本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及可懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞(mdbk)懸浮培養(yǎng)后在病毒培養(yǎng)及疫苗生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛腎細(xì)胞(mdbk)傳代細(xì)胞系來自公牛腎細(xì)胞，可用于病毒培養(yǎng)、原材料檢驗(yàn)、營養(yǎng)代謝研究。mdbk通常可采用克氏瓶、轉(zhuǎn)瓶甚至反應(yīng)器載體培養(yǎng)，但實(shí)質(zhì)均未改變，細(xì)胞均為貼壁培養(yǎng)工藝，貼壁培養(yǎng)工藝培養(yǎng)批量較小、批間差異大、生產(chǎn)效率低下、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用場地多，細(xì)胞單位產(chǎn)量低，大規(guī)模生產(chǎn)工藝復(fù)雜。
牛病毒性腹瀉/粘膜、牛傳染性鼻氣管炎、偽狂犬等病毒培養(yǎng)或疫苗生產(chǎn)通常采用mdbk貼壁細(xì)胞靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方法進(jìn)行擴(kuò)增，但存在貼壁培養(yǎng)工藝放大繁瑣、培養(yǎng)批量較小、批間差異大、生產(chǎn)效率低下、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用場地多等諸多問題，細(xì)胞單位產(chǎn)量低，大規(guī)模生產(chǎn)工藝復(fù)雜。cn104162154a中提出利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗，其使用經(jīng)過馴化的mdbk細(xì)胞并未形成能夠穩(wěn)定傳代的懸浮細(xì)胞株，由于細(xì)胞懸浮馴化存在不確定因素，并不是每次都能成功復(fù)制，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在較大困難。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞。
本發(fā)明確定的能懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞mdbk，具有以下特征：1)細(xì)胞直徑：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依賴附著物條件下純懸浮培養(yǎng)；4)使用無血清或低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；或/和5)可使用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。
具體的，能懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞mdbk為能懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞株mdbk-scgmccno.11795。
本發(fā)明另一目的在于提供所述能懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞mdbk的篩選方法，是將普通貼壁mdbk細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)低血清貼壁培養(yǎng)、低血清懸浮培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)等過程，篩選獲得能夠懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株。
該篩選方法中，所述低血清貼壁培養(yǎng)是指：取長滿單層的貼壁mdbk細(xì)胞，經(jīng)0.25％(v/v)胰酶消化分散后加入含10％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)基與低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基)的混合培養(yǎng)基，且混合培養(yǎng)基中低血清培養(yǎng)基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待細(xì)胞完全適應(yīng)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)后再增加低血清培養(yǎng)基的含量，最終全部替代為低血清培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長穩(wěn)定可連續(xù)傳代；
所述低血清懸浮培養(yǎng)是指：經(jīng)低血清貼壁培養(yǎng)馴化好的貼壁mdbk細(xì)胞，經(jīng)0.25％(v/v)胰酶消化分散后加入低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基)，稀釋細(xì)胞至0.5×106細(xì)胞/ml，加入三角瓶在37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)，富集直至細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)；用低血清培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至0.5×106細(xì)胞/ml，至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)72h至細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106細(xì)胞/ml至可穩(wěn)定傳代，得到初步懸浮mdbk細(xì)胞；
所述無血清懸浮培養(yǎng)是指：取初步懸浮mdbk細(xì)胞，100rpm離心5分鐘，棄去上清，加入混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；混合培養(yǎng)基為低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基)與無血清cd培養(yǎng)基的混合物，無血清cd培養(yǎng)基含量為30％，連續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞可穩(wěn)定培養(yǎng)后增加混合培養(yǎng)基中無血清cd培養(yǎng)基的含量至50％，連續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后以無血清cd培養(yǎng)基全部替代低血清培養(yǎng)基，至細(xì)胞穩(wěn)定連續(xù)傳代；取適應(yīng)無血清cd培養(yǎng)基培養(yǎng)的懸浮mdbk細(xì)胞，將細(xì)胞液通過70μm細(xì)胞過濾器截留細(xì)胞團(tuán)塊，將濾過液100rpm離心5分鐘，棄上清，用新鮮cd培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.5×106細(xì)胞/ml，至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)，重復(fù)述步驟直至細(xì)胞結(jié)團(tuán)有所減輕，更換為40μm細(xì)胞過濾器，重復(fù)上述步驟，經(jīng)過連續(xù)處理細(xì)胞結(jié)團(tuán)逐步減輕，得到分散良好細(xì)胞為篩選獲得的能夠懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株。
本發(fā)明還一目的在于提供一種牛腎細(xì)胞mdbk的懸浮培養(yǎng)方法，是用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將所述牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后接種至反應(yīng)器中，加入所述牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)至反應(yīng)器內(nèi)的牛腎細(xì)胞mdbk密度達(dá)到1.0×106-4.0×106細(xì)胞/ml。
所述的懸浮培養(yǎng)方法中，所述牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基為含1％-5％(體積百分比v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基(低血清培養(yǎng)基)或cd培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)；優(yōu)選牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基配方為：含cd培養(yǎng)基粉末15-20g/l，碳酸氫鈉2-3g/l，ph值7.0-7.2的水溶液；優(yōu)選cd培養(yǎng)基粉末17.7g/l，使用注射用水溶解后加入碳酸氫鈉2.32g/l，調(diào)節(jié)ph值至7.0-7.2。
