3min。(12)向MinEluteColumn中心加入試劑I30uL，55℃孵育5min，離心得到終產物。最后測得終產物濃度為：27.2ng/ul。實施例2試劑準備：羧基磁珠AmpureXPBeads(Beckman)，分離柱QiaAmpMinEluteColumn(Qiagen)，緩沖液PB(Qiagen)，緩沖液PE(Qiagen)，無水乙醇(國藥)，QubitdsDNAHSAssay(LifeTechnologies)。試劑I：pH為8.0，溶劑為超純水，溶質包含以下終濃度物質，Tris緩沖液10mM(國藥)，HCl溶液調節(jié)pH用。實驗操作過程：(1)取1ug降解DNA補水至100uL；(2)向步驟(1)降解DNA中加入60uLAmpureXPBeads，混勻后室溫放置10min；(3)混合液放置磁力架上至澄清，轉移上層清液至1.5mL離心管中；(4)向步驟(3)中下層混合液中加入新鮮配置的80wt％乙醇溶液，清洗2次；(5)室溫3min，加入50uL試劑I進行洗脫，并放置室溫3min；(6)洗脫混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(7)將步驟(6)中的離心管轉移至Covaris片段化儀中進行片段化，片段化條件如下：Intensity4DutyCycle10％CycleperBurst200TreatmentTime(s)30(8)將步驟(7)打斷后的DNA轉移至步驟(3)中的離心管中，并充分混勻。(9)向步驟(8)中混合后的DNA液中加入1.1mL緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中，放入離心機中8000rpm離心30s，反復該步驟至全部DNA液全部通過MinEluteColumn。(10)向MinEluteColumn中加入700uL緩沖液PE，清洗離心柱2次。(11)空離離心柱，并室溫晾干3min。(12)向MinEluteColumn中心加入試劑I30uL，55℃孵育5min，離心得到終產物。最后測得終產物濃度為：28.8ng/ul。實施例3試劑準備：羧基磁珠AmpureXPBeads(Beckman)，分離柱QiaAmpMinEluteColumn(Qiagen)，緩沖液PB(Qiagen)，緩沖液PE(Qiagen)，無水乙醇(國藥)，QubitdsDNAHSAssay(LifeTechnologies)。試劑I：pH為8.0，溶劑為超純水，溶質包含以下終濃度物質，Tris緩沖液10mM(國藥)，HCl溶液調節(jié)pH用。實驗操作過程：(1)取1ug降解DNA補水至100uL；(2)向步驟(1)降解DNA中加入60uLAmpureXPBeads，混勻后室溫放置10min；(3)混合液放置磁力架上至澄清，轉移上層清液至1.5mL離心管中；(4)向步驟(3)中下層混合液中加入新鮮配置的80wt％乙醇溶液，清洗2次；(5)室溫3min，加入50uL試劑I進行洗脫，并放置室溫3min；(6)洗脫混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(7)將步驟(6)中的離心管轉移至Covaris片段化儀中進行片段化，片段化條件如下：Intensity4DutyCycle10％CycleperBurst200TreatmentTime(s)30(8)將步驟(7)打斷后的DNA轉移至步驟(3)中的離心管中，并充分混勻。(9)向步驟(8)中混合后的DNA液中加入1.1mL緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中，放入離心機中8000rpm離心30s，反復該步驟至全部DNA液全部通過MinEluteColumn。(10)向MinEluteColumn中加入700uL緩沖液PE，清洗離心柱2次。(11)空離離心柱，并室溫晾干3min。(12)向MinEluteColumn中心加入試劑I30uL，55℃孵育5min，離心得到終產物。最后測得終產物濃度為：26.3ng/ul。實施例4試劑準備：羧基磁珠AmpureXPBeads(Beckman)，分離柱QiaAmpMinEluteColumn(Qiagen)，緩沖液PB(Qiagen)，緩沖液PE(Qiagen)，無水乙醇(國藥)，QubitdsDNAHSAssay(LifeTechnologies)。試劑I：pH為8.0，溶劑為超純水，溶質包含以下終濃度物質，Tris緩沖液10mM(國藥)，HCl溶液調節(jié)pH用。實驗操作過程：(1)取1ug降解DNA補水至100uL；(2)向步驟(1)降解DNA中加入60uLAmpureXPBeads，混勻后室溫放置10min；(3)混合液放置磁力架上至澄清，轉移上層清液至1.5mL離心管中；(4)向步驟(3)中下層混合液中加入新鮮配置的80wt％乙醇溶液，清洗2次；(5)室溫3min，加入50uL試劑I進行洗脫，并放置室溫3min；(6)洗脫混合液放置磁力架上至澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中。(7)將步驟(6)中的離心管轉移至Covaris片段化儀中進行片段化，片段化條件如下：Intensity4DutyCycle10％CycleperBurst200TreatmentTime(s)30(8)將步驟(7)打斷后的DNA轉移至步驟(3)中的離心管中，并充分混勻。(9)向步驟(8)中混合后的DNA液中加入1.1mL緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中，放入離心機中8000rpm離心30s，反復該步驟至全部DNA液全部通過MinEluteColumn。(10)向MinEluteColumn中加入700uL緩沖液PE，清洗離心柱2次。(11)空離離心柱，并室溫晾干3min。(12)向MinEluteColumn中心加入試劑I30uL，55℃孵育5min，離心得到終產物。最后測得終產物濃度為：29.1ng/ul。對比例試劑準備：羧基磁珠QiaAmpMinEluteColumn(Qiagen)，緩沖液PB(Qiagen)，緩沖液PE(Qiagen)，緩沖液EB(Qiagen)，QubitdsDNAHSAssay(LifeTechnologies)。實驗操作過程：(1)取1ug降解DNA補水至50uL，并轉移至Covaris片段化儀中進行片段化，片段化條件如下：Intensity4DutyCycle10％CycleperBurst200TreatmentTime(s)30(2)向打斷后的DNA液中加入250uL緩沖液PB，充分混勻后，加入MinEluteColumn中，放入離心機中8000rpm離心30s，反復該步驟至全部DNA液全部通過MinEluteColumn。(3)向MinEluteColumn中加入700uL緩沖液PE，清洗離心柱2次。(4)空離離心柱，并室溫晾干3min。(5)向MinEluteColumn中心加入緩沖液EB30uL，55℃孵育5min，離心得到終產物。最后測得終產物濃度為：5.2ng/ul。從圖1和圖2的附圖可以看出，本發(fā)明使用的一種高效回收片段化降解DNA的方法所用試劑成分簡單，操作方便，成本低廉，不需特殊設備，可針對降解DNA提高片段化回收率，回收率遠遠高于現(xiàn)有的DNA片段化回收率。因此，本發(fā)明可有效提高降解DNA提高片段化回收率，大大改善科研人員在處理降解DNA進行下游分子生物研究時所遭遇的問題。應當理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發(fā)明的內容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3