本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種人重組組織因子及其基因、表達(dá)載體、宿主菌和表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
：凝血酶原時(shí)間(PT)是外源性凝血系統(tǒng)常用篩選試驗(yàn)之一，是指在缺乏血小板的血漿中加入過量的組織因子和Ca2+后，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，后者使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，血漿凝固所需要的時(shí)間即為PT。組織因子(TF)，是一種完整的膜糖蛋白。TF作為非酶類的蛋白輔助因子，可以與血液凝結(jié)因子FVIIa(blood-coagulationfactorVIIa)互作形成TF-FVIIa復(fù)合體啟動外源性凝血過程。人的TF蛋白是由263個(gè)氨基酸組成，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外結(jié)構(gòu)域(1-219)，跨膜結(jié)構(gòu)域(220-242)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(243-263)。胞外結(jié)構(gòu)域的功能主要是結(jié)合并激活FVIIa啟動外源凝血過程。TF與FVIIa的相互作用是鈣離子依賴的，而且TF-FVIIa復(fù)合體對FIX和FX的蛋白酶解過程是膜依賴的，跨膜結(jié)構(gòu)域主要就是將TF蛋白錨定細(xì)胞膜上，對組織因子的生物活性非常重要，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域主要起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。理論上TF蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域兩者就有了啟動外源性凝血過程的全部功能?，F(xiàn)有的技術(shù)表達(dá)的人組織因子存在生產(chǎn)工序復(fù)雜，活性低于正常糖基化的組織因子；而且異源表達(dá)系統(tǒng)存在密碼子偏好影響蛋白的表達(dá)；也同樣會影響蛋白的活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人重組組織因子，具有較高的生物活性。本發(fā)明的第二目的在于提供編碼上述的人重組組織因子的基因。本發(fā)明的第三目的在于提供含有上述基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四目的在于提供含有上述基因的宿主菌。本發(fā)明的第五目的在于提供一種人重組組織因子的表達(dá)方法，可以快速高效的獲得具有較高生物活性的人重組組織因子。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。編碼上述的人重組組織因子的基因。含有上述基因的表達(dá)載體。含有上述基因的宿主菌。一種人重組組織因子的表達(dá)方法，其包括：將上述的基因克隆到第一載體，獲得第一克隆載體；酶切第一克隆載體并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)菌株；培養(yǎng)表達(dá)菌株并用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)菌株表達(dá)組織因子。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供人重組組織因子，具有較好的生物活性；通過表達(dá)載體連接表達(dá)人重組組織因子的目的基因在宿主菌種中表達(dá)，可以快速的、高效的獲得大量的組織因子，人重組組織因子的表達(dá)效率更高，活性也更高。提供的組織因子的表達(dá)方法，操作步驟簡單，操作簡便，反應(yīng)條件溫和，方便簡潔；有利于大量的獲得人重組組織因子。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例3提供的pPIC9K載體示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對本發(fā)明實(shí)施例的一種人重組組織因子及其基因、表達(dá)載體、宿主菌和表達(dá)方法進(jìn)行具體說明。20世紀(jì)初期，Schmid與Moranitz首次發(fā)現(xiàn)了組織中血液凝固的啟動因子，并將其命名為組織因子(Tissuefactor，TF)。到20世紀(jì)80年代，組織因子被證實(shí)是生理性凝血過程中最重要的啟動因子。人們借助重組DNA、人工致突變及基因剔除等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步在分子水平和基因水平研究TF，發(fā)現(xiàn)TF與全身炎癥反應(yīng)綜合癥及休克、DIC、血栓性疾病、移植排斥反應(yīng)、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，近年來又研究發(fā)現(xiàn)TF還具有參與愈傷組織修復(fù)、新生血管形成及胚胎發(fā)育等多種生理功能。因此，組織因子在生物制藥領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用發(fā)展前景。一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。