具體的，所述懸浮培養(yǎng)方法涉及獲得所述牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液，包括以下步驟：
(1)牛腎細(xì)胞mdbk的復(fù)蘇
從液氮中取出一支凍存的權(quán)利要求1所述牛腎細(xì)胞mdbk或權(quán)利要求2所述牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm離心5min，棄上清液，加入所述牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至三角搖瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，置于搖床中37℃、100rpm懸浮培養(yǎng)；
(2)牛腎細(xì)胞mdbk的傳代
細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后取樣計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，否則繼續(xù)培養(yǎng)，取能夠傳代的牛腎細(xì)胞mdbk，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清液(原培養(yǎng)基)，加入新的牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至三角搖瓶中，補(bǔ)加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，置于搖床中37℃、100rpm懸浮培養(yǎng)1-3代，得到牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液。
以上所述懸浮培養(yǎng)方法中，反應(yīng)器的容積為5l、50l、300l、500l、1000l、或5000l。
牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞在反應(yīng)器中可采用流加培養(yǎng)、批培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)等方式進(jìn)行懸浮培養(yǎng)：
所述流加培養(yǎng)方法為：先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后將經(jīng)稀釋的牛腎細(xì)胞種細(xì)胞懸液按反應(yīng)器容積的20％-40％加入反應(yīng)器中，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到≥0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)，開始流加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，流加速度為反應(yīng)器容積的15％-20％/天，待培養(yǎng)體積達(dá)到反應(yīng)器容積時(shí)停止；
所述批培養(yǎng)方法為：先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后將經(jīng)稀釋的牛腎細(xì)胞種細(xì)胞懸液按反應(yīng)器容積的20％-40％加入反應(yīng)器中，再加入牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基至反應(yīng)器容積，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml可停止；
所述灌注培養(yǎng)方法為：先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk種細(xì)胞懸液稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后將經(jīng)稀釋的牛腎細(xì)胞種細(xì)胞懸液加滿反應(yīng)器中，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到≥0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)，灌注牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，灌注速度為30％-50％/天，廢液經(jīng)細(xì)胞截留裝置排出，待細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml時(shí)停止。
本發(fā)明提供的所述牛腎細(xì)胞mdbk或牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795及其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在各類敏感病毒培養(yǎng)、抗體蛋白生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)、產(chǎn)品外源病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明。
本發(fā)明以上提供了能懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞mdbk及利用篩選得到的細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方法，其核心是用生物反應(yīng)器和流加培養(yǎng)、批培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)等方式對(duì)牛腎細(xì)胞(包括但不限于mdbk-scgmccno.11795)進(jìn)行大規(guī)模純懸浮培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)參數(shù)可使細(xì)胞大量繁殖，可使牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795密度最高可達(dá)4×106細(xì)胞/ml，培養(yǎng)體積可達(dá)1000l，牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795可不依賴附著物，在純懸浮狀態(tài)下快速增值、繁殖，實(shí)現(xiàn)了牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明牛腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法省去了細(xì)胞消化、換液、頻繁分種等大量人工操作，培養(yǎng)方法簡便、快速，而且采用反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了工藝自動(dòng)化，不僅提高了單位體積的細(xì)胞產(chǎn)量，還解決了傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞批間存在差異的技術(shù)難題。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。
實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明所公開的內(nèi)容不限于下述實(shí)施例。
為克服牛腎細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的不足，實(shí)現(xiàn)牛腎細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，本發(fā)明的發(fā)明人長期致力于牛腎細(xì)胞的馴化研究，終于獲得了一株可以懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞。
發(fā)明人通過對(duì)貼壁mdbk細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)篩選、克隆等多種方法，成功獲得了一株可以純懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞，并利用該細(xì)胞通過懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)mdbk細(xì)胞。本發(fā)明利用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)mdbk細(xì)胞并將其應(yīng)用于大規(guī)模病毒培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)中，該大規(guī)模培養(yǎng)可用100l、300l、1000l反應(yīng)器按比例將培養(yǎng)體積逐漸放大進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
實(shí)施例1、懸浮牛腎細(xì)胞株(懸浮mdbk細(xì)胞株)的獲得及保藏