普通的人組織因子由263個(gè)氨基酸組成，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外結(jié)構(gòu)域(1-219)，跨膜結(jié)構(gòu)域(220-242)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(243-263)。在普通的組織因子的C端融合一段由6個(gè)組氨酸組成的His-tag蛋白標(biāo)簽，且去掉了組織因子的信號肽序列，得到本發(fā)明提供的組織因子。一般地，在蛋白質(zhì)序列合成后，胞外蛋白會在信號肽的引導(dǎo)下發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)；然后，信號肽會被切除掉，實(shí)際發(fā)生作用的時(shí)候也是不包括信號肽序列的；所以，在表達(dá)蛋白的時(shí)候?qū)⑿盘栯娜サ簦遣粫绊懙鞍椎墓δ艿?。同時(shí)在蛋白的C端添加一個(gè)由6個(gè)組氨酸組成的His-tag蛋白標(biāo)簽，也不會對蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，也不會影響蛋白的功能。編碼上述的人重組組織因子的基因。進(jìn)一步地，上述基因的堿基序列如SEQIDNO.2所示。上述堿基序列是表達(dá)人重組組織因子原基因序列去掉信號肽序列的基礎(chǔ)上做的密碼子優(yōu)化。該基因序列是專門針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對人組織因子的密碼子進(jìn)行的優(yōu)化，得到的表達(dá)基因序列；并在序列的末端引入編碼6個(gè)組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC，然后再加上終止密碼子：TAA。在序列上引入編碼6個(gè)組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC；可以很方便的在蛋白表達(dá)完成后，對蛋白進(jìn)行純化操作。組氨酸標(biāo)簽(Histidine-tag)，基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記最通行的標(biāo)記之一，是在蛋白質(zhì)的氨基端加上His-tag標(biāo)簽，在一般或者變性條件下可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互螯合作用，這些金屬離子包括Ca2+、Mg2+、Ni2+和Co2+等，其中尤其是以鎳離子使用最為廣泛，因?yàn)殒囯x子和組氨酸標(biāo)簽的結(jié)合效率最高。通常將菌體破壁后，將含有人重組組織因子的溶液通過Ni吸附柱，Ni吸附柱中的鎳離子將與目的蛋白上的His-tag蛋白標(biāo)簽螯合，達(dá)到將目的蛋白分離出來的目的，然后用高濃度的咪唑溶液洗脫Ni吸附柱，就能將目的蛋白洗脫出來。由于做蛋白異源表達(dá)的時(shí)候，不同的表達(dá)系統(tǒng)，會存在密碼子的偏好性；具有多個(gè)密碼子的氨基酸，在翻譯的時(shí)候會使用一個(gè)單一的轉(zhuǎn)運(yùn)rRNA；如果20種氨基酸中的一種或多種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)rRNA使用過多，會影響蛋白的合成，可能導(dǎo)致蛋白合成的提前終止，使蛋白的氨基酸鏈不完整，導(dǎo)致蛋白質(zhì)后續(xù)的加工和折疊等過程也被影響，進(jìn)而影響蛋白的功能。另外甚至一些表達(dá)系統(tǒng)還存在一些很少使用的稀有密碼子，一旦在異源表達(dá)的序列中出現(xiàn)稀有密碼子，或者異源表達(dá)的序列中出現(xiàn)過多的稀有密碼子，這兩種情況都可能會導(dǎo)致蛋白表達(dá)失敗。所以需要對基因序列進(jìn)行優(yōu)化。成功表達(dá)出目的蛋白后也還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證蛋白的是否為具有相應(yīng)的生物活性，因?yàn)橛袝r(shí)候表達(dá)出蛋白會存在沒有生物活性的情況發(fā)生。另外，在序列的末尾加上終止密碼子，在表達(dá)的基因序列表達(dá)結(jié)束即用終止密碼子將序列終止，避免表達(dá)載體序列；如果表達(dá)出載體序列的氨基酸，引起蛋白的一級結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而有可能導(dǎo)致蛋白的二結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及空間取向和活性位點(diǎn)被改變；或者是活性部位被遮蓋，導(dǎo)致功能的喪失。所以需要加上終止密碼，及時(shí)終止蛋白的表達(dá)。含有上述基因的載體。通過表達(dá)載體連接能表達(dá)上述蛋白的基因序列，可以通過異源表達(dá)的方法，大量表達(dá)目的蛋白；通過大量表達(dá)目的蛋白，然后可以大規(guī)模的應(yīng)用。含有上述基因的宿主菌。一種人重組組織因子的表達(dá)方法，其包括：將上述的基因克隆到第一載體，獲得第一克隆載體；酶切第一克隆載體并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)菌株；培養(yǎng)表達(dá)菌株并用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)菌株表達(dá)組織因子。