本發(fā)明中的懸浮mdbk細(xì)胞株是將普通貼壁mdbk細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)低血清貼壁培養(yǎng)、低血清懸浮培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)等程序，篩選獲得的一株能夠懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株。
具體篩選過程如下：
1.貼壁mdbk細(xì)胞培養(yǎng)
通常貼壁mdbk細(xì)胞采用市售dmem培養(yǎng)基(購自：gibco)，添加10％(體積百分比，v/v)新生牛血清(購自：金源康生物工程有限公司)37℃靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層后，用0.25％(v/v)胰酶消化分散，按1:3至1:5的比例稀釋分種傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.低血清貼壁培養(yǎng)
取長滿單層的貼壁mdbk細(xì)胞，經(jīng)0.25％(v/v)胰酶消化分散后加入(含10％(v/v)新生牛血清)dmem與低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基，以下同)的混合培養(yǎng)基，低血清培養(yǎng)基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待細(xì)胞完全適應(yīng)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)后再增加低血清培養(yǎng)基的含量，最終全部替代為低血清培養(yǎng)基，細(xì)胞生長穩(wěn)定可連續(xù)傳代。
3.低血清懸浮培養(yǎng)
3.1.細(xì)胞懸液制備：取經(jīng)低血清培養(yǎng)馴化好的貼壁mdbk細(xì)胞，經(jīng)0.25％(v/v)胰酶消化分散后加入低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基)，稀釋細(xì)胞至0.5×106細(xì)胞/ml備用。
3.2.懸浮培養(yǎng)適應(yīng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液加入125ml三角瓶中，培養(yǎng)體積50ml，至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)。72h取樣計(jì)數(shù)，細(xì)胞結(jié)團(tuán)較多時(shí)可離心棄上清后加入等體積胰酶消化分散細(xì)胞后計(jì)數(shù)。
3.3.懸浮細(xì)胞富集：細(xì)胞培養(yǎng)初期無法生長，大量結(jié)團(tuán)，生長緩慢。將細(xì)胞懸液沉降約1分鐘，棄去沉淀團(tuán)塊，取細(xì)胞上清液100rpm離心5分鐘，取沉淀。用低血清培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀稀釋為0.5×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞少時(shí)可將多瓶細(xì)胞懸液經(jīng)上述步驟處理后混為一瓶，不足體積補(bǔ)加經(jīng)上述3.1步制備的低血清貼壁mdbk細(xì)胞懸液，補(bǔ)足至50ml。至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)72h后取樣計(jì)數(shù)，若游離細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml，則進(jìn)行懸浮細(xì)胞傳代，否則離心換液繼續(xù)進(jìn)行懸浮細(xì)胞富集工作。細(xì)胞需長期富集，直至細(xì)胞可穩(wěn)定培養(yǎng)。
3.4.懸浮細(xì)胞傳代：取懸浮細(xì)胞，100rpm離心5分鐘，棄去上清，用低血清培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至0.5×106細(xì)胞/ml，至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)72h。若該懸浮細(xì)胞生長不穩(wěn)定，72h細(xì)胞密度未能達(dá)到1.0×106細(xì)胞/ml，則重復(fù)步驟3.3和3.4，直到細(xì)胞可穩(wěn)定傳代。若該懸浮細(xì)胞可穩(wěn)定連續(xù)傳代，說明細(xì)胞已適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)方式，即初步得到了懸浮mdbk株，得到的細(xì)胞即為懸浮mdbk細(xì)胞。
4.懸浮mdbk細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)
取初步適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)的懸浮mdbk細(xì)胞，100rpm離心5分鐘，棄去上清，加入混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞?；旌吓囵B(yǎng)基為低血清培養(yǎng)基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基)與無血清cd培養(yǎng)基(gibco市售產(chǎn)品，貨號(hào)：1688240)的混合物，無血清cd培養(yǎng)基含量為30％，連續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞可穩(wěn)定培養(yǎng)后增加混合培養(yǎng)基中無血清cd培養(yǎng)基的含量至50％，連續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后最終全部替代為無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞穩(wěn)定連續(xù)傳代。
5.懸浮mdbk細(xì)胞優(yōu)化篩選
取適應(yīng)無血清cd培養(yǎng)基培養(yǎng)的懸浮mdbk細(xì)胞，將細(xì)胞液通過70μm細(xì)胞過濾器截留細(xì)胞團(tuán)塊，將濾過液100rpm離心5分鐘，棄上清，用新鮮cd培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.5×106細(xì)胞/ml，至37℃恒溫?fù)u床100-110rpm培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟直至細(xì)胞結(jié)團(tuán)有所減輕。更換為40μm細(xì)胞過濾器，重復(fù)上述步驟，經(jīng)過連續(xù)處理細(xì)胞結(jié)團(tuán)逐步減輕，分散良好。
用上述方法獲得的能夠懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株，這些能懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株均屬于本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
將其中一株命名為牛腎細(xì)胞mdbk-s，該細(xì)胞株已于2015年12月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為cgmccno.11795。
經(jīng)鑒定，以上方法獲得的能懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞的特征如下：
1)細(xì)胞直徑：14-25μm；
2)核型：2n＝60；
3)該細(xì)胞可在不依賴附著物條件下純懸浮培養(yǎng)；
4)該細(xì)胞使用無血清或低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；
5)該細(xì)胞可使用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。
實(shí)施例1獲得的能懸浮培養(yǎng)的mdbk細(xì)胞株以及保藏的牛腎細(xì)胞株mdbk-scgmccno.11795可用于牛腎細(xì)胞mdbk的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)。培養(yǎng)中可利用三角搖瓶、攪拌瓶或生物反應(yīng)器，通過流加培養(yǎng)、批培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)的方式，采用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基(低血清或無血清培養(yǎng)基)批量懸浮培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk，使最終懸浮細(xì)胞培養(yǎng)密度大于1.0×106細(xì)胞/ml，培養(yǎng)體積可達(dá)1000l以上。
所述牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基為含1％-5％(體積百分比v/v)新生牛血清的cd培養(yǎng)基(低血清培養(yǎng)基)或cd培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基配方：含cd培養(yǎng)基粉末15-20g/l，碳酸氫鈉2-3g/l，ph值7.0-7.2的水溶液。
最優(yōu)化配方：cd培養(yǎng)基(gibco市售產(chǎn)品，貨號(hào)：1688240)粉末17.7g/l，使用注射用水溶解后加入碳酸氫鈉2.32g/l，調(diào)節(jié)ph值至7.0-7.2。實(shí)施例中使用該優(yōu)化牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基配方。
以下實(shí)施例詳述牛腎細(xì)胞mdbk的懸浮培養(yǎng)/生產(chǎn)方法。
實(shí)施例2、牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795種細(xì)胞懸液的獲得
牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795種細(xì)胞懸液的獲得方法，包括以下步驟：
1)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的復(fù)蘇
從液氮中取出一支凍存的懸浮牛腎細(xì)胞株mdbk-scgmccno.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm離心5min，棄上清液，加入上述牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至三角搖瓶中，補(bǔ)加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，置于搖床中37℃、100rpm懸浮培養(yǎng)。
2)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的傳代
步驟1)細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后取樣計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，否則繼續(xù)培養(yǎng)，取能夠傳代的牛腎懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清液(原牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基)，加入新的牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至三角搖瓶中，補(bǔ)加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，置于搖床中37℃、100rpm懸浮培養(yǎng)1-3代，得到牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795種細(xì)胞懸液。
實(shí)施例3、反應(yīng)器流加培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795
牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的流加培養(yǎng)，包括以下各級(jí)以及逐級(jí)放大培養(yǎng)：
1)5l反應(yīng)器中的流加培養(yǎng)
先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的種細(xì)胞懸液(實(shí)施例2制備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后取經(jīng)稀釋的細(xì)胞懸液1000-2000ml(根據(jù)反應(yīng)器情況定)轉(zhuǎn)移至5l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度達(dá)到0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)(判斷細(xì)胞生長旺盛)，開始流加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，流加速度為1000ml/天，待培養(yǎng)體積達(dá)到5l時(shí)停止流加，取出即得到5l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
2)50l反應(yīng)器中的流加培養(yǎng)
取經(jīng)三臺(tái)5l反應(yīng)器培養(yǎng)的牛腎懸浮細(xì)胞的細(xì)胞液15l，轉(zhuǎn)入50l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，開始流加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，流加速度為8l/天，待培養(yǎng)體積達(dá)到50l時(shí)停止流加，取出即得到50l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
3)300l反應(yīng)器中的流加培養(yǎng)
取經(jīng)兩臺(tái)50l反應(yīng)器培養(yǎng)的牛腎懸浮細(xì)胞的細(xì)胞液100l，轉(zhuǎn)入300l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，開始流加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，流加速度為50l/天，待培養(yǎng)體積達(dá)到300l時(shí)停止流加，取出即得到300l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模可將其轉(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
4)1000l反應(yīng)器中的流加培養(yǎng)
取經(jīng)300l反應(yīng)器培養(yǎng)的牛腎懸浮細(xì)胞的細(xì)胞液300l，轉(zhuǎn)入1000l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，開始流加牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，流加速度為150l/天，待培養(yǎng)體積達(dá)到1000l時(shí)停止流加，取出即得到1000l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模還可將其轉(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
經(jīng)鑒定，本實(shí)施例用各容積的反應(yīng)器流加培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達(dá)1-2×106細(xì)胞/ml。生產(chǎn)規(guī)?？芍鸺?jí)擴(kuò)大，擴(kuò)大至1000l反應(yīng)器仍可獲得穩(wěn)定的mdbk懸浮細(xì)胞。
實(shí)施例4、反應(yīng)器批培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795
牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的批培養(yǎng)，包括以下各級(jí)以及逐級(jí)放大培養(yǎng)：
1)5l反應(yīng)器中的批培養(yǎng)
先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的種細(xì)胞懸液(實(shí)施例2制備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后取經(jīng)稀釋的種細(xì)胞懸液5l轉(zhuǎn)移至5l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到5l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
2)50l反應(yīng)器中的批培養(yǎng)
取經(jīng)5l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液50l轉(zhuǎn)移至50l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到50l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
3)300l反應(yīng)器中的批培養(yǎng)
取經(jīng)50l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液300l轉(zhuǎn)移至300l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到300l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
3)1000l反應(yīng)器中的批培養(yǎng)