在表達(dá)組織因子的時(shí)候，用SalI限制性內(nèi)切酶將第一克隆載體酶切線性化，然后將線性化的第一克隆載體通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞。利用真核生物中同源重組機(jī)制，通過同源臂重組，將表達(dá)序列整合到酵母染色體上，通過篩選獲得陽性表達(dá)菌株，方便進(jìn)行組織因子的表達(dá)。進(jìn)一步地，第一載體為pPIC9K載體。進(jìn)一步地，上述基因位于pPIC9K載體EcoRI和NotI位點(diǎn)之間。進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。由已有的研究顯示組織因子的正常糖基化對組織因子的活性非常重要，所以此重組組織因子蛋白的活性與正常糖基化的組織因子仍然存在差距。采用大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，導(dǎo)致大腸桿菌中表達(dá)的組織因子不能被糖基化，進(jìn)而影響組織因子的功能；同時(shí)異源的膜蛋白在原核系統(tǒng)中表達(dá)常常存在表達(dá)量低和蛋白因不正確折疊而形成包涵體的問題，增加了表達(dá)和純化重組蛋白的難度。又因?yàn)榻湍傅鞍妆磉_(dá)系統(tǒng)屬于真核蛋白系統(tǒng)，能夠一定程度上的規(guī)避這些問題，同時(shí)相比于哺乳細(xì)胞和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)有著周期短、成本低、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。所以選用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行組織因子的表達(dá)。同時(shí)，將組織因子針對酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并且選用酵母表達(dá)系統(tǒng)能提高表達(dá)的組織因子的生物活性。進(jìn)一步地，誘導(dǎo)劑為甲醇。在酵母表達(dá)的時(shí)候，在沒有外界刺激的情況下，蛋白的表達(dá)量會很低；但是，如果通過添加誘導(dǎo)劑，就能刺激宿主細(xì)胞快速、高效的表達(dá)出大量的目的蛋白。pPIC9K載體具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶(AlocholOxidase，AOX1)基因啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；本發(fā)明中，誘導(dǎo)劑優(yōu)選為甲醇，使用甲醇大量誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。該組織因子由269個(gè)氨基酸組成，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外結(jié)構(gòu)域(1-219)，跨膜結(jié)構(gòu)域(220-242)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(243-263)；并在C端融合一段由6個(gè)組氨酸組成的His-tag蛋白標(biāo)簽。該組織因子可以與血液凝結(jié)因子FVIIa互作形成TF-FVIIa復(fù)合體啟動外源性凝血過程。實(shí)施例2本實(shí)施例提供編碼人重組組織因子的基因，該基因的堿基序列如SEQIDNO.2所示。該序列是在NCBI核算數(shù)據(jù)庫中編碼人組織因子的原表達(dá)序列，通過生物信息學(xué)的方法針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化；使優(yōu)化的基因序列能在畢赤酵母中高效的、穩(wěn)定的表達(dá)出人重組組織因子蛋白，且保持其生物活性。該堿基序列是表達(dá)組織因子原基因序列去掉信號肽序列的基礎(chǔ)上做的密碼子優(yōu)化，并在序列的末端引入編碼6個(gè)組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC，然后再加上終止密碼子：TAA。添加編碼6個(gè)組氨酸組成的His-tag蛋白標(biāo)簽，方便后續(xù)的蛋白純化實(shí)驗(yàn)，末尾添加終止密碼子，是和自然表達(dá)狀態(tài)一致，避免有多余的氨基酸存在影響蛋白的功能。實(shí)施例3本實(shí)施例提供含有實(shí)施例2所示的編碼人重組組織因子的基因序列的表達(dá)載體和宿主菌。本實(shí)施例中以pPIC9K載體作為表達(dá)載體，載體示意圖見圖1。經(jīng)過對優(yōu)化的組織因子表的基因的序列以及結(jié)合pPIC9K載體序列的多克隆位點(diǎn)的分析，選用多克隆位點(diǎn)EcoRI和NotI位點(diǎn)作為組織因子的表達(dá)基因在載體上插入位點(diǎn)，構(gòu)建成第一克隆載體pPIC9K-TF。pPIC9K-TF載體構(gòu)建方法，具體過程如下：1.1以線性化pEASY-Blunt載體3μL和目的片段1μL混合于200μL的離心管中，快速離心后將混合反應(yīng)液置在25℃條件下反應(yīng)30min，然后冰??