取經(jīng)300l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液1000l轉(zhuǎn)移至1000l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到1000l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
經(jīng)鑒定，本實(shí)施例用各級(jí)反應(yīng)器批培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達(dá)1-2×106細(xì)胞/ml，生產(chǎn)規(guī)?？芍鸺?jí)擴(kuò)大，擴(kuò)大至1000l反應(yīng)器仍可獲得穩(wěn)定的mdbk懸浮細(xì)胞。
實(shí)施例5、反應(yīng)器灌注培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795
牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的灌注培養(yǎng)，包括以下各級(jí)以及逐級(jí)放大培養(yǎng)：
1)5l反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)
先用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基將牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795的種細(xì)胞懸液(實(shí)施例2制備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，然后取經(jīng)稀釋的種細(xì)胞懸液5l轉(zhuǎn)移至5l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度達(dá)到0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)時(shí)，開始灌注牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，灌注速度為1.5l/天，廢液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濾器或atf系統(tǒng)(atf細(xì)胞截留系統(tǒng)，購自refinetechnology公司)或其它細(xì)胞截留裝置排出，待細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml時(shí)可轉(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
2)50l反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)
取經(jīng)5l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液50l轉(zhuǎn)移至50l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度達(dá)到0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)，開始灌注牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，灌注速度為15l/天，廢液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濾器、atf系統(tǒng)或其它細(xì)胞截留裝置排出，待細(xì)胞密度
≥2.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到50l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)?？蓪⑵滢D(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
3)300l反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)
取經(jīng)50l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液300l轉(zhuǎn)移至300l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度達(dá)到0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)，開始灌注牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，灌注速度為150l/天，廢液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濾器、atf系統(tǒng)或其它細(xì)胞截留裝置排出，待細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到500l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模可將其轉(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
4)1000l反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)
取經(jīng)300l反應(yīng)器培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，用牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至0.3-0.5×106細(xì)胞/ml，將稀釋好的種細(xì)胞懸液1000l轉(zhuǎn)移至1000l反應(yīng)器中，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉(zhuǎn)速40-60rpm，待細(xì)胞密度達(dá)到0.8×106細(xì)胞/ml時(shí)，開始灌注牛腎細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基，灌注速度為300l/天，廢液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濾器、atf系統(tǒng)或其它細(xì)胞截留裝置排出，待細(xì)胞密度達(dá)2-4×106細(xì)胞/ml時(shí)，取出即得到1000l生產(chǎn)規(guī)模的牛腎懸浮細(xì)胞(根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模還可將其轉(zhuǎn)移至下一級(jí)反應(yīng)器中繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))。
經(jīng)鑒定，本實(shí)施例用各級(jí)反應(yīng)器灌注培養(yǎng)牛腎細(xì)胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達(dá)2-4×106細(xì)胞/ml，生產(chǎn)規(guī)模可逐級(jí)擴(kuò)大，擴(kuò)大至1000l反應(yīng)器仍可獲得穩(wěn)定的mdbk懸浮細(xì)胞。
mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞的應(yīng)用
本發(fā)明的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞可用于各類敏感病毒(例如：豬瘟病毒、偽狂犬病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、羊口瘡病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感3型病毒、邊界病病毒、口蹄疫病毒、馬腺病毒、馬流感病毒、牛慢病毒、群阿卡斑病毒、牛細(xì)小病毒等)培養(yǎng)、抗體蛋白生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)、產(chǎn)品外源病毒檢驗(yàn)等。以下實(shí)施例將做具體說明。
實(shí)施例6、偽狂犬病毒懸浮培養(yǎng)的方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中偽狂犬病病毒為bartha-k61(弱毒株)或閩a株等(來源：中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它偽狂犬病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1.種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有1％(體積比)偽狂犬病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph至7.0)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液作為種毒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml)，棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，按體積比加入1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值6.8-7.2轉(zhuǎn)速40-60rpm。
反應(yīng)器培養(yǎng)72h-96h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于30％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲病毒液至-20℃保存。收獲的弱毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收獲的強(qiáng)毒毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1.弱毒活疫苗制備
取反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的偽狂犬病毒弱毒液(接種bartha株的毒液)，按體積比1：1-2加入蔗糖牛奶保護(hù)劑(或耐熱保護(hù)劑)，經(jīng)真空冷凍干燥，制成偽狂犬弱毒活疫苗。
2.2.滅活疫苗制備
2.2.1.毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的偽狂犬病病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內(nèi)酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，滅活結(jié)束。將滅活后毒液至4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2.配苗
取經(jīng)滅活后的偽狂犬病毒液，按體積比46:54加入佐劑(如206佐劑)，充分混合后，制成偽狂犬滅活疫苗。
本例中反應(yīng)器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同容積生物反應(yīng)器，可視生產(chǎn)規(guī)模選擇。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的偽狂犬病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到108.5tcid50/ml，達(dá)到并優(yōu)于規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)104.5tcid50/0.1ml水平。利用懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)偽狂犬病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比較，如表1所示：
表1：培養(yǎng)偽狂犬病毒工藝比較
表1的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器，能達(dá)到5000l，培養(yǎng)時(shí)間72-96h，一次收獲抗原量可制備成品疫苗5000萬頭份以上。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差因而能降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本，簡化了工藝。另外，病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(tcid50)高于其他方法10倍以上，生產(chǎn)效能大大提高。可見，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。
實(shí)施例7、羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒培養(yǎng)方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(orfvirus)，又名羊接觸傳染性臁瘡病毒，羊口瘡病毒，羊接觸傳染性膿皰性口炎病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1.種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有1-2％(體積比)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到85％以上時(shí)，收獲病毒液，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml)，采用自然沉降或離心方式棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％新生牛血清的低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，按體積比加入1-2％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.4±0.1、轉(zhuǎn)速40-60rpm。
反應(yīng)器培養(yǎng)48h-72h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于15％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲病毒液至-20℃保存。收獲的弱毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收獲的強(qiáng)毒毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1.滅活疫苗制備
2.1.1.毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，加入0.025％的β-丙內(nèi)酯(或二乙烯亞胺、甲醛)2-8℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，滅活結(jié)束后將毒液至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2.配苗
取經(jīng)滅活后的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合后，制成羊接觸傳染性膿皰性皮炎滅活疫苗。
2.2.弱毒活疫苗制備
取反應(yīng)器培養(yǎng)的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(自然或人工至弱毒株)弱毒液，按比例1：1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護(hù)劑(或耐熱凍干保護(hù)劑)，經(jīng)真空冷凍干燥，制成羊接觸傳染性膿皰性皮炎病活疫苗。
本例中反應(yīng)器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應(yīng)器，可視生產(chǎn)規(guī)模選擇。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》經(jīng)細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到108.5tcid50/ml，毒價(jià)與貼壁培養(yǎng)持平。利用懸浮培養(yǎng)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比較，如表2所示：
表2：培養(yǎng)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒工藝比較
表2的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器(能達(dá)到5000l)，培養(yǎng)時(shí)間48h-72h，一次收獲抗原量可制備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本簡化了工藝?？梢?，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。
實(shí)施例8、牛病毒性腹瀉/粘膜病毒懸浮培養(yǎng)的方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中牛病毒性腹瀉/粘膜病毒為nadl株或oregonc24v株等，(來源：中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它牛病毒性腹瀉/粘膜病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1.種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有10％(體積比)牛病毒性腹瀉/粘膜病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞,細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，制備毒液時(shí)按體積比加入0.1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株，根據(jù)毒株的不同加入量可增加至1-10％)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉(zhuǎn)速40-60rpm。