；1.2取TOP10感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，待感受態(tài)細(xì)胞融化后，取501μL的TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并加入1.1中的連接產(chǎn)物反應(yīng)液，移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min；1.3在42℃件下熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移冰浴2-3min；1.4向冰浴過的離心管中加入500μL無菌的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻后在37℃的搖床上150rpm震蕩培養(yǎng)45min；1.5去適量的轉(zhuǎn)化的TOP10感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(Amp+)上，待培養(yǎng)基表面吹干后蓋上培養(yǎng)皿，37℃倒置培養(yǎng)8h；1.6待平板長出單菌落后，挑取單菌落并鑒定出陽性克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克??；1.7提取陽性克隆的質(zhì)粒；1.8用EcoRI和NotI雙酶切提取的陽性克隆質(zhì)粒和pPIC9K載體質(zhì)粒，并回收純化酶切片段；1.9加2μL回收的pPIC9K載體片段，6μL目的基因片段，T4連接酶1μL，T4連接酶buffer2μL，用ddH2O補(bǔ)足到15μL，16℃連接過夜，得到pPIC9K-TF載體質(zhì)粒；1.10將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于LB固體培養(yǎng)基(Kan+)上，37℃倒置培養(yǎng)8h，重復(fù)1.6和1.7的操作；1.11用限制性內(nèi)切酶SalI酶切1.10提取的pPIC9K-TF載體質(zhì)粒，并通過1％的瓊脂糖凝膠電泳回收純化線性化的pPIC9K-TF載體片段；1.12將線性化的pPIC9K-TF載體片段用無菌超純水溶解后通過電穿孔法轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞；1.13通過MD平板篩選出陽性克隆后，選取10個(gè)克隆利用PCR進(jìn)行進(jìn)一步陽性驗(yàn)證，將確認(rèn)陽性的酵母接入液體培養(yǎng)基并利用甲醇進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)然本實(shí)施例提供的是pPIC9K-TF載體構(gòu)建的一種方法，依然還有其他的構(gòu)建方法可以得到pPIC9K-TF表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例提供對實(shí)施例3提供的載體和宿主菌表達(dá)的人重組組織因子的純度的分析。人重組組織因子的純度分析，具體方法如下：1.1將確認(rèn)陽性的酵母接入液體培養(yǎng)基并利用甲醇進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；1.2表達(dá)后菌液經(jīng)過離心后取上清，并對上清液進(jìn)行Dot-Blot(Anti-His抗體)進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證，驗(yàn)證蛋白表達(dá)量較高的3株菌株進(jìn)一步通過SDS-PAG蛋白凝膠電泳和Western-Blot進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，并鑒定出蛋白表達(dá)量最高的菌株；1.3將表達(dá)最為明顯的菌株接種到BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，重新接種到BMMY液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24小時(shí)補(bǔ)加5％的甲醇；1.4在72小時(shí)后收集上清培養(yǎng)液，72小時(shí)的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮后利用融合蛋白的His-tag蛋白標(biāo)簽進(jìn)行純化；1.5純化后的蛋白放入透析袋中，使用PBS(PH＝7.4)透析過夜去除純化蛋白殘留的鹽離子；1.6表達(dá)后的人重組組織因子蛋白通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，并通過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測純度。通過以上步驟鑒定，監(jiān)測結(jié)果顯示純化的人重組組織因子蛋白純度在95％以上。實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例提供對對實(shí)施例3提供的載體和宿主菌表達(dá)的人重組組織因子的生物活性的測定。人重組組織因子的生物活性的測定的具體方法如下：1.1人凝血酶原復(fù)合物溶液的制備：取0.1mol/LTris-HCl緩沖液10ml(含0.012mol/LCaCl2，PH＝7.4)，加入凍干人凝血酶原復(fù)合物10U，人凝血酶原復(fù)合物溶液的濃度為1U/ml；1.2將標(biāo)準(zhǔn)組織凝血活酶原液定義稀釋105倍為1U，稀釋104為10U，并以此類推；1.3向酶標(biāo)板中每個(gè)酶標(biāo)孔加入不同稀釋度組織凝血活酶100μL，然后加入100μl的人凝血酶原復(fù)合物溶液(1U/ml)及100μlS2222(2.0mg/ml)，37℃孵育30min,用酶標(biāo)儀(405nm)測定吸光度；1.4將我們表達(dá)純化的人重組組織因子原液進(jìn)行發(fā)色底物法實(shí)驗(yàn)測得吸光度mA405＝2786。