生物反應(yīng)器培養(yǎng)72h-96h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于30％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲弱毒液或病毒液至-20℃保存。收獲的弱毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收獲的強(qiáng)毒毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1.弱毒活疫苗制備
取反應(yīng)器培養(yǎng)的牛病毒性腹瀉/粘膜病弱毒液，按1：1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護(hù)劑(或耐熱保護(hù)劑)，經(jīng)真空冷凍干燥，制成牛病毒性腹瀉/粘膜病弱毒活疫苗。
2.2.滅活疫苗制備
2.2.1.毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的牛病毒性腹瀉/粘膜病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，加入0.025％的滅活劑β-丙內(nèi)酯(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，將滅活后毒液至4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2.配苗
取經(jīng)滅活后的牛病毒性腹瀉/粘膜病毒液與206佐劑(seppic)按46:54(體積比)的比例充分混合，制成牛病毒性腹瀉/粘膜病滅活疫苗。
本例中反應(yīng)器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應(yīng)器，可視生產(chǎn)規(guī)模選擇。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》經(jīng)細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的牛病毒性腹瀉/粘膜病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到107.5tcid50/ml，毒價(jià)略高于貼壁培養(yǎng)。利用懸浮培養(yǎng)牛病毒性腹瀉/粘膜病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)牛病毒性腹瀉/粘膜病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比較，如表3所示：
表3：牛病毒性腹瀉/粘膜病毒工藝比較
表3的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)牛病毒性腹瀉/粘膜病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器(能達(dá)到5000l)，培養(yǎng)時(shí)間72h-96h，一次收獲抗原量可制備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本簡化了工藝。較cn104162154a懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗，其使用貼壁馴化的mdbk細(xì)胞并未形成能夠穩(wěn)定傳代的懸浮細(xì)胞株，由于細(xì)胞懸浮馴化耗時(shí)較長，細(xì)胞病毒敏感性存在差異，不確定因素多，并不是每次都能成功復(fù)制，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在較大困難。本發(fā)明是利用可穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞(mdbk-scgmccno.11795)，細(xì)胞從液氮中復(fù)蘇后直接懸浮培養(yǎng)，省去了細(xì)胞重復(fù)馴化工作，凍存形成的細(xì)胞批對(duì)病毒敏感性穩(wěn)定，工藝可靠性強(qiáng)，應(yīng)用更為方便可靠?？梢?，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。
實(shí)施例9、牛傳染性鼻氣管炎病毒懸浮培養(yǎng)的方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中牛傳染性鼻氣管炎病毒(來源：中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它牛傳染性鼻氣管炎病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1.種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有10％(體積比)牛傳染性鼻氣管炎病毒的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml)，棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，按體積比加入0.1-1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉(zhuǎn)速40-60rpm。
生物反應(yīng)器培養(yǎng)48h-72h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于20％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲病毒液至-20℃保存。收獲的毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1.滅活疫苗制備
2.1.1.毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的牛傳染性鼻氣管炎病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，加入0.025％(體積比)的β-丙內(nèi)酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，滅活結(jié)束后將滅活后毒液至4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2.配苗
取經(jīng)滅活后的牛傳染性鼻氣管炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合后，制成牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活疫苗。
本例中反應(yīng)器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應(yīng)器，可視生產(chǎn)規(guī)模選擇。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》經(jīng)細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的牛傳染性鼻氣管炎病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到108.5tcid50/ml，毒價(jià)高于貼壁培養(yǎng)。利用懸浮培養(yǎng)牛傳染性鼻氣管炎病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)牛傳染性鼻氣管炎病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比較，如表4所示：
表4：牛傳染性鼻氣管炎病毒工藝比較
表4的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)牛傳染性鼻氣管炎病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器(能達(dá)到5000l)，培養(yǎng)時(shí)間48h-72h，一次收獲抗原量可制備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本簡化了工藝。較cn104162154a懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗，其使用貼壁馴化的mdbk細(xì)胞并未形成能夠穩(wěn)定傳代的懸浮細(xì)胞株，由于細(xì)胞懸浮馴化耗時(shí)較長，細(xì)胞病毒敏感性存在差異，不確定因素多，并不是每次都能成功復(fù)制，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在較大困難。本發(fā)明是利用可穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)的牛腎細(xì)胞(mdbk-scgmccno.11795)，細(xì)胞從液氮中復(fù)蘇后直接懸浮培養(yǎng)，省去了細(xì)胞重復(fù)馴化工作，凍存形成的細(xì)胞批對(duì)病毒敏感性穩(wěn)定，工藝可靠性強(qiáng)，應(yīng)用更為方便可靠。可見，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。
實(shí)施例10、牛呼吸道合胞體病毒懸浮培養(yǎng)的方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中牛呼吸道合胞體病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它牛呼吸道合胞體病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1.種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有10％(體積比)牛呼吸道合胞體病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度≥2.0×106細(xì)胞/ml)，棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，按體積比加入1-5％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強(qiáng)毒株)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉(zhuǎn)速40-60rpm。
生物反應(yīng)器培養(yǎng)56h-72h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于15％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲病毒液至-20℃保存。收獲的弱毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收獲的強(qiáng)毒毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1.弱毒活疫苗制備
取反應(yīng)器培養(yǎng)的牛呼吸道合胞體病弱毒液，按1:1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護(hù)劑(或耐熱保護(hù)劑)，經(jīng)真空冷凍干燥，制成偽狂犬弱毒活疫苗。
2.2.滅活疫苗制備
2.2.1.毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的牛呼吸道合胞體病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內(nèi)酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，將滅活后毒液至4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2.配苗
取經(jīng)滅活后的牛呼吸道合胞體病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合后，制成牛呼吸道合胞體病毒滅活疫苗。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》經(jīng)細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的牛呼吸道合胞體病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到107.0tcid50/ml，毒價(jià)與貼壁培養(yǎng)持平。利用懸浮培養(yǎng)牛呼吸道合胞體病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)牛呼吸道合胞體病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比
較，如表5所示：
表5：牛呼吸道合胞體病毒工藝比較
表5的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)牛呼吸道合胞體病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器(能達(dá)到5000l)，培養(yǎng)時(shí)間56h-72h，一次收獲抗原量大。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本簡化了工藝。可見，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。
實(shí)施例11、牛副流感3型病毒懸浮培養(yǎng)的方法及疫苗制備
1.病毒培養(yǎng)
本實(shí)施例中牛副流感3型病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它牛副流感3型病毒毒株，本發(fā)明不做限制。
1.1種毒培養(yǎng)與制備
取生長良好的mdbk貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后棄去原培養(yǎng)液，更換含有10％(體積比)牛副流感3型病毒的維持液(維持液配方：市售dmem培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞cpe達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2懸浮毒液制備
取經(jīng)反應(yīng)器培養(yǎng)的mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度≥1.0×106細(xì)胞/ml)，棄去原培養(yǎng)液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養(yǎng)基)恢復(fù)至原體積，按體積比加入0.1-1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒)，設(shè)定病毒培養(yǎng)條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉(zhuǎn)速40-60rpm。
生物反應(yīng)器培養(yǎng)48h-72h，培養(yǎng)過程定期取樣計(jì)數(shù)觀察，待細(xì)胞活力低于20％時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲病毒液至-20℃保存。收獲的毒液可用作下一級(jí)培養(yǎng)懸浮種毒或生產(chǎn)疫苗抗原或疫苗效力檢驗(yàn)攻毒使用。
2.疫苗制備
2.1滅活疫苗制備
2.2.1毒液滅活
取懸浮培養(yǎng)的牛副流感3型病毒液，經(jīng)離心或過濾去除細(xì)胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內(nèi)酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時(shí)，升溫至37℃保持2小時(shí)，將滅活后毒液至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2配苗
取經(jīng)滅活后的牛副流感3型病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合后，制成牛副流感3型病毒滅活疫苗。
3.懸浮毒液和疫苗檢測
按《中華人民共和國獸藥典》經(jīng)細(xì)胞半數(shù)感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的牛副流感3型病毒半數(shù)細(xì)胞感染量可達(dá)到108.5tcid50/ml，毒價(jià)與貼壁培養(yǎng)持平。利用懸浮培養(yǎng)牛副流感3型病毒毒液制備的疫苗均達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》要求。
4.方法比較
將本發(fā)明培養(yǎng)牛副流感3型病毒工藝與常規(guī)貼壁培養(yǎng)和載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行比較，如表5所示：
表6：牛副流感3型病毒工藝比較
表6的比較內(nèi)容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細(xì)胞培養(yǎng)牛副流感3型病毒，可以使用大容積生物反應(yīng)器(能達(dá)到5000l)，培養(yǎng)時(shí)間48h-72h，一次收獲抗原量可制備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)能夠節(jié)省大量勞動(dòng)力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養(yǎng)不需要微載體投入，也不需要消化放大，節(jié)約了成本簡化了工藝?？梢姡景l(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可利用反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，可大大提高生產(chǎn)效率。