表1發(fā)色底物發(fā)測定組織因子活性數(shù)據(jù)PCA(U)稀釋倍數(shù)lgPCAmA405(標(biāo)準(zhǔn)TF)105051983104104749103102324810210328910104131實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖2所示，不同稀釋倍數(shù)的凝血活酶和吸光度的對數(shù)成線性關(guān)系，得到凝血活酶和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)＝10.972e1.0447x；將所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式求出表達(dá)的人重組組織因子的活性PCA＝199526U，因可以看出，實(shí)施例2表達(dá)的人重組組織因子有很高的活性。以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>青島古高生物技術(shù)有限公司<120>一種人重組組織因子及其基因、表達(dá)載體、宿主菌和表達(dá)方法<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>269<212>PRT<213>Homosapiens<400>1SerGlyThrThrAsnThrValAlaAlaTyrAsnLeuThrTrpLysSer151015ThrAsnPheLysThrIleLeuGluTrpGluProLysProValAsnGln202530ValTyrThrValGlnIleSerThrLysSerGlyAspTrpLysSerLys354045CysPheTyrThrThrAspThrGluCysAspLeuThrAspGluIleVal505560LysAspValLysGlnThrTyrLeuAlaArgValPheSerTyrProAla65707580GlyAsnValGluSerThrGlySerAlaGlyGluProLeuTyrGluAsn859095SerProGluPheThrProTyrLeuGluThrAsnLeuGlyGlnProThr100105110IleGlnSerPheGluGlnValGlyThrLysValAsnValThrValGlu115120125AspGluArgThrLeuValArgArgAsnAsnThrPheLeuSerLeuArg130135140AspValPheGlyLysAspLeuIleTyrThrLeuTyrTyrTrpLysSer145150155160SerSerSerGlyLysLysThrAlaLysThrAsnThrAsnGluPheLeu165170175IleAspValAspLysGlyGluAsnTyrCysPheSerValGlnAlaVal180185190IleProSerArgThrValAsnArgLysSerThrAspSerProValGlu195200205CysMetGlyGlnGluLysGlyGluPheArgGluIlePheTyrIleIle210215220GlyAlaValValPheValValIleIleLeuValIleIleLeuAlaIle225230235240SerLeuHisLysCysArgLysAlaGlyValGlyGlnSerTrpLysGlu245250255AsnSerProLeuAsnValSerHisHisHisHisHisHis260265<210>2<211>810<212>DNA<213>Homosapiens<400>2tccggtactaccaacactgttgctgcctacaacttgacttggaagtccaccaacttcaag60accatcttggaatgggagccaaagccagttaaccaggtttacactgttcagatctccacc120aagtctggtgactggaagtctaagtgtttctacactaccgacaccgagtgtgacttgact180gacgaaatcgttaaggacgtcaagcagacctacttggccagagttttttcttaccctgcc240ggtaacgttgagtctactggttctgctggtgaaccactgtacgaaaactctccagagttc300accccatacttggagactaacttgggtcagccaactatccaatccttcgagcaggttggt360actaaggttaacgttactgtcgaggacgagagaaccctggtcagaagaaacaacaccttc420ttgtccctgagggacgttttcggtaaggacttgatctacaccctgtactactggaaatcc480agctcctccggtaaaaagactgctaagactaacaccaacgagttcttgatcgacgtggac540aagggtgagaactactgtttctccgttcaggctgttatcccatccagaaccgttaacaga600aagtccactgactccccagttgagtgtatgggtcaagaaaagggtgagttcagagagatc660ttctacatcatcggtgccgtcgttttcgtcgtcatcatcttggttattatcctggccatc720tccttgcacaagtgcagaaaagctggtgttggtcagtcctggaaagagaactctccattg780aacgtttctcatcaccatcaccaccactaa810當(dāng)前第1頁1 2 3